In der Plastischen Chirurgie erfordert die Rekonstruktion von ästhetisch anspruchsvollen Bereichen in vielen Fällen die Wiederherstellung von subkutanem Fettgewebe. Neben chirurgischen Rekonstruktionen könnte das Tissue Engineering von Fettgewebe einen wertvollen Beitrag leisten. Jedoch bringt es vielschichtige Herausforderungen mit sich und ist zum aktuellen Zeitpunkt nur limitiert möglich. Ein Ansatz ist die Schaffung einer Trägermatrix zur Besiedelung und Differenzierung von Stammzellen. Auf dieser Basis sollten in der vorliegenden Arbeit zwei Teilbereiche untersucht werden. In dem ersten Teilbereich erfolgten Untersuchungen verschiedener Gewinnungsmethoden von ASCs aus dem subkutanen Fettgewebe bezogen auf ihr Effizienz. Die untersuchten Liposuktionstechniken zeigten eine deutlich höhere Effizienz gegenüber der mechanischen Gewinnungsmethode bezogen auf die gewonnene Zellzahl. In den Viabilitätsuntersuchungen zeigte sich eine ähnliche Tendenz. ASCs aller drei Gewinnungsmethoden proliferierten durchaus gleich gut, jedoch zeigten die histologischen und quantitativen Adipogeneseuntersuchungen tendenziell mehr Lipidbildung bei den Liposuktionstechniken. Das übergeordnete Ziel des zweiten Abschnittes dieser Arbeit war es eine Trägermatrix auf Hyaluronsäure-Basis mit dem vielseitig modifizierbarem Crosslinker Polyglycidol zu untersuchen, sie mit mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe zu besiedeln und diese adipogen zu differenzieren. Des Weiteren erfolgten erste Versuche die Hydrogele mit funktionellen Gruppen zu modifizieren um eine Verbesserung der Adhäsion der Zellen im Hydrogel zu erreichen. Die unmodifizierten Hydrogele waren zu jeder Zeit stabil in ihrer Form und zeigten nach Besiedelung mit ASCs eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Gel. Auch ließ sich die Adipogenese histologisch visualisieren und biochemisch bestätigen. Die inkorporierten Peptide brachten eine peptidabhängige und konzentrationsabhängige Veränderung der Zellverteilung im Hydrogel. Eine Steigerung der Funktionalität der Zellen bezogen auf das Überleben und die Adipogenese konnte in diesen ersten Versuchen noch nicht gezeigt werden. Generell zeigt sich eine Eignung der hyaluronsäurebasierten mit Polyglycidol-verlinkten Hydrogele für das Tissue Engineering von Fettgewebe. Weitere Untersuchungen bezüglich der Modifikation der Hydrogele mit adhäsiven und adipogenen funktionellen Gruppen bietet sich daher an und könnte ein fettgewebsähnliches Umgebungsmilieu hervorbringen.

The ability to differentiate into mesenchymal lineages, as well as immunomodulatory, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and angiogenic properties give ASCs great therapeutic potential. Through their culture as multicellular, three-dimensional spheroids this potential can even be enhanced. Accordingly, 3D spheroids are not only promising candidates for the application in regenerative medicine and inflammatory disease therapy, but also for the use as building blocks in tissue engineering approaches. Due to the resemblance to physiological cell-cell and cell-matrix interactions, 3D spheroids gain higher similarity to real tissues, what makes them a valuable tool in the development of bioactive constructs equivalent to native tissues in terms of its cellular and extracellular structure. Especially, to overcome the still tremendous clinical need for adequate implants to repair soft tissue defects, 3D spheroids consisting of ASCs are a promising approach in adipose tissue engineering. Nevertheless, studies on the use of ASC-based spheroids as building blocks for fat tissue reconstruction have so far been very rare. In order to optimally exploit their therapeutic potential to further their use in regenerative medicine, including adipose tissue engineering approaches, a 3D spheroid model consisting of ASCs was characterized extensively in this work. This included not only the elucidation of the structural features, but also the differentiation capacity, gene expression, and secretory properties. In addition, the elucidation of underlying mechanisms contributing to the improved therapeutic efficiency was addressed.

Improved treatment options for the degenerative joint disease osteoarthritis (OA) are of major interest, since OA is one of the main sources of disability, pain, and socioeconomic burden worldwide [202]. According to epidemiological data, already 27 million people suffer from OA in the US [23]. Moreover, the WHO expects OA to be the fourth most common cause of disability in 2020 [203], illustrating the need for effective and long-lasting therapy options of severe cartilage defects. Despite numerous clinically available products for the treatment of cartilage defects [62], the development of more cartilage-specific materials is still at the beginning. Hyaluronic acid (HA) is a major component of the cartilaginous extracellular matrix (ECM) and inherently creates a cell-friendly niche by providing cell attachment and migration sites. Furthermore, it is known that the functional groups of HA are well suited for chemical modification. These characteristics render HA an attractive material for hydrogel-based tissue engineering approaches. Poly(glycidol) (PG) as chemical crosslinker basically features similar chemical characteristics as the widely used poly(ethylene glycol) (PEG), but provides additional side groups at each repeating unit that can be further chemically functionalized. With the introduction of PG as multifunctional crosslinker for HA gels, a higher cross-linking density and, accordingly, a greater potential for biomimetic functionalization may be achieved. However, despite the mentioned potential benefits, PG has not been used for cartilage regeneration approaches so far. The initial aim of the study was to set up and optimize a HA-based hydrogel for the chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs), using different amounts and variations of cross-linkers. Therefore, the hydrogel composition was optimized by the utilization of different PEG diacrylate (PEGDA) concentrations to cross-link thiol-modified HA (Glycosil, HA-SH) via Michael addition. We aimed to generate volumestable scaffolds that simultaneously enable a maximum of ECM deposition. Histological and biochemical analysis showed 0.4% PEGDA as the most suitable concentration for these requirements (Section 5.1.2). In order to evaluate the impact of a differently designed cross-linker on MSC chondrogenesis, HA-SH was cross-linked with PEGTA (0.6%) and compared to PEGDA (0.4%) in a next step. Following this, acrylated PG (PG-Acr) as multifunctional cross-linker alternative to acrylated PEG was evaluated. It provides around five times more functional groups when utilized in PG-Acr (0.6%) HA-SH hydrogels compared to PEGTA (0.6%) HA-SH hydrogels, thus enabling higher degrees of biomimetic functionalization. Determination of cartilage-specific ECM components showed no substantial differences between both cross-linkers while the deposition of cartilaginous matrix appeared more homogeneous in HA-SH PG-Acr gels. Taken together, we were able to successfully increase the possibilities for biomimetic functionalization in the developed HA-SH hydrogel system by the introduction of PG-Acr as cross-linker without negatively affecting MSC chondrogenesis (Section 5.1.3). The next part of this thesis focused extensively on the biomimetic functionalization of PG-Acr (0.6%) cross-linked HA-SH hydrogels. Here, either biomimetic peptides or a chondrogenic growth factor were covalently bound into the hydrogels. Interestingly, the incorporation of a N-cadherin mimetic (HAV), a collagen type II binding (KLER), or a cell adhesion-mediating peptide (RGD) yielded no improvement of MSC chondrogenesis. For instance, the covalent binding of 2.5mM HAV changed morphology of cell nuclei and reduced GAG production while the incorporation of 1.0mM RGD impaired collagen production. These findings may be attributed to the already supportive conditions of the employed HA-based hydrogels for chondrogenic differentiation. Most of the previous studies reporting positive peptide effects on chondrogenesis have been carried out in less supportive PEG hydrogels or in significantly stiffer MeHA-based hydrogels [99, 101, 160]. Thus, the incorporation of peptides may be more important under unfavorable conditions while inert gel systems may be useful for studying single peptide effects (Section 5.2.1). The chondrogenic factor transforming growth factor beta 1 (TGF-b1) served as an example for growth factor binding to PG-Acr. The utilization of covalently bound TGF-b1 may thereby help overcome the need for repeated administration of TGF-b1 in in vivo applications, which may be an advantage for potential clinical application. Thus, the effect of covalently incorporated TGF-b1 was compared to the effect of the same amount of TGF-b1 without covalent binding (100nM TGF-b1) on MSC chondrogenesis. It was successfully demonstrated that covalent incorporation of TGF-b1 had a significant positive effect in a dose-dependent manner. Chondrogenesis of MSCs in hydrogels with covalently bound TGF-b1 showed enhanced levels of chondrogenesis compared to hydrogels into which TGF-b1 was merely mixed, as shown by stronger staining for GAGs, total collagen, aggrecan and collagen type II. Biochemical evaluation of GAG and collagen amounts, as well as Western blot analysis confirmed the histological results. Furthermore, the positive effect of covalently bound TGF-b1 was shown by increased expression of chondrogenic marker genes COL2A1, ACAN and SOX9. In summary, covalent growth factor incorporation utilizing PG-Acr as cross-linker demonstrated significant positive effects on chondrogenic differentiation of MSCs (Section 5.2.2). In general, PG-Acr cross-linked HA hydrogels generated by Michael addition represent a versatile hydrogel platform due to their high degree of acrylate functionality. These hydrogels may further offer the opportunity to combine several biological modifications, such as the incorporation of biomimetic peptides together with growth factors, within one cell carrier. A proof-of-principle experiment demonstrated the suitability of pure PG gels for studying single peptide effects. Here, the hydrogels were generated by the utilization of thiol-ene-click reaction. In this setting, without the supportive background of hyaluronic acid, MSCs showed enhanced chondrogenic differentiation in response to the incorporation of 1.0mM HAV. This was demonstrated by staining for GAGs, the cartilage-specific ECM molecules aggrecan and type II collagen, and by increased GAG and total collagen amounts shown by biochemical analysis. Thus, pure PG gels exhibit the potential to study the effects and interplay of peptides and growth factors in a highly modifiable, bioinert hydrogel environment. The last section of the thesis was carried out as part of the EU project HydroZONES that aims to develop and generate zonal constructs. The importance of zonal organization has attracted increased attention in the last years [127, 128], however, it is still underrepresented in tissue engineering approaches so far. Thus, the feasibility of zonal distribution of cells in a scaffold combining two differently composed hydrogels was investigated. A HA-SH(FMZ) containing bottom layer was generated and a pure PG top layer was subsequently cast on top of it, utilizing both times thiol-ene-click reaction. Indeed, stable, hierarchical constructs were generated that allowed encapsulated MSCs to differentiate chondrogenically in both zones as shown by staining for GAGs and collagen type II, and by quantification of GAG amount. Thus, the feasibility of differently composed zonal hydrogels utilizing PG as a main component was successfully demonstrated (Section 5.4). With the first-time utilization and evaluation of PG-Acr as versatile multifunctional cross-linker for the preparation of Michael addition-generated HA-SH hydrogels in the context of cartilage tissue engineering, a highly modifiable HA-based hydrogel system was introduced. It may be used in future studies as an easily applicable and versatile toolbox for the generation of biomimetically functionalized hydrogels for cell-based cartilage regeneration. The introduction of reinforcement structures to enhance mechanical resistance may thereby further increase the potential of this system for clinical applications. Additionally, it was also demonstrated that thiol-ene clickable hydrogels can be used for the generation of cell-laden, pure PG gels or for the generation of more complex, coherent zonal constructs. Furthermore, thiol-ene clickable PG hydrogels have already been further modified and successfully been used in 3D bioprinting experiments [204]. 3D bioprinting, as part of the evolving biofabrication field [205], offers the possibilities to generate complex and hierarchical structures, and to exactly position defined layers, yet at the same time alters the requirements for the utilized hydrogels [159, 206–209]. Since a robust chondrogenesis of MSCs was demonstrated in the thiol-ene clickable hydrogel systems, they may serve as a basis for the development of hydrogels as so called bioinks which may be utilized in more sophisticated biofabrication processes.

In der regenerativen Medizin gewinnt die Herstellung eines funktionsfähigen und biokompatiblen Gewebeersatzes durch Techniken des Tissue Engineerings zunehmende Bedeutung. Eine Grundlage dieser Technologie bilden körpereigene Zellen, die sich in vitro kultivieren und in verschiedene Gewebetypen differenzieren lassen, sogenannte adulte mesenchymale Stammzellen. Diese können u.a. aus Fettgewebe leicht und in größerer Anzahl isoliert und kultiviert werden (adipose-derived stem cells, ASC). In Anwesenheit Zelllinien-spezifischer Induktoren lassen sich diese Zellen zu Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten differenzieren und für die Herstellung entsprechender Gewebekonstrukte nutzen. Eine erfolgreiche Differenzierung dieser Stammzellen zu Endothelzellen könnte in den durch Tissue Engineering generierten Gewebekonstrukten die Ausbildung eines funktionsfähigen Blutgefäßsystems in vivo beschleunigen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die endotheliale Differenzierung von ASC unter Zusatz angiogener Wachstumsfaktoren sowie hypoxischer Behandlung der Zellen zu untersuchen und im Hinblick auf eine Anwendung im Tissue Engineering zu optimieren. Dabei sollte gleichzeitig untersucht werden, ob unter diesen Bedingungen die Differenzierung der ASC in eine andere Zelllinie (Adipozyten) möglich ist. Die Untersuchungen wurden mit Stammzellen durchgeführt, welche mittels Liposuktion aus subkutanem Fettgewebe gewonnen wurden. Diese Zellen wurden zunächst vergleichend in endothelzellspezifischem Medium mit angiogenen Faktoren (VEGF, bFGF) bzw. unter hypoxischen Bedingungen (3% Sauerstoff) kultiviert und die Differenzierung zu Endothelzellen anhand verschiedener endothelzellspezifischer Marker nachgewiesen. Zunächst wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung die Expression des endothelialen Oberflächenantigens CD31 untersucht. Eine Quantifizierung der CD31-positiven Zellpopulation erfolgte im Anschluss durch Auszählung mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops. Die endotheliale Differenzierung der ASC konnte bereits nach Zugabe der einzelnen Wachstumsfaktoren nachgewiesen werden. Der kombinierte Einsatz der beiden Faktoren führte zu einem Anstieg CD31-positiver Zellen. Des Weiteren ließ sich eine stärkere induktive Wirkung für bFGF im Vergleich zu VEGF demonstrieren. Durch Kultivierung der Zellen unter hyoxischen Bedingungen konnte ebenfalls eine endotheliale Differenzierung erzielt werden. Diese entsprach im Umfang etwa dem Ausmaß an differenzierten Zellen unter Wachstumsfaktoreneinfluss in Normoxie. Als aussichtsreichste Kultivierungsstrategie für die endotheliale Differenzierung der ASC stellte sich jedoch die Kultivierung der Zellen unter Einsatz der Wachstumsfaktorenkombination (bFGF und VEGF) in Hypoxie dar. Hier konnte zum einen eine Abhängigkeit von der Konzentration der eingesetzten Faktoren demonstriert werden und zum andern ein Synergismus zwischen Hypoxie und kombiniertem Wachstumsfaktoreneinsatz festgestellt werden. Denn die Anzahl an CD31-positiven Zellen in der Gruppe mit den hochkonzentriert zugesetzten Wachstumsfaktoren entsprach nicht einfach der Addition der Zellzahl unter Einzelbedingungen, sondern lag deutlich höher. Insgesamt ist das Ausmaß der endothelial differenzierten ASC im Vergleich zur Ausgangspopulation allerdings als gering zu beurteilen, denn nur 0,5 - 1,1% der eingesetzten ASC zeigten endotheliale Marker. Zur weiteren Charakterisierung der endothelial differenzierten ASC wurden die endothelzellspezifische Aufnahme von DilacLDL, ein mit dem Farbstoff Dil markiertes Lipoprotein, und die tube formation auf Matrigel untersucht. Hier konnte bei einigen Zellen die Inkorporation von DilacLDL nachgewiesen werden. Beim Matrigel-Assay zeigten sich allerdings deutliche morphologische Unterschiede im Vergleich zu naiven Endothelzellen. Eine Immunfluoreszenzfärbung gegen den von Willebrand Faktor fiel negativ aus. Um den positiven Einfluss der hypoxischen Kulturbedingungen weiter zu ermitteln, wurde der Effekt der Hypoxie auf die Sekretion angiogener Wachstumsfaktoren am Beispiel von VEGF mittels enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) untersucht. Es zeigte sich ein deutlicher Anstieg der endogenen VEGF-Sekretion unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zur Normoxie. Die Steigerung der endogenen Wachstumsfaktorsekretion hat möglicherweise einen Anteil am Mechanismus des Hypoxieeffektes. Hier sollten weitere Untersuchungen, allen voran zur bFGF-Sekretion angeschlossen werden. Neben der endothelialen Differenzierung der ASC wurde überprüft, ob unter den oben genannten Bedingungen eine adäquate Adipogenese stattfindet. Das wurde durch quantitative Messung des Triglyceridgehalts sowie Untersuchung der Expression adipogener Marker wie CEBPα, PPARγ, FABP und GLUT 4 erfasst. Hier konnte gezeigt werden, dass die Adipogenese der Stammzellen unter den beschriebenen Bedingungen unbeeinträchtigt bleibt und somit eine Anwendung im TE von Fettgewebe möglich macht. Mit der endothelialen Differenzierung unter unterschiedlichen Bedingungen zeigen die Ergebnisse der Arbeit eine Facette des Potentials der ASC. Ob die endothelial differenzierten ASC tatsächlich zu einer Verbesserung der Vaskularisierung von TE-Konstrukten führen, sollte in einer weiterführenden In-vivo-Studie evaluiert werden.

Articular cartilage lesions that occur upon intensive sport, trauma or degenerative disease represent a severe therapeutic problem. At present, osteoarthritis is the most common joint disease worldwide, affecting around 10% of men and 18% of women over 60 years of age (302). The poor self-regeneration capacity of cartilage and the lack of efficient therapeutic treatment options to regenerate durable articular cartilage tissue, provide the rationale for the development of new treatment options based on cartilage tissue engineering approaches (281). The integrated use of cells, biomaterials and growth factors to guide tissue development has the potential to provide functional substitutes of lost or damaged tissues (2,3). For the regeneration of cartilage, the availability of mesenchymal stromal cells (MSCs) or their recruitment into the defect site is fundamental (281). Due to their high proliferation capacity, the possibility to differentiate into chondrocytes and their potential to attract other progenitor cells into the defect site, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMSCs) are still regarded as an attractive cell source for cartilage tissue engineering (80). However, in order to successfully engineer cartilage tissue, a better understanding of basic principles of developmental processes and microenvironmental cues that guide chondrogenesis is required.