Graduate School of Life Sciences
Refine
Is part of the Bibliography
- yes (1058)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (1048)
- Journal article (9)
- Book (1)
Language
- English (824)
- German (233)
- Multiple languages (1)
Keywords
- Maus (38)
- Thrombozyt (34)
- T-Lymphozyt (30)
- Tissue Engineering (30)
- Taufliege (21)
- Dendritische Zelle (20)
- Genexpression (18)
- Myc (17)
- Angst (16)
- Entzündung (16)
Institute
- Graduate School of Life Sciences (1058)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (104)
- Rudolf-Virchow-Zentrum (71)
- Medizinische Fakultät (44)
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (39)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (36)
- Institut für Psychologie (35)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (33)
- Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie (29)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (26)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI) (9)
- Universitätsklinikum Münster (3)
- Rudolf Virchow Center for Integrative and Translational Bioimaging, University of Würzburg (2)
- Zentrum für Infektionsforschung (ZINF) Würzburg (2)
- Bio-Imaging Center Würzburg (1)
- Biomedical Center Munich, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München (1)
- CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - the development agency of the Brazilian Federal Government (1)
- CBIO, University of Cape Town, South Africa (1)
- Carl-Ludwig-Institut für Physiologie, Universität Leipzig (1)
- Center for Experimental Molecular Medicine (ZEMM) (1)
Multiple Myeloma remains an incurable disease of clonally expanding malignant plasma cells. The bone marrow microenvironment harbors treatment resistant myeloma cells, which eventually lead to a disease relapse in patients. CD4+FoxP3+ regulatory T cells (Tregs) are highly abundant amongst CD4+ T cells in the bone marrow providing an immune protective niche for different long-living cell populations, e.g. hematopoietic stem cells. Previous studies in multiple myeloma patients have mostly focused on peripheral blood analyses without factoring in the specialized bone marrow environment or employed therapy regimens. Even though, functional Treg-myeloma cell analyses are lacking, recent literature suggests that in multiple myeloma Tregs enrich in the bone marrow. In this study, we addressed the functional role of Tregs in the engraftment and progression of multiple myeloma. We further elucidated the Treg-mediated immune-suppression that induces immune escape of multiple myeloma. To investigate
the immune regulation of multiple myeloma, we utilized a syngeneic immunocompetent murine multiple myeloma model (MOPC-315.Luc-GFP.BMP2 in BALB/c mice), that allows non-invasive in vivo bioluminescence imaging of disease progression in combination with fluorescence microscopy techniques and multi-parameter flow cytometry. DEREG mice provided a system to selectively deplete Tregs upon diphtheria toxin administration
at different time points of multiple myeloma progression. We further confirmed our major findings with a second syngeneic and immunocompetent murine model of multiple myeloma, the transplantable VK*MYC model (VK12653 in C57BL/6). Firstly, we found that Tregs accumulate in vicinity of multiple myeloma cells within the bone marrow and display a highly activated phenotype. Tregs upregulated activation marker such as CD44, CD69 and ICAM-1 as well as several checkpoint receptors such as PD-1 and LAG-3. Secondly, using DEREG mice to deplete Tregs in a time restricted manner before tumor cell injection, we found that Tregs create a suppressive environment that enables tumor engraftment and dissemination. Additional, in this myeloma model, we found that Tregs retain an immune response that has the potential to effectively eliminate multiple myeloma. Remarkably, even a short-term depletion of Tregs in mice with established tumor resulted in complete regression of multiple myeloma below the detection limit. Longitudinal follow-up monitoring with sensitive bioluminescence
imaging revealed that 69% (9/13) of mice remained entirely tumor free for an observation period of 80 days. Thirdly, using depleting antibodies in vivo we identified CD8 T cells and NK cells as major effector cells against multiple myeloma when unleashed from Treg suppression. Conclusively, with this preclinical in vivo study we show that Tregs are an attractive therapeutic target for the treatment of patients suffering from multiple myeloma.
Six different magnesium-containing mineral bone cement formulations (based on struvite, K-struvite, dittmarite, newberyite, magnesium oxychloride or an amorphous magnesium phosphate cement) were developed in the present thesis with the aim to improve material degradability, particularly in comparison to clinically established hydroxyapatite (HA) cements. Ideally, a rapid degradation supports simultaneous new bone formation and enables a full replacement of the implanted material by newly formed bone within several months.
All compositions were characterized and optimized in vitro regarding handling, mechanical stability, and phase composition. Additionally, porosity and passive degradation was investigated. Four formulations (struvite, K-struvite, newberyite, magnesium oxychloride) exhibited a higher in vitro weight loss (1%, 8%, 1%, 37%) and cumulative ion release after 18 days in phosphate buffered saline (Mg: 10 µmol, 7 µmol, 12 µmol, 67 µmol) compared to the HA control cement (-0.4%, Ca: 0.5 µmol), indicating a higher passive solubility. HA is mainly resorbed by osteoclasts in vivo, which limits the resorption to the cement surface and results in a very slow degradation in vivo. Only for the amorphous magnesium phosphate cement, which is based on trimagnesium phosphate and sodium hydrogen phosphate, no weight loss during storage in PBS and a similarly low ion release compared to HA was observed. The in vitro degradation of the prefabricated dittmarite cement was not investigated, because it is expected to be similar to struvite-forming cements, due to the chemical resemblance of the two minerals. The most promising cement compositions (struvite, K-struvite, newberyite and dittmarite) were implanted in an established ovine bone defect model by our cooperation partners and degradation and new bone formation were quantified histomorphometrically. The cement area reduction 4 months after implantation was for all compositions (25%, 63%, 18%, 37%) noticeably higher compared to the HA reference cement (<5%), which had been already implanted in the very same defect model in a predecessor study. Furthermore, all compositions demonstrated a high biocompatibility and the degraded material was replaced by new bone.
The prefabricated dittmarite cement, which allows the storage of the viscous paste and a direct application during surgery, proved to be the most promising cement composition, with an observed in vivo cement area reduction of 37% at 4 months after implantation (control HA: <5%). By using a trimodal particle size distribution, including diammonium hydrogen phosphate and trimagnesium phosphate with two different particle sizes, the injection force was reduced from 72 to 25 N. The high porosity of the set cement (52%) likely promoted the rapid degradation, but also decreased the compressive strength to 9-14 MPa. By contrast, the non-prefabricated struvite cement, exhibiting 12% porosity, reached a compressive strength of 36 MPa. For future clinical use, the storage stability would be important to address, because an increase of injection force from 25 N to 113 N was observed after a storage time of 4 weeks, caused by a strong viscosity increase.
Apart from bone cement formulations, granules are a commonly used application form of bone replacement materials, particularly in maxillofacial surgery. Here, three different magnesium-mineral based granules (struvite, K-struvite, farringtonite) were fabricated with an emulsion process and compared to the clinically established material ß-TCP. For farringtonite and ß-TCP, new process routes for the granule fabrication were developed. Thereby, farringtonite and ß-TCP contents of 97% and 90%, respectively, were achieved. After the in vivo implantation in drill hole bone defects in a sheep model, also conducted by our cooperation partners, struvite granules exhibited a similar, and farringtonite granules a slightly improved degradation and new bone formation compared to ß-TCP granules. The remaining granule area after 4 months was 29%, 18% and 30% for struvite, farringtonite and ß-TCP, respectively. Only the K-struvite granules degraded too rapidly, with a relative granule area of 2% at 4 months after implantation.
In conclusion, particularly magnesium ammonium phosphate cement pastes (struvite, dittmarite) appear to be a very promising advancement of mineral bone cements, enabling a rapid resorption of the material in vivo and replacement by newly formed bone.
Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and part of the human bacterial microflora but it also is an opportunistic pathogen and a notorious cause of hospital – acquired and epidemic infections. S. aureus shows a remarkable adaptation to a range of niches within its human host.Previously viewed as an exclusively extracellular pathogen, S. aureus has been demonstrated to replicate inside virtually all cell types after cell invasion. S. aureus thereby either multiplies within phagosomal compartments in professional phagocytes or escapes into the cytosol prior to replication in non-professional phagocytic cells such as epithelial cells. Besides α-type phenol soluble modulins(PSMα, an important role in phagosomal escape was attributed to the non-ribosomal peptide synthase (NRPS) AusAB. AusAB incorporates the aromatic amino acids (AAAs) phenylalanine or tyrosine, as well as the branched-chain amino acids (BCAAs) valine and leucine into three cyclic dipeptides collectively called aureusimines: Phevalin, Tyrvalin and Leuvalin. The role of AusAB in S. aureus infection is not entirely understood. BCAAs are essential amino acids for S. aureus and serve as protein building blocks,precursors for the biosynthesis of branched-chain fatty acids, as well as regulatory molecules for the transcriptional regulator CodY. Severe BCAA depletion triggers stringent response. It is therefore counterintuitive that AusAB would incorporate valine into aureusimines thereby depleting BCAAs in host niches where available nutrients are scarce. The present study therefore analysed the role of the AusAB NRPS and its BCAA-derived monoketopiperazine products, in the interaction of S. aureus with various host niches and with other bacterial species. By using genetic tools and metabolomic approaches, it could be established that the AusAB NRPS preferentially incorporates only the exogenous aromatic amino acids phenylalanine and tyrosine, while the source of valine can be either endogenous or exogenous. By using promoter reporter assays, an effect of the global SaeR regulator on ausAB expression was observed. Additionally, a possible role of the NRPS in modulatory metabolic processes of overflow metabolism emerged. Finally, while the role of AusAB in infection is still unclear, experiments using ex vivo human lung tissue suggest, for the first time, that AusAB NRPS might be involved in the staphylococcal virulence against human lung tissue. By employing bioluminescence and biofilm assays in both Gram-negative (Vibrio harveyi and Pseudomonas aeruginosa) and Gram-positive (CoNS Staphylococcus spp.) model species, a potential role as a Quorum Quenching molecule arose for Phevalin, but not Tyrvalin. While studying a potential connection of AusAB and stringent response, an unexpected role for the BrnQ1 BCAA transporter was revealed. BrnQ1 is known as the major BCAA import protein in S. aureus. The bacteria therefore rely on its activity in environments with low concentrations of available peptides or free BCAAs. The present study shows that BrnQ1 is necessary for efficient phagosomal escape of S. aureus in epithelial cells and that BrnQ1-mediated BCAA uptake is crucial for intracellular bacterial replication in epithelial cells, macrophages and whole human blood. Moreover, BrnQ1 loss of function allows bacteria to survive indefinitely inside macrophages without causing phenotypic changes in colony morphology, size and pigmentation as well as haemolysis after recovery. A dual RNA-sequencing approach further showed that, while no major host transcriptomic rearrangements occurred in human macrophages infected with brnQ1 mutants compared to wild-type S. aureus, intracellular brnQ1 mutants do not respond to local host iron depletion and thus fail to upregulate iron uptake systems. In summary, the present work elaborates on multiple functions of BCAA-based small molecules as well as BCAA-transporters in the S. aureus host and bacterial interactions. This work provides a consolidation of the role of the AusAB NRPS in S. aureus lung infection, gives an insight into the unique mode of action of the NRPS and attributes a novel function for the NRPS-product Phevalin in bacterial communication providing, to my knowledge, the first example of a natural monoketopiperazine involved in bacterial communication. Further, experiments using ex vivo human lung tissue suggest, for the first time, that AusAB NRPS might be involved in the staphylococcal virulence against human lung tissue. Additionally, this work describes a potential mechanism of S. aureus long-term survival in macrophages involving a BCAA-iron metabolism axis.
Die vergangenen Jahre haben eindrucksvoll gezeigt, dass CD19 und BCMA chimäre Antigen-Rezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien nicht nur das Potential haben, die progres¬si-ons¬freie Überlebenszeit von Patienten mit hämatologischen Neoplasien zu verlängern, sondern auch diese erkrankten Menschen in einigen Fällen dauerhaft zu heilen. Trotz der noch immer bestehenden großen Herausforderung CAR-T-Zell-Therapien für mehr Tumorentitäten verfügbar zu machen, insbesondere was die Bekämpfung solider Tumore betrifft, haben die Entdeckung neuer Tumorantigene und Checkpoint-Inhibitoren in den letzten Jahren dazu beigetragen, dass sich immuntherapeutische Ansätze, insbesondere die der adoptiven Immunzelltherapie stetig weiterentwickeln konnten. Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene maligne Bluterkrankung mit schlechten Überlebens¬prognosen und die am häufigsten auftretende Leukämieform bei Erwachsenen. AML ist somit eine der hämatologischen Krebserkrankungen, die noch immer dringend medizini¬sche Innovation benötigt. CAR-T-Zell-Therapien gelten als attraktive neue Strategie, um AML zu bekämpfen, da die leukämischen Blasten empfindlich für T-Zell-vermittelte Lyse sind. In dieser Studie stellen wir Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec) 6 als neues Zielmolekül für CAR-T-Zell-Therapien in AML vor. Wir entwickelten einen Siglec 6-spezifischen CAR mit einer vom humanen monoklonalen Antikörper JML 1 abgeleiteten Antigen-bindenden Domäne. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Siglec 6 auf AML-Zelllinien als auch primären AML-Blasten sowie leukämischen Stamm¬zellen (LSCs) detektierbar ist. Die Behandlung mit Siglec 6 CAR-T-Zellen vermittelte eine anti-leukämische Reaktivität, die mit der Siglec 6-Expressionsstärke in präklinischen Modellen korrelierte. So bewirkten Siglec 6 CAR-T-Zellen eine komplette Remission in einem Xenograft-AML-Modell mit immundefizienten Mäusen und Tumorzellen mit hoher Siglec 6-Expression (NSG/U937). Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass Siglec 6 nicht auf gesunden hämatopoetischen Stamm(vor)läuferzellen (HSC/Ps) exprimiert wird. Unsere Daten legen damit nahe, dass die Siglec 6 CAR-T-Zell-Therapie zur AML-Behandlung eingesetzt werden kann, ohne dass eine nachfolgende hämatopoetische Stammzelltransplantation notwendig wird. In gesunden Blutzellen detektierten wir Siglec 6 auf einer Fraktion naiver B-Zellen und B-Gedächtniszellen sowie basophiler Gra¬nulozyten, sodass insgesamt mit einer limitierten On-Target Off-Tumor-Reaktivität ge¬rechnet werden kann. Die fehlende Siglec 6-Expression auf gesunden HSC/Ps ist ein sig¬nifikantes Unterscheidungsmerkmal zur Expression anderer zuvor untersuchter AML-CAR-Antigene wie CD33 oder CD123. Auch CD70 wird von HSC/Ps nicht exprimiert und wurde in dieser Studie als möglicher Kombinationspartner für duales Targeting in AML evaluiert. Dabei konnten wir feststellen, dass mehrheitlich mindestens eines der beiden CAR-Antigene, Siglec 6 oder CD70, von AML-Zelllinien und primären AML-Zellen expri¬miert wird. Ebenso ließ sich experimentell bestätigen, dass Siglec 6 CAR-T-Zellen mit JML 1-single chain variable fragment (scFv) und jeweils optimierten CAR-Spacersequen¬zen, keine signifikanten Funktionalitätsunter¬schiede aufweisen. Die Vorbehandlung von AML-Zellen mit Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitoren konnte die zytolytische Aktivität der Siglec 6 CAR-T-Zellen durch Steigerung der Siglec 6-Oberflächenexpression auf den Targetzellen erhöhen. Sowohl Siglec 6 als auch CD70 CAR-T-Zellen konnten erfolgreich mit virusfreiem Gentransfer hergestellt werden, wobei die getesteten CD70 CAR-Kon¬strukte aufgrund der CD70-Expression aktivierter T-Zellen zu Fratricide führten und die CAR-Antigen-abhängige als auch unabhängige Proliferation der CD70 CAR-T-Zellen limitierte. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass sowohl Siglec 6 als auch CD70 hilf¬reiche Targetantigene zur CAR-T-Zellbehandlung der AML sein können und dass eine klinische Überprüfung, insbesondere von Siglec 6 CAR-T-Zellprodukten, gewährleistet ist.
Metagenome and metatranscriptome (Meta'ome) sequencing is used to study complex microbial communities. There are already methods that perform well for taxonomic assignment of metagenomic data, but for quantification of metatranscriptomic data, these methods only assign a small percentage of reads with their pre-compiled databases. In contrast to RNA-seq of a single species, in meta’omics studies, reads are assigned to multiple reference sequences due to microbial sequence similarity (ambiguous mapping). Alignment-free methods established for bulk RNA-seq data may be useful for resolving read ambiguity and quantifying meta'omic data. So far, the usage of alignment-free methods in meta’omics has focused on taxonomic abundances but does not provide quantifications of genes or gene families for functional characterization of the meta'ome. Salmon's lightweight alignment, an alignment-free method, quantifies gene abundances precisely despite including reads with mapping uncertainties such as sequencing errors and high-similarity sequences, making it a superior tool for quantifying meta'omic data that uses species' gene sequences as references. This work presents the application of lightweight alignment methods like Salmon to efficiently quantify meta’omic data. I begin by evaluating the existing pipelines/tools with unpublished metagenome and metatranscriptome datasets gathered to examine how the microbiome protects against Salmonella Typhimurium infection in a mouse typhoid model. This analysis revealed a lack of representation of microbiome-associated reference sequences in the pre-compiled databases of the available tools, as well as the difficulty to assign ambiguous mapping to one species in the presence of closely related reference sequences. As an initial proof of concept, Salmon's lightweight alignment assigned the majority of the reads to bacterial reference genomes combined with mouse metagenomic-assembled genomes (MAGs), resolving mapping ambiguity. I performed a simulation-based benchmark analysis using Salmon employing different reference sequence databases to examine the influencethe reference database. For an efficient and reproducible analysis, I developed FLAMe (Flexible Lightweight Alignment of Meta'ome), a Nextflow pipeline that uses Salmon's lightweight and selective alignment to quantify meta'omics data at the species gene level. I examined the influence of gut inflammation and subsequent Salmonella Typhimurium colonisation on the resident mouse gut microbiota using the FLAMe pipeline. This way, I was able to recover many taxonomic and functional groups which have previously been related to Salmonella pathogenesis in the gut. Taken together, this demonstrates that the pipeline quantifies meta'omic data efficiently and reliably. Lastly, I showed that FLAMe can be applied to different experimental setups that generate meta'omic data, which shows its versability in characterising the microbiome.
The human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous pathogen that establishes a life- long infection upon primary infection. While primary infection is mostly asymptomatic, HCMV is responsible for significant morbidity and mortality in immunocompromised patients and neonates. There is currently no vaccine. The strict species specificity of this large double-stranded DNA virus poses a major challenge in understanding cytomegalovirus (CMV) pathogenesis. Murine cytomegalovirus (MCMV) exhibits significant similarity to HCMV and represents a widely used model to study CMV pathogenesis. The genomes of both human cytomegalovirus (HCMV) and murine cytomegalovirus (MCMV) were first sequenced over 20 years ago. Similar to HCMV, the MCMV genome had initially been proposed to harbour ~ 170 open reading frames (ORFs). More recently, RNA-seq based omics approaches revealed HCMV gene expression to be substantially more complex, comprising several hundred viral ORFs, similarly observed for other herpesviruses including KSHV, EBV and our own work on HSV-1, where an integrative analysis was further extended to provide a unified nomenclature for all gene products.
The aim of my PhD project was to generate and utilize available multi-omics datasets to provide a state-of-the-art reannotation of lytic MCMV gene expression based on integrative analysis of a large set of omics data. By developing a novel nomenclature strategy, I annotated 365 viral transcription start sites (TiSS) giving rise to 380 and 454 viral transcripts and ORFs, respectively. The latter included >200 small ORFs, some of which represented the most highly expressed MCMV gene products. I further developed a novel time-resolved TiSS profiling approach (dSLAM-seq) to accurately annotate TiSS and determine the temporal kinetics of viral TiSS usage by metabolic labelling of newly-synthesized RNA. This not only resulted in the identification of a novel MCMV immediate early transcript encoding the m166.5 ORF, which we termed ie4, but also revealed three classes of viral early genes that differ in the onset of transcriptional activity. Furthermore, we identified a class of well-expressed viral transcripts (termed: ‘delayed late genes’) that are induced later than canonical true late genes and contain an initiator element (Inr) but no TATA- or TATT-box in their core promoters. For interesting candidate viral uORFs, I demonstrated their regulatory effects on their downstream ORFs (in cis) through elaborate reporter assays. As a proof-of-concept, I validated two novel ORFs in MCMV infection, including the truncated isoforms of the viral NK-cell immune evasin m145 expressed from a viral TiSS downstream of the canonical m145 mRNA. Despite being ≈5-fold more abundantly expressed than the canonical m145 protein it was not required for downregulating the NK cell ligand, MULT-I, but nevertheless provided evidence for additional unknown glycosylated protein isoforms expressed from the same genomic locus. Furthermore, I validated a novel MCMV protein overlapping the viral polymerase (M54), m54.5. Funded by a seed grant from the DFG research unit FOR2830, I characterized the interactome of the m54.5 protein revealing interactions with three exciting protein complexes for future functional studies. Finally, I tested the hypothesis that viral small ORFs represent a novel class of CD8+ T-cell antigens that are subject to direct but not cross-presentation due to their inherent instability of their encoded microproteins. By expressing model epitopes at the C-terminus of either the M35 uORF or ORF, I could demonstrate that sORF-derived epitopes can be efficiently presented to naïve CD8+ T-cells by MHC-I, and mediate CD8+ T-cell control of infection, but are poor in priming naïve CD8+ T cells in mice. In summary, my work unravel exciting new aspects of an important animal infection model and will pave the way for future mechanistic studies on previously unknown cytomegalovirus gene.
The general transcription factor IIH (TFIIH) is a multi-subunit complex involved in basal transcription as well as nucleotide excision repair. Consequently, mutations in several TFIIH subunits, including the helicase XPD, can lead to defective nucleotide excision repair (NER) and decreased basal transcription. In humans, germline mutations in XPD can lead to xeroderma pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD), and Cockayne syndrome and go along with reduced NER capacity. However, while XP patients suffer from a highly increased risk of skin cancer, including melanoma, TTD patients have developmental defects but no predisposition to cancer. To better understand the reason for the lack of tumorigenic potential, in this study, cell culture models of normal and TTD-mutant melanoma cells containing the TTDA mutants (TTDA-M1T, TTDA-L21P, and TTDA-R56X) and XPD-R722W mutation were developed. This study shows that the generation of TTD-mutant melanoma cell clones was possible, thus revealing that TTD mutations are generally compatible with melanoma cell growth. Both TTDA mutants and XPD-R722W melanoma cells were more sensitive to UV irradiation than control cells. Furthermore, proliferation and migration of TTD (XPD-R722W) cells were substantially reduced compared to control cells, demonstrating that the TTD-causing mutation affects tumorigenic features beyond UV sensitivity. To identify factors mediating this tumor-suppressive effect, comparative RNA sequencing of control and XPD-R722W melanoma cells was performed in this study. Ddit4l was identified as the topmost upregulated gene in XPD-mutant mouse melanoma cells. REDD2 protein, encoded by DDIT4L, has been previously implicated in the inhibition of mTOR - a pathway that is activated in most melanomas. Interestingly, it was found that high REDD2 expression is predictive of enhanced overall survival of skin cutaneous melanoma patients, and melanoma cell lines exhibit very low or even undetectable amounts of REDD2, implying that it might fulfill a tumor-suppressive role in melanoma. Functional studies revealed that REDD2 expression leads to delayed tumorigenic abilities such as proliferation in melanoma cells and suppresses the phosphorylation of the mTORC1 targets and translation regulators p70-S6K and 4EBP1. In summary, this study reveals that the mTOR inhibitor REDD2 is involved in the suppression of melanoma cells expressing TTD-causing XPD mutations.
CRISPR-Cas systems use CRISPR RNAs (crRNAs) to recognize and clear invading nucleic acids. In type II and some type V systems, a trans-activating crRNA (tracrRNA) binds to crRNAs to drive their maturation and subsequent interference by Cas9 and Cas12, respectively. Despite the diversified distribution of tracrRNA and its wide use for genome editing, a few related questions remain to be elucidated. Does crRNA solely derive from CRISPR loci? Could the tracrRNA hybridize with other cellular RNAs containing repeat-like sequences, resulting in crRNA-like RNA? Could we even engineer tracrRNA to sense any RNA-of-interest? To answer these questions, we analyzed the RNAs co-immunoprecipitated with Cas9 from Campylobacter jejuni, and unexpectedly found that tracrRNA hijacked some cellular RNAs as noncanonical crRNAs, which can guide DNA targeting by Cas9. We then demonstrated that the tracrRNA can be reprogrammed to sense any RNA-of-interest. We exploited this RNA sensing capability to develop an in vitro multiplexed RNA detection platform LEOPARD and an in vivo RNA recording platform TIGER. We further combined Rptrs with collateral cleavage of single-stranded DNA by Cas12 nucleases to create a direct RNA detection platform with signal amplification. Finally, we provided a detailed protocol for Rptrs design. My work establishes a new mode of crRNA biogenesis, created a new framework for RNA detection and recording, and would open more opportunities and applications for transcription-dependent editing, regulation and therapy.
–1 programmed ribosomal frameshifting (–1PRF) is a fundamental recoding process that makes alternative reading frames accessible during translation. Especially RNA viruses rely on this mechanism to regulate gene expression for example while main- taining the correct stoichiometry of replicative enzymes and structural proteins. –1PRF is at the heart of viral replication and it has been shown that perturbations of –1PRF efficiency can have dramatic effects on viral fitness.
In the present work, two viral –1PRF elements were studied: severe acute respi- ratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ORF1 a/b and human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) gag-pol. In a mutational study of the SARS-CoV-2 –1PRF element it was confirmed that it functions in its pseudoknot conformation. Additionally, through mutagenesis as well as targeting by antisense oligonucleotides, it was shown that the structure of the RNA directly correlates to –1PRF efficiency.
Next, protein interactors of both –1PRF elements were captured revealing over 100 interactors for SARS-CoV-2 and almost 50 for HIV-1. Through this, a set of 18 core interactors of the unrelated –1PRF elements of SARS-CoV-2 and HIV-1 was identified. Among those, the two proteins HNRNPH1 and ZNF346 were shown to reduce –1PRF efficiency significantly for both sites. Among the interactors of SARS-CoV or HIV-1 alone, the strongest effect was mediated by ZAP-S for SARS-CoV-2 and SRBD1 for HIV-1.
Finally, it was shown that overexpression of ZAP-S reduced the replication of SARS- CoV-2 by 95% in collaboration with the group of Prof. Dr. Čičin-Šain. In addition, using pseudotyped HIV-1 particles, overexpression of SRBD1 reduced RTase levels and by extension viral titers by 90%.
Nach einer weithin anerkannten Betrachtung basiert die Schmerzwahrnehmung auf
komplexen biopsychosozialen Vorgängen und kann entsprechend durch psychische Faktoren
moduliert werden. Darunter können sowohl förderliche Prozesse als auch ungünstige
Denkweisen und Bewältigungsstrategien, wie schmerzassoziierte Verhaltensmuster und
Attributionen, fallen. Während intensive, gar lebensbedrohliche Stressoren häufig mit einer
verstärkten Schmerzwahrnehmung in Verbindung gebracht werden konnten, sind die
Auswirkungen von moderatem psychischen Stress unzureichend geklärt. In bisherigen Studien
wurden z. B. Intensität und Dauer eines psychischen Stressors häufig als entscheidend für
Richtung und Stärke der Schmerzmodulation angesehen, wodurch die Inkonsistenzen
vorangegangener Forschungsarbeiten jedoch nicht erklärt werden können. Aufgrund der
bestehenden Unklarheiten soll in dieser Dissertation anhand zweier Studien der Frage
nachgegangen werden, ob und wie akuter laborexperimenteller psychischer Stress in Form
antizipierter und tatsächlicher sozialer Bedrohung mit einer Schmerzmodulation einhergeht.
In der vorliegenden Arbeit wurde zur Auslösung von moderatem akuten psychosozialen
Stress auf den Goldstandard der psychischen Stressinduktion zurückgegriffen - den Trier Social
Stress Test (TSST). Vorteil des TSST ist, dass er verschiedene stressgenerierende Aufgaben
(Antizipation und Simulation einer Bewerbungssituation durch Vorbereiten und Halten einer
Rede sowie Bearbeitung einer arithmetischen Aufgabe vor einem fiktiven Auswahlkomitee) in
einem hochstandardisierten Kontext vereint, was ihn zu einem sehr reliablen Verfahren macht.
Beim Originalprotokoll des TSST wird lediglich eine Rückmeldung durch das Auswahlkomitee
vage in Aussicht gestellt, ohne dass es zu einer tatsächlichen interpersonellen Bewertung
kommt - die Durchführung des TSST wurde daher in Studie 1 teilweise um eine anschließende
Leistungsrückmeldung ergänzt. So gab es bei den insgesamt vier Versuchsgruppen (N = 179)
eine Bedingung, in der ausschließlich der TSST durchlaufen wurde, während in zwei weiteren
Gruppen die Versuchspersonen eine Rückmeldung von entweder positiver oder negativer
Valenz (ungeachtet der tatsächlichen Performanz) erhielten. In der vierten Gruppe, der
Kontrollbedingung, kam eine zeitlich wie kognitiv abgestimmte Placebo-Aufgabe anstelle des
TSST zum Einsatz. Dadurch, dass im Fall von negativem Feedback eine lediglich antizipierte
soziale Bedrohung in eine mutmaßlich intensivere tatsächliche soziale Abwertung überführt
wurde, wurden im Gruppenvergleich stärkere Effekte hinsichtlich der stressassoziierten
Schmerzantwort erwartet. Unter positivem Feedback wurde hingegen eine Abfederung der
stressinduzierten Auswirkungen auf die Schmerzwahrnehmung und eine raschere Erholung von
TSST-bedingten Stressanstiegen angenommen. Ausschließlich weibliche Versuchspersonen
wurden zur Klärung dieser Fragestellungen in insgesamt vier Versuchsgruppen erhoben
(reguläre TSST-Bedingung, jeweils eine Bedingung, bei der im Anschluss an den TSST eine
positive bzw. negative Leistungsrückmeldung erfolgte, und eine Placebo-Gruppe).
Die basale Schmerzwahrnehmung bzw. die endogene Modulation von Schmerz wurden
mit Hilfe der folgenden Verfahren zu insgesamt drei Messzeitpunkten erfasst (vor und
unmittelbar nach der Stressinduktion sowie mit zusätzlichem zeitlichen Abstand zum Stressor):
thermische Schwellen, Ratings phasischer Hitzeschmerzreize, thermische temporale
Summation sowie konditionierte Schmerzmodulation (engl. conditioned pain modulation,
CPM) der Hitzeschmerzschwelle und der Ratings phasischer Hitzeschmerzreize. Anhand
physiologischer Korrelate der Stress-Achsen-Aktivitäten (Speichel-Alpha-Amylase, Speichel-
Cortisol) sowie Bewertungen der erlebten Angst und des erfahrenen Stresses wurde die
individuelle Stressreaktion quantifiziert.
Insgesamt gab es keine Hinweise auf stressinduzierte Veränderungen der Sensibilität im
ruhenden Schmerzsystem: So zeigte sich in allen Versuchsgruppen entgegen der Hypothese
eine Schmerzreduktion basaler Schmerzparameter im Zeitverlauf - dies ist im Hinblick auf das
ähnliche Reaktionsmuster der Placebo-Bedingung nicht als stressspezifisch anzusehen. Es kann
vielmehr davon ausgegangen werden, dass Adaptations- und / oder Habituationsprozesse die
gruppenübergreifenden Wahrnehmungsveränderungen am ehesten erklären können. Bei
Parametern der endogenen Schmerzmodulation, die die Sensibilität im aktivierten
Schmerzsystem widerspiegeln sollen, konnten teilweise Veränderungen ausgemacht werden,
welche hinsichtlich der involvierten Gruppen jedoch divergierten. So zeigte sich eine
Reduktion des CPM-Effekts der Hitzeschmerzschwelle mit einhergehender Pronozizeption in
den TSST-Bedingungen ohne Leistungsrückmeldung und mit negativem Feedback; in der
Placebo-Bedingung blieb eine Veränderung hingegen aus. Da auch in der Gruppe mit positivem
Feedback keine Veränderungen vorlagen, war ein verringerter CPM-Effekt der
Hitzeschmerschwelle somit ausschließlich in den rein negativ valenten Stressbedingungen
beobachtbar. Bei der temporalen Summation zeigte sich hingegen in beiden Feedback-
Bedingungen - folglich auch in jener, die durch Stress und positiver Leistungsrückmeldung eine
soziale Ambivalenz aufweist - eine niedrigere Pronozizeption infolge der Verringerung
endogener Aufschaukelungsprozesse, die bei den verbliebenen beiden Gruppen jedoch noch
ausgeprägter war (TSST-Gruppe ohne Leistungsrückmeldung und Placebo).
Eine subjektive und physiologische Stressreaktion wurde größtenteils erfolgreich durch
den TSST hervorgerufen, wobei additive bzw. protektive Effekte der Leistungsrückmeldungen
auf die untersuchten Stresskorrelate überwiegend ausblieben. Trotz ähnlicher
gruppenübergreifender Stress-Peaks aller Bedingungen zeigte die Gruppe mit positiver
Leistungsrückmeldung jedoch teilweise eine schnellere Stress-Recovery. Es konnten keine
systematischen Zusammenhänge zwischen Veränderungen der Schmerzwahrnehmung und der
Aktivierung der Stressachsen, Selbstberichten des Stresserlebens bzw. per Fragebogen erfasster
Persönlichkeitseigenschaften und Verarbeitungstendenzen ausgemacht werden.
Aufgrund der in Studie 1 beobachteten schnellen und ausgeprägten Erholung vom
induzierten Stress durch den TSST sollte in einer zweiten Studie untersucht werden, wie sich
ein längeres Stressempfinden auf die Schmerzmodulation auswirkt. In Studie 2 kam daher
erneut der TSST zum Einsatz; im Unterschied zur Originalversion wurden die
Versuchsteilnehmerinnen jedoch zusätzlich dahingehend getäuscht, dass das TSST-
Auswahlkomitee zu einem späteren Zeitpunkt erneut für weitere (stressbehaftete) Aufgaben
zurückkehren würde. Damit wurde beabsichtigt, die Erholung vom Stress zu verzögern, womit
die Schmerztestung unmittelbar nach TSST-Durchführung - in Abgrenzung zu Studie 1 -
vielmehr während statt nach der Stressinduktion stattfinden sollte. Neben jener Versuchsgruppe
mit modifizierter TSST-Durchführung wurde analog dem Vorgehen in Studie 1 eine Placebo-
Gruppe erhoben. In beiden Bedingungen wurden Veränderungen der basalen Wahrnehmung
von hitzeinduziertem Schmerz anhand von zwei Messzeitpunkten erfasst (vor und unmittelbar
nach der Stressinduktion). Daneben wurde erneut anhand physiologischer Korrelate und
subjektiver Bewertungen die individuelle Stressreaktion quantifiziert. Aufgrund der COVID-
19-bedingten zeitweisen Laborschließungen und Auflagen fand die Erhebung unter
bedeutsamen Einschränkungen statt. So konnten mit einem Stichprobenanfang von N = 40
weiblichen Versuchspersonen nur weniger als die Hälfte des angestrebten Stichprobenumfangs
erhoben werden. Die Untersuchung dient daher im Sinne einer Pilotstudie vorrangig der groben
Überprüfung der Hypothese, ob sich die intendierten Veränderungen der Stresspersistenz auch
in der Schmerzwahrnehmung niederschlagen.
Bei den erfassten Schmerzvariablen (Hitzeschmerzschwelle, Hitzeschmerztoleranz,
Ratings phasischer Hitzeschmerzreize) blieb eine stressinduzierte Schmerzmodulation aus,
wobei sich deskriptive Veränderungen in Richtung Hypoalgesie bei den Ratings phasischer
Hitzeschmerzreize fanden. Bei einer subjektiv weitestgehend erfolgreich ausgelösten
Stressreaktion mit jedoch lediglich deskriptiven Cortisol-Veränderungen post-TSST kam es
trotz der modifizierten Instruktion zu einem raschen Absinken der genannten Stresskorrelate.
Explorative Vergleiche mit Stressveränderungen aus Studie 1 deuten vorsichtig auf
(hypothesenkonforme) geringfügigere Erholungen post-TSST in Studie 2 hin. Es konnten keine
systematischen Zusammenhänge zwischen Veränderungen der Schmerzwahrnehmung und der
Aktivierung der Stressachsen, Selbstberichten des Stresserlebens bzw. per Fragebogen erfasster
Persönlichkeitseigenschaften und Verarbeitungstendenzen ausgemacht werden.
Die Ergebnisse der beiden vorliegenden Untersuchungen widersprechen insgesamt
einigen früheren Studien, bei denen teilweise deutliche stressbedingte Veränderungen der
Schmerzsensibilität im ruhenden Schmerzsystem beobachtetet wurden. Diese Effekte
galten - wiederum gegenläufig zu den Ergebnissen der vorliegenden Erhebungen - häufig als
hormonell moduliert (Cortisol). Die in Studie 1 gefundenen stressassoziierten Veränderungen
dynamischer Schmerzparameter (endogene Modulationsprozesse) ließen sich aufgrund der
Uneinheitlichkeit der von den Veränderungen betroffenen Gruppen sowie einem Mangel an
vergleichbaren Studien eher schwer hinsichtlich des bestehenden Erkenntnisstands einordnen.
Die angesprochenen Gruppenunterschiede müssen zudem aufgrund der liberalen statistischen
Testmethoden, auf denen sie beruhen, mit Vorsicht interpretiert werden.
Einer der wichtigsten Gründe für die insgesamt ausmachbaren Inkonsistenzen bisheriger
Forschungsarbeiten und der hier erhobenen Daten könnten methodische Einschränkungen
vergangener Untersuchungen sein, da zahlreiche Erhebungen keine oder nur unzureichend
gematchte Kontrollbedingungen sowie niedrige Fallzahlen aufwiesen. Aufgrund jener
methodischen Einschränkungen können Überschätzungen von Effekten bzw. ungerechtfertigte
(kausale) Interpretationen früherer Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden. Daneben waren
die in diesem Forschungsbereich eingesetzten Vorgehensweisen zur Stressinduktion äußerst
heterogen. Dies ist neben der dadurch erschwerten Vergleichbarkeit von Studien insofern
kritisch, als dass einer vielbeachteten Übersichtsarbeit zufolge sich nicht alle eingesetzten
Verfahren eignen, um laborexperimentellen psychischen Stress reliabel zu induzieren. Der in
den vorliegenden Untersuchungen angewandte TSST gilt hingegen als äußerst empfehlenswert,
könnte jedoch aufgrund von Jugend und Geschlecht des Komitees zu leicht
unterdurchschnittlichen Stresswahrnehmungen der Probandinnen und - im Falle von
Leistungsrückmeldungen - zu einer Glaubwürdigkeitsproblematik geführt haben. Auch wenn
der TSST zudem mit den hier unternommenen Abänderungen weder an sozialer Bedrohlichkeit
noch an (bedeutsamer) Stresspersistenz gewinnen konnte, ergeben sich insbesondere durch die
erwähnte grundsätzliche Güte des Verfahrens in Verbindung mit den methodischen Stärken der
vorliegenden Erhebungen wichtige Erkenntnisse für die Betrachtung bisheriger und Planung
neuer Forschungsarbeiten. Vor dem Hintergrund, dass methodische Standards bei bisherigen
Untersuchungen häufig unbeachtet blieben, erscheint eine umsichtige und grundlegende
Debatte um die Neuausrichtung dieses wichtigen Forschungsbereichs so notwendig wie
chancenreich. Die hier durchgeführten Studien liefern dabei wichtige und fundierte
grundsätzliche Erkenntnisse hinsichtlich der psychosozialen stressinduzierten
Schmerzmodulation bei Frauen, und tragen zum wissenschaftlichen Diskurs bei.
Die vorliegende Dissertation unterstreicht zusammengenommen die Bedeutung
individueller und verfahrensspezifischer Faktoren sowie hoher methodischer Standards. Die
beiden hier vorgestellten Studien liefern sowohl einen guten Ausgangs- als auch
Anknüpfungspunkt für zukünftige Untersuchungen. Neben ihrem Nutzen durch das erweiterte
Grundlagenverständnis der Schmerzwahrnehmung in speziellen Stresskontexten könnten
Studien wie die hier vorliegenden längerfristig auch sinnvoll in klinisch relevante Kontexte
eingebunden werden. Hierbei bietet sich auch die Untersuchung von Stress in klinischen
Kohorten an, insbesondere bei Patient*innen mit chronischen Schmerzstörungen. Im Gegensatz
zu den beschriebenen Inkonsistenzen in laborexperimentellen Settings ist die Evidenz bei
naturalistischen Stressoren belastbarer, weshalb ihre weitere Erforschung hinsichtlich
möglicher Veränderungen der Schmerzwahrnehmung - auch im Kontext manifester
Schmerzstörungen - sinnvoll erscheint, um das Bild der Auswirkungen verschiedenartiger
Stresszustände von variabler Dauer auf akute und chronische Schmerzzustände zu
vervollständigen. Die zahlreich dokumentierten bidirektionalen Zusammenhänge hinsichtlich
stressassoziierter Faktoren sowie der Entstehung und Aufrechterhaltung von chronischen
Schmerzstörungen eröffnen somit auch im klinischen Bereich vielfältige und aussichtsreiche
Forschungsansätze.