570 Biowissenschaften; Biologie
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- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (277)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (82)
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- Institut für Virologie und Immunbiologie (71)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (60)
- Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung (26)
- Institut für Humangenetik (24)
- Institut für Hygiene und Mikrobiologie (23)
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (17)
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (17)
Sonstige beteiligte Institutionen
- CBIO, University of Cape Town, South Africa (1)
- Center for Computational and Theoretical Biology (CCTB), Universität Würzburg (1)
- Chemical Biology Laboratory, National Cancer Institue, Frederick (USA) (1)
- Fachhochschule Kaiserslautern, Campus Zweibrücken (1)
- Fraunhofer IGB - Institutsteil Würzburg Translationszentrum Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Fraunhofer IGB Stuttgart (1)
- Fraunhofer Institute for Integrierte Schaltungen (IIS) (1)
- Hochschule Aalen (1)
- Lehrstuhl für Chemie, Brooklyn College, City University of New York, Brooklyn (1)
- Lehrstuhl für Translationale Onkologie (1)
Understanding the causal relationship between genotype and phenotype is a major objective in biology. Genome-wide association studies (GWAS) correlate genetic polymorphisms with trait variation and have already identified causative variants for various traits in many different organisms, from humans to plants. Importantly, many adaptive traits, like the regulation of flowering time in plants, are not regulated by distinct genetic effects, but by more sophisticated gene regulatory networks.
Für die Verwendung von zellbasierten Therapeutika ist vor allem die korrekt Identifikation
sowohl vom Ausgangsmaterial wie auch dem produziertem Material von
zentraler Wichtigkeit. In dieser Arbeit wurde eine Methodik entwickelt, welche eine
nicht-invasive Klassifizierung von Zellen und zellulärer Entwicklung aufgrund ihrer
zweidimensionalen Magnetresonanz-Korrelationsspektren ermöglichte.
Hierzu wurde ein mobiler MR-Scanner mit einer Feldstärke von 0.5T und einem Isozentrum
von 1 cm3 verwendet. Aufgrund der kompakten und leichten Bauweise war
es möglich, das System in normalen Zellkulturlaboren zu verwenden. Von den Proben
wurde ein zweidimensionales T1/T2 -Korrelationsspektrum aufgenommen, anhand
dessen die Zellen klassifiziert werden sollten. Mithilfe von Agarose-Dotagraf® -Zell-
Phantomen konnte die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Messsystems und der
verwendeten Sequenz validiert werden.
Aufgrund der unter Umständen recht langen Messzeiten der MR-Technologie war
auch die Handhabung und Kultur der Zellproben während des Messprozesses von
großer Bedeutung. Um hierfür den Durchsatz an Proben zu erhöhen, wurde eine kostengünstige
und ebenfalls mobile Robotikanlage entwickelt. Diese basierte auf dem
kommerziell erhältlichen Roboterarm Braccio, welcher durch einen Arduino Mega
Mikrocontroller gesteuert wurde. Mit bis zu 24 Proben pro Tag konnte durch die
Automatisierung der Durchsatz an Proben um den Faktor 3 – 4 gesteigert werden.
Durch den entwickelten Prozess war es möglich, eine umfangreiche Datenbank –
bestehend aus 362 unabhängigen Messungen (biologische Replikate) – aufzubauen.
Die Datenbank enthielt Messungen von zehn unterschiedlichen Zelllinien. Zusätzlich
wurden T1/T2 -Korrelationsspektren von mesenchymalen Stromazellen (MSCs)
vor und nach deren Differenzierung zu Adipocyten aufgenommen, um ihre zelluläre
Entwicklung nicht-invasiv charakterisieren zu können.
Die aufgenommenen Daten wurden mithilfe einer geeigneten Support Vector Machine
wie auch angepassten künstlichen neuronalen Netzwerken klassifiziert. Mithilfe
dieser Methoden konnten die Zelllinien und MSCs anhand ihrer aufgenommenen
Korrelationsspektren mit einer Genauigkeit von bis zu 98% klassifiziert werden.
Diese hohe Treffsicherheit legte den Schluss nahe, dass die Kombination aus nichtinvasiver,
zweidimensionaler T1/T2 -MR-Relaxometrie und der Verwendung von geeigneten
Methoden des machine learning und der künstlichen Intelligenz eine effiziente
Methodik für die nicht-invasive Klassifizierung von Zellen sowie zellulärer
Entwicklung darstellt.
Ein Schlüsselereignis, welches dem prognosebestimmenden Organversagen bei systemi-schen Entzündungsprozessen und Sepsis vorangeht, ist die Entwicklung einer mikrovas-kulären endothelialen Schrankenstörung. Das vaskuläre endotheliale (VE-) Cadherin als mechanischer Stabilisator der Endothelbarriere spielt dabei eine wichtige Rolle. In der Inflammation werden Spaltprodukte von VE-Cadherin (sVE-Cadherin) gebildet. Ge-genstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Hypothese ob diese Spalt-produkte selbst an der Störung der endothelialen Barrierefunktion beteiligt sind.
Es wurde hierfür humanes sVE-Cadherin bestehend aus den extrazellulären Domänen EC1-5 (sVE-CadherinEC1-5) generiert. In Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstands (TER), mit Immunfluoreszenzfärbungen und Western Blot Analysen wird gezeigt, dass sVE-Cadherin dosisabhängig die Barriere Integrität in primären humanen dermalen Endothelzellen stört. Dies führt zu einer Reduktion von VE-Cadherin und den assoziierten Proteinen α-, γ- und δ-Catenin und ZO-1, die nach der Applikation von sVE-Cadherin an den Zellgrenzen reduziert sind. Die Interaktion zwischen VE-PTP und VE-Cadherin wird durch sVE-CadherinEC1-5 reduziert. Durch pharmakologische Hem-mung der Phosphataseaktivität von VE-PTP mittels AKB9778 wird der durch sVE-CadherinEC1-5-induzierte Verlust der Endothelbarriere aufgehoben. Dagegen zeigt die direkte Aktivierung von Tie-2 mittels Angiopoetin-1 keinen protektiven Effekt auf die durch sVE-CadherinEC1-5 gestörte Endothelbarriere. Weitere Analysen zeigen eine erhöh-te Expression von GEF-H1 durch sVE-CadherinEC1-5. Diese ist ebenfalls durch AKB9778 hemmbar.
Zusätzlich zu diesen Untersuchungen wurden die Konstrukte EC1-4 und EC3-5 in ver-schiedene Vektoren kloniert, um zu bestimmen, ob die extrazelluläre Domäne 5 von VE-Cadherin die dominante Rolle bei den sVE-Cadherin-vermittelten Effekten spielt.
Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen zum ersten Mal, dass sVE-CadherinEC1-5 unabhängig von proinflammatorischen Auslösern über die Aktivierung des VE-PTP/RhoA-Signalweges den Zusammenbruch der Endothelbarriere mitversursacht. Dies stellt einen neuen pathophysiologischer Mechanismus dar, der zum Gesamtverständnis der entzündungsinduzierten Barriereveränderungen des Endothels beiträgt.
Das maligne Melanom nimmt als Tumorerkrankung mit hoher Metastasierungsrate und steigenden Inzidenzraten bei höchster Mortalität aller Hauttumoren eine zunehmende Bedeutung in der modernen Onkologie ein. Frühzeitige Diagnosemöglichkeiten und moderne Behandlungen konnten das Überleben der Patienten bereits erheblich verbessern. Jedoch besteht nach wie vor Bedarf an geeigneten Modellen, um die Melanomprogression vollständig zu verstehen und neue wirksame Therapien zu entwickeln. Hierfür werden häufig Tiermodelle verwendet, diese spiegeln jedoch nicht die menschliche Mikroumgebung wider. Zweidimensionalen Zellkulturen fehlen dagegen entscheidende Elemente der Tumormikroumgebung. Daher wurde in dieser Arbeit ein dreidimensionales epidermales Tumormodell des malignen Melanoms, welches aus primären humanen Keratinozyten und verschiedenen Melanomzelllinien besteht, entwickelt. Die eingesetzten Melanomzelllinien variieren in ihren Treibermutationen, wodurch das Modell in der Lage ist, Wirkstoffe zu untersuchen, die spezifisch auf diese Mutationen wirken. Mit Techniken des Tissue Engineerings konnte ein dreidimensionales Hautmodell aufgebaut werden, das alle charakteristischen Schichten der Epidermis aufweist und im Bereich des stratum basale Melanomcluster ausbildet. Diese reichen je nach Größe und Ausdehnung bis in suprabasale Epidermisschichten hinein. Die Tumor-Histopathologie, der Tumorstoffwechsel sowie tumorassoziierte Proteinsekretionen ließen sich im in vitro Modell nachweisen. Darüber hinaus konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem einzelne Zellen aus den Modellen reisoliert werden können. Dies ermöglichte es, den Proliferationszustand innerhalb des jeweiligen Modells zu charakterisieren und die Wirkung von Antitumortherapien gezielt zu bewerten. Die Anwendbarkeit als Testsystem im Bereich der Tumortherapeutika wurde mit dem in der Klinik häufig verwendeten v-raf-Maus-Sarkom-Virus-Onkogen-Homolog B (BRAF)-Inhibitor Vemurafenib demonstriert. Der selektive BRAF-Inhibitor reduzierte erfolgreich das Tumorwachstum in den Modellen mit BRAF-mutierten Melanomzellen, was durch eine Verringerung der metabolischen Aktivität, der proliferierenden Zellen und des Glukoseverbrauchs gezeigt wurde. Für die Implementierung des Modells in die präklinische Therapieentwicklung wurde B-B-Dimethylacrylshikonin, ein vielversprechender Wirkstoffkandidat, welcher einen Zellzyklusarrest mit anschließender Apoptose bewirkt, im Modell getestet.
Bei einer Anwendung der Modelle im Bereich der Testung topischer Behandlungen ist eine Barrierefunktion der Modelle notwendig, die der in vivo Situation nahe kommt. Die Barriereeigenschaften der Hautäquivalente wurden durch die Melanomzellen nachweislich nicht beeinflusst, sind aber im Vergleich zur in vivo Situation noch unzureichend. Eine signifikante Steigerung der Hautbarriere konnte durch die Bereitstellung von Lipiden und die Anregung hauteigener Regenerationsprozesse erreicht werden. Über den Nachweis des transepidermalen Wasserverlusts konnte eine Messmethode zur nicht-invasiven Bestimmung der Hautbarriere etabliert und über den Vergleich zur Impedanzspektroskopie validiert werden. Hierbei gelang es, erstmals die Korrelation der Hautmodelle zur in vivo Situation über ein solches Verfahren zu zeigen. Das entwickelte epidermale Modell konnte durch die Integration eines dermalen Anteils und einer Endothelzellschicht noch weiter an die komplexe Struktur und Physiologie der Haut angepasst werden um Untersuchungen, die mit der Metastierung und Invasion zusammenhängen, zu ermöglichen. Die artifizielle Dermis basiert auf einem Kollagen-Hydrogel mit primären Fibroblasten. Eine dezellularisierte Schweinedarmmatrix ließ sich zur Erweiterung des Modells um eine Endothelzellschicht nutzen. Dabei wanderten die primären Fibroblasten apikal in die natürliche Schweindarmmatrix ein, während die Endothelzellen basolateral eine geschlossene Schicht bildeten.
Die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle sind in der Lage, die Vorhersagekraft der in vitro Modelle und die in vitro - in vivo Korrelation zu verbessern. Durch die Kombination des Melanommodells mit einer darauf abgestimmten Analytik wurde ein neuartiges Werkzeug für die präklinische Forschung zur Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen geschaffen.
T-Zell-aktivierende Formate, wie BiTE (bispecific T-cell engagers) Antikörper und CAR T Zellen haben in den vergangen Jahren die Therapiemöglichkeiten für Tumorpatienten erweitert. Diese Therapeutika verknüpfen T-Zellen mit malignen Zellen über je ein spezifisches Oberflächenmolekül und initiieren, über eine T-Zell-vermittelte Immunantwort, die Lyse der Tumorzelle. Tumorspezifische Antigene sind jedoch selten. Häufig werden Proteine adressiert, die neben den Tumorzellen auch auf gesunden Zellen exprimiert werden. Die Folgen sind toxische Effekte abseits der Tumorzellen auf Antigen-positiven gesunden Zellen (on target/off tumor), welche nicht nur die Dosis des Therapeutikums und dessen Effektivität limitieren, sondern zu geringen bis letalen Begleiterscheinungen führen können. Der Bedarf an effektiven Therapieformen mit geringen Nebenwirkungen ist folglich immer noch sehr hoch. Diese Lücke soll durch ein neues Antikörperformat, sogenannten Hemibodies, geschlossen werden. Hemibodies sind eine neue Klasse von T-Zell-aktivierenden Antikörpern, die sich gegen eine Antigenkombination und nicht einzelne Antigene auf Tumorzellen richten. Sie bestehen aus zwei komplementären Molekülen mit je einer Antigen-bindenden Sequenz, die entweder mit der leichten (VL) oder der schweren (VH) Kette eines T-Zell-aktivierenden anti CD3 Antikörpers fusioniert ist. Nur wenn beide Hemibody-Fragmente gleichzeitig in unmittelbarer Nähe an ihr jeweiliges Antigenepitop auf der Tumorzelle binden, komplementieren die beiden Antikörperkonstrukte über das geteilte anti-CD3 und bilden einen trivalenten T Zell aktivierenden Komplex aus. Diese funktionale Einheit rekrutiert T-Zellen zur Tumorzelle und induzierte die T-Zell-vermittelte Lyse der malignen Zelle.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden geeignete Antigenkombinationen identifiziert und die erste effektive und spezifische Hemibody-basierte Immuntherapie gegen das Multiple Myelom (MM), ohne Nebenwirkungen auf Antigen-einfach-positiven gesunden Zellen, entwickelt. Basierend auf einer umfangreichen Analyse von Kandidaten-Antigenen wurden Kombinationen aus bekannten MM Zielmolekülen, wie BCMA, CD38, CD138, CD229 und SLAMF7, und für das MM unbekannte Oberflächenmolekülen, wie CHRM5 und LAX1, untersucht. Gegen die vielversprechendsten Antigene wurden Hemibodies entwickelt und produziert. Im Zusammenhang mit Analysen zur Produzierbarkeit sowie biochemischen und funktionalen Charakterisierungen, konnte aus 75 initialen Hemibody-Kombinationen drei Kombinationen mit geeigneten Eigenschaften identifiziert werden. Die Bindung von zwei Hemibody-Partnern auf der Oberfläche der MM Zelle führte zur Ausbildung eines trivalenten T-Zell-rekrutierenden Komplexes. Dieser initiierte nachfolgend über eine T-Zell-vermittelte Immunantwort die spezifische Lyse der malignen Zellen, ohne die Viabilität von Antigen-einfach-positiven gesunden Körper- oder Effektor-Zellen zu beeinflussen. Zusätzlich führte eine Hemibody-Therapie in vivo in einem NOD SCID MM-Mausmodel innerhalb von 7 Tagen zur kompletten Remission der MM Zellen. Diese Daten zeigten Hemibodies als ein neues, sehr vielversprechendes Antikörperformat für eine effektive und tumorspezifische Immuntherapie mit potentiell geringen Nebenwirkungen.
Bei der Biofabrikation werden Zellen mit einem Biomaterial versetzt (vereint werden diese als Biotinte definiert) und durch additive Fertigungsmethoden wie dem 3D-Druck zu hierarchischen Strukturen aufgebaut. Zur Herstellung von künstlichen Gewebe und zukünftig auch von funktionalen Organen ist ein detailliertes Zellverständnis essentiell. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Systeme generiert, um die Zellmembranen von mesenchymalen Stromazellen gezielt zu verändern und um die Modifikationen zu charakterisieren. Durch Inkubation mit unnatürlichen Zuckern werden diese von Zellen aufgenommen und in den Zellmetabolismus eingeschleust und auf die Glycoproteine übertragen. Diese Methode ist als metabolic glycoengineering bekannt.
Dazu wurden diverse humane Saccharid-Analoga mit bioorthogonalen Gruppen (Azid oder Alkin) synthetisiert. Alle in dieser Arbeit vorgestellten Moleküle wurden NMR-spektroskopisch als auch massenspektrometrisch charakterisiert.
Die acetylierten Mannosamin-Derivate konnten über zwei Stufen und die Sialinsäure-Derivate über sechs Stufen synthetisiert werden. Sialinsäuren sind die terminalen Zucker an Glycanketten von Proteinen mit wichtigen biologischen Funktionen. Im Rahmen des SFB TRR225 konnte in Kooperation mit der Gruppe von Prof. Dr. R. Ebert der Einbau der Saccharide in mesenchymalen Stromazellen durch Fluoreszenzmikroskopie evaluiert werden. Aufgrund des effizienteren Einbaus der Sialinsäure mit Alkingruppe gegenüber der mit Azidgruppe, wurde dieser in den folgenden massenspektrometrischen Analysen eingesetzt. Die Messungen der markierten Glycoproteine wurden von Dr. Marc Driessen durchgeführt und der metabolische Einbau von SiaNAl und Ac4ManNAl in den Stromazellen gegenübergestellt. 55 Glycoproteine konnten durch SiaNAl und 94 durch Ac4ManNAl charakterisiert werden. Ein Abgleich der Proteindatenbanken eine Anreicherung von Proteine durch Fütterung von SiaNAl die in Signaltransduktion, Zellkontakte und Differenzierung involviert sind, womit metabolic glycoengineering prinzipiell zur Optimierung von Biofabrikationsprozessen genutzt werden kann.
Glioblastoma (GBM) sind bösartige hirneigene Tumore, deren schlechte Prognose einer innovativen Therapie bedarf. Aus diesem Grund wurde ein neuer Therapieansatz entwickelt, der auf einer lokalen Ultraschall-vermittelten Zytostatika Applikation beruht. Hierfür wurden stabile Microbubbles (MB) bestehend aus Phospholipiden synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass MB als auch fokussierter Ultraschall niedriger Intensität (LIFU) keinen negativen Einfluss auf GBM-Zellen hat. MB hingegen konnten mittels LIFU destruiert werden, wodurch das in den MB eingeschlossene Chemotherapeutikum freigesetzt werden kann. Es wurden verschiedene Platin(II)- und Palladium(II)-Komplexe auf GBM Zellen getestet. Zur Beladung der MB wurde Doxorubicin (Dox) verwendet. Es konnte eine Beladungseffizienz der MB mit Dox von 52 % erreicht werden, auch eine Aufreinigung dieser mittel Ionenaustausch-Chromatographie und Dialyse war erfolgreich. Die Austestung der mit Dox beladenen MB (MBDox) erfolgte auf GBM-Zellen in 2D- und 3D-Zelkulturmodellen. Dabei zeigte sich, dass die Behandlung mit MBDox und LIFU für 48 h eine zytotoxische Wirkung hatte, die sich signifikant von der Behandlung mit MBDox ohne LIFU unterschied. Zur Austestung der MBDox in 3D-Zellkulturmodellen wurden zwei Scaffold-Systeme eingesetzt. Es zeigte sich in den Versuchen, dass MBDox mit LIFU im Vergleich zu MBDox ohne LIFU Applikation einen zytotoxischen Effekt auf GBM-Zellen haben. Somit konnte die Wirksamkeit der Zytostatika Applikation mittels MB und LIFU in 2D- und 3D-Zellkulturmodellen erfolgreich etabliert werden. Als weiterer Schritt wurden zwei 3D in vitro Modelle erarbeitet. Dabei wurden zunächst organotypische hippocampale Slice Kulturen (organotypic hippocampal brain slice cultures, OHSC) aus der Maus hergestellt und anschließend mit fluoreszent-markierten Mikrotumoren aus GBM-Zelllinien, Primärzellen (PZ) und aus Patienten generierten GBM-Organoiden hergestellt. Diese GBM-Modelle wurden mit Tumor Treating Fields (TTFields) behandelt. Dabei war eine Abnahme der Tumorgröße von Mikrotumoren aus GBM-Zellen und PZ unter TTFields-Behandlung für 72 h messbar. Als weiteres in vitro Modell wurden humane Tumorschnitte aus intraoperativ entferntem GBM-Patientenmaterial hergestellt. Die Schnitte wiesen ein heterogenes Ansprechen nach 72 h TTFields-Applikation auf. Dies spiegelt die Heterogenität des GBM sehr gut wider und bestärkt die Eignung des Modelles zur Untersuchung von neuen Therapieansätzen zur Behandlung von GBM.
Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet.
Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt.
Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen.
Während der embryonalen Neurogenese spielt die Repression neuraler Gene in nicht neuralen Zellen, sowie in neuralen Vorläuferzellen durch den REST (repressor element silencing transcription factor)-Komplex eine wichtige Rolle. Durch die schrittweise Inaktivierung diese Komplexes im Verlauf der Differenzierung werden neurale Genexpressionsprogramme
gesteuert. Zusätzlich kommt bei der Kontrolle der räumlichen und zeitlichen Regulation der Genexpression während der Neurogenese verschiedenen miRNAs eine wichtige Rolle zu. So konnte in vorangegangenen Arbeiten im Zebrafischen gezeigt werden, dass miR-26b die Transkription eines wichtigen Effektorproteins des REST-Komplexes, CTDSP2 (C-terminal domain small phosphatases), während der Neurogenese negativ reguliert. Da darüber hinaus
die miR-26 Repression zu einer stark verminderten neuronalen Differenzierung führte, kommt diesem regulatorischen Schaltkreis eine zentrale Rolle bei der Neurogenese im Zebrafisch zu.
Die zusammen mit ihren Ctdsp-Wirtsgenen koexprimierte miR-26 Familie liegt in Vertebraten evolutionär hoch konserviert vor. Analog zum Zebrafisch konnte im murinen in vitro ES-Zell Differenzierungssystem gezeigt werden, dass miR-26 die Expression von Ctdsp2 reprimiert.
Weiterhin konnte in diesem System gezeigt werden, dass auch Rest ein miR-26 Zielgen ist und dass der Verlust der miR-26 zu einem Arrest der differenzierenden Zellen im neuronalen Vorläuferstadium führt. Zusammengenommen deuten diese vorangegangenen Arbeiten auf
eine zentrale Rolle der miR-26 während der Neurogenese hin.
Die hier vorgestellte Arbeit zielte zunächst darauf ab die Regulation des REST-Komplexes durch die miR-26 auf molekularer Ebene besser zu verstehen. Der Verlust der miR-26 Bindestelle in der Ctdsp2 mRNA führte zu einer erhöhten Ctdsp2 Expression, beeinflusste aber
nicht die terminale Differenzierung zu Neuronen. Im Gegensatz hierzu führte der Verlust der miR-26 Bindestelle in der Rest mRNA zu einem Arrest der Differenzierung im neuralen Vorläuferzellstadium. Zellen in denen die miR-26 Bindestelle in Rest deletiert war, zeigten zudem, genau wie miR-26 knockout (KO) Zellen, eine erhöhte Expression von REST-Komplex Komponenten, sowie eine verringerte Expression von REST-regulierten miRNAs.
Zusammengenommen weisen diese Daten daraufhin, dass während der Neurogenese im Säugersystem die Inaktivierung von Rest durch miR-26 für die Maturierung von Neuronen eine zentrale Rolle spielt.
Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der Regulation der miR-26 Expression während der Neurogenese. Vorangegangene Arbeiten in nicht-neuronalen Zelltypen identifizierten die lnc (long-non-coding) RNA Malat1 als eine ce (competitive endogenous) RNA der miR-26. Um den Einfluss von Malat1 auf die miR-26 Expression während der Neurogenese zu untersuchen,
wurde zunächst mittels CRISPR/Cas9 der vollständige Malat1-Lokus in ESCs deletiert. Der Verlust von Malat1 führte zu einer erhöhten Expression der miR-26 Familienmitglieder sowie deren Ctdsp-Wirtsgene. Weiterhin war die Proliferation von Malat1 KO neuronalen
Vorläuferzellen stark vermindert, was mit einer Erhöhung der Frequenz seneszenter Zellen einherging. Durch die Inaktivierung von miR-26 in differenzierenden Malat1 KO ESCs konnte dieser proliferative Phänotyp aufgehoben werden. Darüber hinaus konnte eine verstärkte neuronale Differenzierung dieser Zellen beobachtet werden.
Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass neben der Regulation des REST-Komplexes durch miR-26 auch die Kontrolle des Zellzyklus über die Malat1-vermittelte Regulation der miR-26
in neuronalen Vorläuferzellen einen kritischen Schritt bei der Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen zu maturen Neuronen darstellt.
Sepsis ist eine dysregulierte Reaktion des Organismus auf eine Infektion. Bei Sepsis werden oft Blutungs- und Thromboseereignisse beobachtet, welche in einer Disseminierten Intravasalen Gerinnung (DIG) gipfeln können. Thrombozyten sind die Schlüsselzellen von Thrombose und Hämostase. Bei Sepsis und DIG kommt es häufig zu einem Abfall der Thrombozytenzahl, doch Blutungs- und Thromboseereignisse können unabhängig von der Thrombozytenzahl auftreten, was zusätzlich eine Veränderung der Thrombozytenfunktion nahelegt.
In dieser Arbeit wurde deshalb die Thrombozytenfunktion bei 15 Patienten mit Sepsis zu drei Zeitpunkten im Krankheitsverlauf untersucht. Es konnte bei unauffälliger Rezeptorexpression keine Voraktivierung der Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie festgestellt werden. Jedoch war die Aktivierung nach Stimulation mit multiplen Agonisten signifikant reduziert. Besonders ausgeprägt war die Hyporeaktivität bei Stimulation des Kollagen-Rezeptors GPVI mit dem Agonisten CRP-XL. Es wurde gezeigt, dass nach GPVI-Stimulation eine reduzierte Phosphorylierung der nachgeschalteten Proteine Syk und LAT im Vergleich zum Gesundspender induziert wird. In Kreuzinkubationsexperimenten hatte die (Co )Inkubation von Thrombozyten in Plasma von Sepsispatienten oder mit Bakterienisolaten aus Sepsis-Blutkulturen keinen Effekt auf die Thrombozytenreaktivität. Allerdings konnte durch Sepsis-Vollblut eine signifikante GPVI-Hyporeaktivität in Thrombozyten von gesunden Probanden induziert werden, was einen zellulären Mediator als Ursache des Defekts nahelegt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass insbesondere die GPVI-Signalkaskade bei Sepsis massiv beeinträchtigt ist. Der Immunorezeptor GPVI ist ein vielversprechendes Zielmolekül, um die Pathogenese der Sepsis, des Capillary Leak und die immunregulatorische Rolle von Thrombozyten besser zu verstehen. Die GPVI-Hyporeaktivität könnte als zukünftiger Biomarker für die Sepsis-Frühdiagnose genutzt werden.