Rab3A-interacting molecule (RIM) is crucial for fast Ca\(^{2+}\)-triggered synaptic vesicle (SV) release in presynaptic active zones (AZs). We investigated hippocampal giant mossy fiber bouton (MFB) AZ architecture in 3D using electron tomography of rapid cryo-immobilized acute brain slices in RIM1α\(^{−/−}\) and wild-type mice. In RIM1α\(^{−/−}\), AZs are larger with increased synaptic cleft widths and a 3-fold reduced number of tightly docked SVs (0–2 nm). The distance of tightly docked SVs to the AZ center is increased from 110 to 195 nm, and the width of their electron-dense material between outer SV membrane and AZ membrane is reduced. Furthermore, the SV pool in RIM1α\(^{−/−}\) is more heterogeneous. Thus, RIM1α, besides its role in tight SV docking, is crucial for synaptic architecture and vesicle pool organization in MFBs.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, intervallartige Strukturen in Melodien von Neugeborenenlauten der ersten Lebenswoche in unterschiedlichen Umgebungssprachen zu identifizieren und quantitativ zu untersuchen. Es wurden Neugeborene von Müttern mit einer Tonakzentsprache (Japanisch) und einer tonalen Sprache (Lamnso) untersucht und die Befunde miteinander verglichen. Die Frage nach einem sprachlichen Einfluss auf die Auftrittshäufigkeit und die Eigenschaften von Melodieintervallen im Weinen standen im Fokus der Arbeit. Dabei sollte auch die Komplexität der Melodieintervalle bezüglich eines sprachlichen Einflusses untersucht werden. Neben diesen Häufigkeitsanalysen wurden auch temporale Eigenschaften der gefundenen Intervalle sowie die Intervallgrößen ermittelt. Nach einer strengen Vorselektion des Gesamtdatenkorpus von 1664 Einzellauten von 40 Probanden (20 Neugeborene der Nso, 20 japanische Neugeborene) wurden 1213 geeignete Melodien auf Intervalle untersucht und die Ergebnisse verglichen. Langfristig sollen so potenzielle Risikomarker zur nicht-invasiven vorsprachlichen Diagnostik von Sprech- und Sprachentwicklungsstörungen gefunden werden. In der Auftrittshäufigkeit von Melodieintervallen zeigten sich keine signifikanten Sprachgruppenunterschiede zwischen japanischen Neugeborenen und den Neugeborenen der Nso. Dies wurde mit einer physiologischen Eigenschaft als Ausdruck der Reife des laryngealen Regelsystems in diesem frühen Alter interpretiert. Der Einfluss der tonalen Sprache zeigte sich aber in der Auftrittshäufigkeit komplexer Intervalle in der Sprachgruppe Lamnso, die in Anwendung eines verallgemeinerten linearen gemischten Modells signifikant größer war als bei den japanischen Neugeborenen. Die Komplexität der Intervalle, die durch den Intervallkomplexitätsindex (ICI) ausgedrückt wurde, zeigte auf Neugeborenenlevel einen signifikanten Unterschied, in der Sprachgruppe Lamnso wurden mehr komplexe Melodieintervalle gefunden. Die temporalen Eigenschaften zeigten teilweise signifikante Unterschiede. Diese betrafen die Längenverhältnisse der Plateaulängen und die Frequenzverhältnisse der Plateaus. Die Frequenzverhältnisse (Intervallgröße) ergaben sehr ähnliche Befunde. Das vorherrschende Melodieintervall im spontanen Weinen der Neugeborenen beider Sprachgruppen war das Einzelintervall der Größe eines Halbtons. Zusammenfassend kann man sagen, dass Melodieintervalle bei gesunden Neugeborenen bereits in der ersten Lebenswoche regelhaft auftreten. Sprachliche Besonderheiten der vokalen Regelleistung scheinen sich in der Komplexität der Melodieintervalle zu zeigen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen.

Hintergrund: Das Catechol-O-Methyltransferase-Gen (COMT) ist ein vielversprechendes Kandidatengen zur Untersuchung kognitiver und emotionaler Funktionen sowie deren pathologischer Veränderungen. Ein einzelner Basenaustausch in diesem Gen führt zu einer 3-4fach höheren COMT-Aktivität der Val Variante. Ein dadurch vermitteltes dopaminerges Defizit wird als relevanter Faktor für eine veränderte Hirnfunktion angenommen. Mit dem kognitiven Stroop-Paradigma wurden kognitive Verarbeitungsprozesse bisher gut erforscht. Zur Erfassung emotionaler Verarbeitungsprozesse wurde eine emotionale Variante entwickelt, deren neurale Grundlagen bislang weniger gut bekannt sind. Ziel: Unsere imaging genetics-Arbeit untersucht den Einfluss genetischer Varianten auf die neurale Funktion. Ziel dieser experimentellen Arbeit war es, den Einfluss des COMT-Polymorphismus (COMT-PM) auf die Frontalkortex-Funktion in ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) zu erfassen und der Frage nachzugehen, ob das Val-Allel als Risiko-Allel zur Pathogenese einer Angststörung (AS) beitragen könnte. Zudem sollte die Tauglichkeit des emotionalen Stroop- Paradigmas als angstsensibles Messinstrument zur Untersuchung dieser Fragestellung geprüft werden. Demgegenüber steht die Annahme, das emotionale Stroop-Paradigma könnte lediglich eine Arbeitsgedächtnis (AG)-Aufgabe darstellen. Methoden: Mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) und ereigniskorrelierter Potentiale untersuchten wir 121 gesunde nach dem COMT- Val158Met-PM stratifizierte Probanden während eines kombiniert emotional- kognitiven Stroop-Paradigmas. Als neurale Korrelate von Exekutivfunktionen und AG-Aufgaben waren die ROI dabei der laterale präfrontale und inferiore Kortex, die auch mit emotionaler Regulation in Verbindung gebracht werden. Als Parameter der Reaktion des autonomen Nervensystems (ANS) diente die Erfassung der elektrodermalen Aktivität sowie die kontinuierliche Messung von Blutdruck, Herzfrequenz und Herzratenvariabilität. Ergebnisse: Bei allen drei COMT Varianten zeigte sich ein kognitiver Stroop-Effekt mit verlängerter Reaktionszeit und erhöhter Fehleranzahl während der Präsentation inkongruenter Farbworte. Als Reaktion des ANS stellte sich eine erhöhte elektrodermale Aktivität bei inkongruenten Farbworten dar. Die funktionelle Bildgebung ließ in den analysierten Regionen eine erhöhte präfrontale Aktivierung während der Verarbeitung inkongruenter Farbworte nachweisen. Es fanden sich keine Gruppenunterschiede im kognitiven Stroop-Paradigma. Der einzige emotionale Stroop-Effekt zeigte sich in der P300. Der einzig nachweisbare Gruppeneffekt stellte sich im emotionalen Stroop-Paradigma als höhere Fehleranzahl bei Met-Homozygoten verglichen mit Heterozygoten dar. Schlussfolgerung: Genetische Information und funktionelle Bildgebung kombiniert sollten ermöglichen, neurale Mechanismen zu definieren, die mit genetischen Varianten verlinkt sind. Die Ergebnisse bezogen auf die analysierten Regionen liefern keinen Hinweis auf ein Val-Allel assoziiertes Risiko für die Entwicklung einer AS. Damit gelingt es nicht, bisher gewonnene Ergebnisse zum Einfluss des COMT-PM auf die präfrontale Funktion zu replizieren. Fraglich ist jedoch, ob sich das emotionale Stroop-Paradigma zur Untersuchung dieser Frage eignet, da weder in den fNIRS-, noch in den autonomen oder Verhaltensdaten ein emotionaler Stroop-Effekt nachgewiesen werden konnte.

Bei Tumoren von Kopf und Hals kann primär oder adjuvant durch Bestrahlung therapiert werden. Die Folgen dieser Behandlung können Xerostomie, Karies, Infektionen, Dysphagie oder Mundgeruch sein. Diese Nebenwirkungen vermindern die Lebensqualität des Patienten. Unterschiedliche Behandlungsansätze haben aufgrund von therapiebedingten Einschränkungen nicht den Weg in den klinischen Alltag gefunden. Eine Alternative zu den vorhandenen Behandlungsansätzen kann das Tissue Engineering sein. Das Ziel einer Normalisierung der Speichelproduktion nach Behandlung soll durch eine implantierbare, künstliche Speicheldrüse erreicht werden. Kann humanes natives Speicheldrüsengewebe der Parotis auf gradientenfreiem dreidimensional aufgebauten Polyurethan wachsen und seine Funktionalität beibehalten? Humane Parotiszellen wurden von 20 Patienten im Alter von 42 - 90 Jahren durch Operation entnommenen und in Polystyrol-Zellkulturflaschen mit dem Nährmedium BEGM herangezüchtet. Es erfolgte eine 2D-Zellverteilung der reinen Parotiskultur. Zur Kontrolle der Vitalität zwischen den Passagen wurde eine Trypan-Blau Färbung verwendet. Als Trägermaterial der Zellen wurde eine biokompatible, abbaubare Matrix aus ε-Polycaprolacton verarbeitet. Die Übertragung der humanen Parotiszellen wurde mit einer Kleberproteinlösung, bestehend aus den Hauptbestandteilen Aprotinin, Fibrinogen und der Thrombinlösung durchgeführt. 7,14 und 21 Tage nach Aufbringung wurde der Überstand der zeitgleich entnommenen Konstrukte zur Überprüfung des α-Amylase konserviert. Zusätzlich wurden an den 3 Untersuchungstagen Konstrukte für die Anfertigung von histologischen Schnitten, quantitativer PCR, indirekter Immunfluoreszenz und zur Elektronenmikroskopie entnommen. Zur Überprüfung der Funktionalität der angezüchteten Speicheldrüsenzellen wurde das Enzym α-Amylase und das Wasserkanalprotein Aquaporin 5 herangezogen. Bei der Kultivierung der humanen Speicheldrüsenzellen konnte durch den Vitalitätstest Trypan-Blau Färbung in Kombination mit einer Neubauerzählkammer eine konstant hohe Anzahl an vitalen Zellen bis zur 4. Passage nachgewiesen werden. Durch die Lebend/Tot Färbung auf FDA/EB Basis der Konstrukte über die Untersuchungszeit von 14 Tagen konnte keine Vermehrung von avitalen Zellen mikroskopisch festgestellt werden. Die statistische Auswertung mittels Boxplots des ELISA berechnete für den ersten Untersuchungstag einen Median auf niedrigem Niveau von 4,4 U/l und sank im weiteren Zeitverlauf am Untersuchungstag 21 auf die niedrigsten Median von 2,2 U/l ab. α-Amylase konnte an allen 3 Tagen mittels quantitativer PCR und indirekter Immunfluoreszenz belegt werden. Aquaporin 5 als Funktionsnachweis war in der vorliegenden Studie nicht signifikant durch quantitative PCR beweisbar. Die Rasterelektronenmikroskopie bildete adhärente Zellen in kugeliger Form aus den besiedelten Matrices nach 7 Tagen Kultivierung ab. Durch die Transmissionselektronenmikroskopie konnten Zellen, die Zellfortsätze ausgebildet hatten nach 14 Tagen beobachtet werden. Der Versuch, histologische Schnitte auf Grundlage der Paraffineinbettung oder Kryo-Konservierung zu erzeugen, musste frustran abgeschlossen werden. Eine Kultivierung von Speicheldrüsenzellen auf einer Matrix aus ε-Polycaprolacton ohne Gradienten ist eingeschränkt umsetzbar. Die Studie konnte zeigen, dass das Wachstum der Zellen auf konstant niedrigem Niveau über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen lag. Der Funktionsnachweis von α-Amylase auf absinkendem niedrigem Niveau sowie fehlender Bestätigung von Aquaporin 5 kann als stationäre Phase des Wachstums interpretiert werden. Zur Verbesserung der Zellentwicklung sollte die besiedelte Matrix zu einem 3D-Zellwachstum anregen. Bei sequenziell entstehender Polarität der Zellen käme es zu einer Verbesserung der Vitalität sowie der vermehrten Ausbildung von α-Amylase und Aquaporin 5. Dies könnte in einer Kombination der Zellkultur aus Parotiszellen mit Kokulturen aus humanen Myoepithelzellen und Parenchymzellen erreicht werden. Sehr gute Ergebnisse des Zellwachstums und der Zellfunktion konnten aktuell in anderen Studien auf der Trägersubstanz Matrigel oder durch Rebesiedelung von dezellularisierten Organen beobachtet werden.