Sebastian Schmidt

• The aim of this work was to investigate older, established drugs. The extent of the protein binding of chiral ephedra alkaloids to AGP and of ketamine to albumin was determined. Since enantiomers of these drugs are individual available, the focus was on possible enantioselective binding and structural moieties involved in the binding. Previously published work suggested that ephedrine and pseudoephedrine can bind stereoselectively to proteins other than albumin in serum. For the determination of the extent of protein binding, the establishedThe aim of this work was to investigate older, established drugs. The extent of the protein binding of chiral ephedra alkaloids to AGP and of ketamine to albumin was determined. Since enantiomers of these drugs are individual available, the focus was on possible enantioselective binding and structural moieties involved in the binding. Previously published work suggested that ephedrine and pseudoephedrine can bind stereoselectively to proteins other than albumin in serum. For the determination of the extent of protein binding, the established ultrafiltration with subsequent chiral CE analysis was used. To determine the influence of basicity on binding, the drugs methylephedrine and norephedrine were also analyzed. Drug binding to AGP increased with increasing basicity as follows: norephedrine < methylephedrine < ephedrine < pseudoephedrine. pKaff was determined both graphically using the Klotz plot and mathematical indicating a low affinity of the ephedra alkaloids to AGP. Using STD-NMR spectroscopy experiments the aromatic protons and the C-CH3 side chain were shown to be most strongly involved in binding, which could be confirmed by molecular docking experiments in more detail. For all drugs, van der Waals-, π π , cationic interactions, hydrogen bonds, and a formation of a salt bridge were observed. The individual enantiomers showed no significant differences and thus the binding of ephedra alkaloids to AGP is not significant. In contrast to the ephedra alkaloids, the possible enantioselective binding to albumin was investigated for R and S ketamine. Again, ultrafiltration followed by CE analysis was performed. The binding of ketamine to one main binding site could be identified. A non-linear fit was used for the determination of pKaff. Using the NMR methods STD-NMR, waterLOGSY-NMR, and CPMG-NMRspectroscopy: the aromatic protons as well as the protons of the NCH3 methyl group showed the largest signal intensity changes, while the cyclohexanone protons showed the smallest changes. pKaff was also determined by the change in the chemical shift at different drug-protein ratios. These obtained values confirm the values obtained from ultrafiltration. Based on this, ketamine is classified as a low-affinity ligand to albumin. There were no significant differences between the individual enantiomers and thus the binding of ketamine to albumin is not a stereoselective process. Using statistical design of experiments an efficient chiral CE method for determining the extent of protein binding of R and S ketamine to albumin was developed and validated according to ICH Q2 (R1) guideline. The stability of ketamine was also investigated because a yellowish discoloration of an aqueous solution of ketamine developed under heat. XRPD investigations showed the same crystal structure for all batches examined. An untargeted screening using LC HRMS as well as LC UV measurements showed no degradation of ketamine or the presence of impurities in stress and non-stressed ketamine solutions, confirming the stability of ketamine under the stress conditions investigated. The lower the quality of the water used in the stress tests, the more intense the yellow discoloration occurred. The impurity or the mechanism that causes the yellow discoloration could not be identified.…
• Ziel dieser Arbeit war es ältere, etablierte Arzneistoffe zu untersuchen. Das Ausmaß der Proteinbindung von chiralen Ephedra-Alkaloiden an AGP und von Ketamin an Albumin wurde bestimmt. Da Enantiomere dieser Wirkstoffe individuell verfügbar sind, lag der Fokus auf möglichen enantioselektiven Bindungen und strukturellen Funktionalitäten, die an der Bindung beteiligt sind. Zuvor veröffentlichte Arbeiten deuteten darauf hin, dass Ephedrin und Pseudoephedrin stereoselektiv an andere Proteine als Albumin im Serum binden können. Zur Bestimmung desZiel dieser Arbeit war es ältere, etablierte Arzneistoffe zu untersuchen. Das Ausmaß der Proteinbindung von chiralen Ephedra-Alkaloiden an AGP und von Ketamin an Albumin wurde bestimmt. Da Enantiomere dieser Wirkstoffe individuell verfügbar sind, lag der Fokus auf möglichen enantioselektiven Bindungen und strukturellen Funktionalitäten, die an der Bindung beteiligt sind. Zuvor veröffentlichte Arbeiten deuteten darauf hin, dass Ephedrin und Pseudoephedrin stereoselektiv an andere Proteine als Albumin im Serum binden können. Zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung wurde die etablierte Ultrafiltration mit anschließender chiraler CE-Analyse eingesetzt. Um den Einfluss der Basizität auf die Bindung zu bestimmen, wurden auch die Wirkstoffe Methylephedrin und Norephedrin analysiert. Die Bindung des Wirkstoffs an AGP nahm mit zunehmender Basizität wie folgt zu: Norephedrin < Methylephedrin < Ephedrin < Pseudoephedrin. pKaff wurde sowohl grafisch mit Hilfe des Klotz-Plots als auch mathematisch bestimmt, was auf eine geringe Affinität der Ephedra-Alkaloide zu AGP hinweist. Mittels STD-NMR Spektroskopie Experimenten konnte gezeigt werden, dass die aromatischen Protonen und die C-CH3-Seitenkette am stärksten an der Bindung beteiligt sind, was durch molekulare Docking-Experimente detailliert bestätigt werden konnte. Für alle Wirkstoffe wurden van-der-Waals-, π π , kationische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und die Bildung einer Salzbrücke beobachtet. Die einzelnen Enantiomere zeigten keine signifikanten Unterschiede, so dass die Bindung von Ephedra-Alkaloiden an AGP nicht signifikant ist. Im Gegensatz zu den Ephedra-Alkaloiden wurde die mögliche enantioselektive Bindung an Albumin für R und S Ketamin untersucht. Auch hier wurde eine Ultrafiltration mit anschließender CE-Analyse durchgeführt. Die Bindung von Ketamin an eine Hauptbindungsstelle konnte identifiziert werden. Für die Bestimmung von pKaff wurde eine nichtlineare Anpassung verwendet. Mit den NMR-Methoden STD-NMR, waterLOGSY NMR und CPMG-NMR Spektroskopie zeigten sowohl die aromatischen Protonen als auch die Protonen der NCH3-Methylgruppe die größten Änderungen der Signalintensität, während die Cyclohexanon-Protonen die geringsten Änderungen afuwiesen. pKaff wurde auch durch die Änderung der chemischen Verschiebung bei verschiedenen Wirkstoff-Protein-Verhältnissen bestimmt. Die Werte bestätigen die durch die Ultrafiltration erhaltenen Werte. Auf dieser Grundlage wird Ketamin als Ligand mit niedriger Affinität zu Albumin eingestuft. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Enantiomeren und somit ist die Bindung von Ketamin an Albumin kein stereoselektiver Prozess. Mit Hilfe der statistischen Versuchsplanung wurde eine effiziente chirale CE-Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung von R und S Ketamin an Albumin entwickelt und gemäß der ICH Q2 (R1) Richtlinie validiert. Die Stabilität von Ketamin wurde ebenfalls untersucht, da sich unter Hitze eine gelbliche Verfärbung einer wässrigen Ketaminlösung entwickelte. XRPD-Untersuchungen zeigten für alle untersuchten Chargen die gleiche Kristallstruktur. Ein nicht zielgerichtetes Screening mittels LC HRMS sowie LC UV-Messungen zeigte keinen Abbau von Ketamin oder das Vorhandensein von Verunreinigungen in Stress- und nicht gestressten Ketaminlösungen, was die Stabilität von Ketamin unter den untersuchten Bedingungen bestätigt. Je schlechter die Qualität des in den Stresstests verwendeten Wassers war, desto intensiver trat die Gelbverfärbung auf. Die Verunreinigung oder der Mechanismus, der die gelbe Verfärbung verursacht, konnte nicht identifiziert werden.…