Marcus Meyr

• Die Infektion mit dem Hepatitis C Virus (HCV) gilt als eine der Hauptursachen für chronische Hepatitiden und führt häufig zu Leberzirrhose und Leberkarzinom. Weltweit sind etwa 200 Millionen Menschen mit diesem Virus infiziert. Die aktuelle Behandlung der Hepatitis C mit Ribavirin und Interferon-alpha ist langwierig, beeinträchtigt durch Nebenwirkungen und führt nur bei einem Teil der Patienten zur Heilung. Aus diesem Grund ist die Entwicklung eines präventiv oder therapeutisch einsetzbaren Impfstoffes gegen HCV-Infektionen sehr wünschenswert.Die Infektion mit dem Hepatitis C Virus (HCV) gilt als eine der Hauptursachen für chronische Hepatitiden und führt häufig zu Leberzirrhose und Leberkarzinom. Weltweit sind etwa 200 Millionen Menschen mit diesem Virus infiziert. Die aktuelle Behandlung der Hepatitis C mit Ribavirin und Interferon-alpha ist langwierig, beeinträchtigt durch Nebenwirkungen und führt nur bei einem Teil der Patienten zur Heilung. Aus diesem Grund ist die Entwicklung eines präventiv oder therapeutisch einsetzbaren Impfstoffes gegen HCV-Infektionen sehr wünschenswert. Das hoch attenuierte und in seiner Vermehrungsfähigkeit extrem eingeschränkte modifizierte Vakziniavirus Ankara (MVA) gehört zu den viel versprechendsten Kandidaten für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Virusimpfstoffe. Im Rahmen dieser Arbeit sollten erste rekombinante MVA-HCV-Viren auf ihre Eignung als Impfstoffe untersucht werden. Als Zielantigene dienten wichtige virale Strukturproteine, darunter das unter den HCV-Genotypen hoch konservierte Nukleokapsidprotein Core, sowie das Nichtstrukturprotein NS3, welches als regulatorisches Virusprotein im HCV-Replikationszyklus eine wichtige Rolle spielt, untersucht werden. Hierfür wurden die rekombinanten MVA-Viren MVA-P7.5-HCV core (MVA-core) und MVA P7.5-HCV-1-830 (MVA-1-830) eingesetzt, welche für die HCV-Strukturproteine codierende Gensequenzen unter der Kontrolle des Vakziniavirus-spezifischen Promotors P7.5 exprimieren. Zusätzlich wurde ein weiteres rekombinantes Virus MVA-P7.5-HCV-NS3 (MVA-NS3) konstruiert, welches die Gensequenz für das HCV-Nichtstrukturprotein NS3 trägt. Alle Vektorviren erwiesen sich in in vitro Experimenten als genetisch stabil, erlaubten die Produktion der rekombinanten HCV-Antigene in infizierten Zielzellen und waren somit geeignet für in vivo Untersuchungen im Mausmodell. Da HCV-spezifischen CD8+-T-Zellantworten eine wichtige Rolle bei der Ausheilung einer Hepatitis C zugeschrieben wird, sollte insbesondere die Anregung dieser Immunantworten untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass bereits eine einmalige Immunisierung mit MVA-core, MVA-1-830 oder MVA-NS3 ausreichend ist, um HCV-spezifische CD8+-T-Zellantworten zu induzieren. Diese CD8+-T-Lymphozyten konnten ex vivo in Epitop-spezifischer Weise zur Interferon-gamma-Synthese stimuliert werden, ließen sich Antigen-spezifisch in vitro expandieren und waren in der Lage, HCV-spezifische Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Zudem konnte eine Steigerung der Immunantworten durch Mehrfachapplikation der MVA-Vakzinen erzielt werden. Im Folgenden gelang es, die HCV-spezifischen CD8+-T-Zellantworten durch kombinierte Applikation der MVA-Vakzinen mit anderen rekombinanten Virusimpfstoffen wie Semliki-Forest-Viren oder Adenoviren, sowie mit Plasmid-DNA weiter zu verstärken. Solche Impfstrategien sind viel versprechend, da sich die gemeinsame Komponente der eingesetzten, unterschiedlichen Vektorvakzinen auf die rekombinanten Antigene beschränkt und eine starke Immunreaktion auf diese Antigene angeregt wird. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass rekombinante MVA-Vektoren, die HCV-spezifische Antigene produzieren, dafür geeignet sind, um nach Impfapplikation HCV-spezifische zelluläre Immunantworten zu induzieren. Die im Tiermodell erarbeiteten, optimierten Immunisierungsstrategien liefern eine erste Grundlage für weitere Immunisierungsexperimente in Primatenmodellen und zur Planung erster klinischer Studien im Menschen.…
• Infections with hepatitis C virus (HCV) are considered as one of the main causes for chronic hepatitis and often lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. About 200 million people worldwide are chronically infected with this virus. The current antiviral therapy relying on ribavirin and interferon-alpha is time consuming, often impaired by side effects and leads to resolution of the disease in only a part of the patients. For this reason, the development of a prophylactic or therapeutic vaccine against HCV infections is veryInfections with hepatitis C virus (HCV) are considered as one of the main causes for chronic hepatitis and often lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. About 200 million people worldwide are chronically infected with this virus. The current antiviral therapy relying on ribavirin and interferon-alpha is time consuming, often impaired by side effects and leads to resolution of the disease in only a part of the patients. For this reason, the development of a prophylactic or therapeutic vaccine against HCV infections is very desirable. The highly attenuated and replication deficient modified vaccinia virus Ankara (MVA) is one of the most promising candidates for development of new generation virus vaccines. Purpose of this work was to evaluate first recombinant MVA HCV viruses for their suitability as vaccines against hepatitis C. HCV structural proteins, amongst them the highly conserved core protein, as well as the non-structural protein NS3, which plays a key regulatory role in the HCV replication cycle, served as target antigens for MVA vaccine development. First, we investigated recombinant MVA viruses MVA-P7.5-HCV-core (MVA-core) and MVA-P7.5-HCV-1-830 (MVA-1-830), which express the coding gene sequences for HCV structural proteins under control of the vaccinia virus specific promoter P7.5. Second, we constructed and characterized a recombinant virus MVA-P7.5-HCV-NS3 (MVA-NS3) that carries the gene sequence for the HCV non-structural protein NS3. As demonstrated by in vitro experiments, all vector viruses were genetically stable, permitted the production of recombinant HCV antigens in infected target cells and were thus suitable for in vivo experiments using mouse models. Since HCV specific CD8+ T cell responses are considered important in hepatitis C virus clearance, special emphasis was given to the analysis of induction of this kind of immune response. When tested in first vaccination experiments, already a single immunization with MVA-core, MVA-1-830 or MVA-NS3 was sufficient to induce HCV specific CD8+ T cell responses. These CD8+ T lymphocytes could be stimulated ex vivo in an epitope specific manner, resulting in interferon-gamma production, could be further expanded in vitro and were able to recognize and lyse HCV specific target cells. Additionally, multiple applications of the MVA vaccines resulted in an increase of these cellular immune responses. In a final series of experiments, the possibility to further amplify HCV specific CD8+ T cell responses could be demonstrated by using combined applications of MVA with other experimental gene transfer vaccines based on Semliki Forest virus, adenovirus or plasmid DNA. Overall, the results of this work clearly suggest that recombinant MVA vectors delivering HCV specific antigens, are suitable candidate vaccines for induction of HCV specific cellular immune responses upon immunization. Importantly, the definition of optimized immunization strategies offers a rational basis for further immunization studies in primate models and for the conception of first clinical studies in humans.…