Francesca Sara Colizzi

• Living beings evolved in an environment with cyclic changing conditions where a variety of factors such as light, temperature, or food availability oscillate in a daily 24-h rhythm. Endogenous circadian clocks in addition to controlling daily rhythms, are also thought to serve as an internal reference for measuring day length. This allows animals to adapt to seasonal changes through photoperiodic responses. While these responses are well-documented in insects, the underlying timing mechanisms for day-length discrimination remain incompletelyLiving beings evolved in an environment with cyclic changing conditions where a variety of factors such as light, temperature, or food availability oscillate in a daily 24-h rhythm. Endogenous circadian clocks in addition to controlling daily rhythms, are also thought to serve as an internal reference for measuring day length. This allows animals to adapt to seasonal changes through photoperiodic responses. While these responses are well-documented in insects, the underlying timing mechanisms for day-length discrimination remain incompletely understood. This thesis aimed at the characterization of the circadian clock of a strongly photoperiodic insect, the pea aphid Acyrthosiphon pisum, that allowed us to find putative neuronal connection between the circadian clock and the photoperiodic system of this insect. In the first chapter, we characterized the neuronal organization of aphid clock clusters using antibodies against the clock proteins Period and Cryptochrome. These clusters were found in the dorsal and lateral protocerebrum, and in the lamina and exhibited daily oscillations. Notably, the clusters expressing Cryptochrome showed light-dependent oscillations, indicating their potential role as clock photoreceptors. These Cryptochrome-positive clusters projected towards the pars intercerebralis, a region crucial for photoperiodism in aphids. In the second chapter, we focused on the Pigment-dispersing factor (PDF), the most important clock neuropeptide in insects. We discovered significant changes in the, otherwise highly conserved, insect C-terminal amino acid sequence of the newly identified pdf gene. PDF was identified in the lateral clock neurons, and their terminals in the dorsal protocerebrum close to the insulin-producing cells located in the pars intercerebralis. These terminals showed daily and seasonal variations, suggesting PDF’s involvement in regulating neurohormone release. To further explore the neuroanatomy of the aphid circadian clock and identify clock-related neuropeptides, we conducted transcriptomic analysis, mass spectrometry, and fluorescent immunohistochemistry. We found that the lateral clock neurons expressed various neuropeptides (in particular Allatotropin, FMRFamide, Orcokinin-A and PDF), similar to those in cockroaches involved in light input pathways. The dorsal clock neurons also exhibit neuropeptide immunoreactivity (precisely of Allatostatin A, Diuretic Hormone31, FMRFamide and Myoinhibitory Peptide), supporting their involvement in modulating circadian and seasonal neurohormonal rhythms. Finally, in the fourth chapter, we provide an overview of the putative mechanisms of photoperiodic control in aphids, from the photoreceptors involved in this process to the circadian clock and the neuroendocrine system.…
• Organismen haben sich in einer Umwelt mit zyklisch wechselnden Umweltbedingungen entwickelt, in der eine Vielzahl von Faktoren wie Licht, Temperatur oder Nahrungsver fügbarkeit in einem 24-Stunden-Rhythmus schwanken. Es wird angenommen, dass endogene, zirkadiane Uhren nicht nur die Tagesrhythmen steuern, sondern auch als eine interne Referenz für die Messung der Tages länge dienen. Durch photoperiodische Anderungen des Verhaltens, des Stoffwechsels , etc. ermöglicht dies den Tieren, sich an saisonale Veränderungen anzupassen. Während dieseOrganismen haben sich in einer Umwelt mit zyklisch wechselnden Umweltbedingungen entwickelt, in der eine Vielzahl von Faktoren wie Licht, Temperatur oder Nahrungsver fügbarkeit in einem 24-Stunden-Rhythmus schwanken. Es wird angenommen, dass endogene, zirkadiane Uhren nicht nur die Tagesrhythmen steuern, sondern auch als eine interne Referenz für die Messung der Tages länge dienen. Durch photoperiodische Anderungen des Verhaltens, des Stoffwechsels , etc. ermöglicht dies den Tieren, sich an saisonale Veränderungen anzupassen. Während diese Reaktionen bei Insekten gut dokumentiert sind, sind die zugrundeliegenden zeitlichen Mechanismen für die Unterscheidung der Tages längen noch nicht vollst ändig geklärt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der zirkadiane Uhr eines stark photoperiodischen Insekts, der Erbsenblattlaus Acyrthosiphon pisum um eine mögliche neuronale Verbindung zwischen der zirkadianen Uhr und dem photoperiodischen System zu finden. Im ersten Kapitel wurden Antik¨orper gegen die Uhrenproteine Period und Cryptochrom verwendet, um die Organisation der verschiedenen Gruppen der Uhrneurone in der Blattlaus zu charakterisieren. Diese Cluster befanden sich sowohl im dorsalen und lateralen Protocerebrum als auch in der Lamina und zeigten tägliche Oszillationen in den untersuchten Proteinen der zirkadianen Uhr. Insbesondere die Cryptochrom-positiven Gruppen zeigten lichtabhängige Oszillationen, was auf ihre potenzielle Rolle als Photorezeptoren für die Uhr hinweist. Diese Cryptochrom-positiven Cluster projizierten in Richtung der Pars intercerebralis, einer für den Photoperiodismus der Blattl¨ause entscheidenden Region. Das zweite Kapitel fokussiert sich auf das wichtigste Neuropeptid der Inneren Uhr in Insekten, Pigment-Dispersing Factor (PDF). Das PDF der Blattläuse weißt bedeutende Veränderungen in der C-terminalen Aminosäuresequenz auf, welche in Insekten ansonsten hoch konserviert ist. PDF wurde in lateralen Uhrenneuronen und ihren Terminalen im dorsalen Protocerebrum in der Nähe von Insulin produzierenden Zellen in der Pars intercerebralis gefunden. Diese Terminalen zeigten tages und jahreszeitliche Fluktuationen, was auf eine Beteiligung von PDF an der Regulierung der Freisetzung von Neurohormonenhindeutet. Zur weiteren Erforschung der Neuroanatomie der zirkadianen Uhr der Blattlaus und zur Identifizierung von Neuropeptiden, die mit der Uhr in Verbindung stehen, wurden Transkriptomanalysen, Massenspektrometrie und Fluoreszenz-Immunhistochemie durch geführt. Dabei wurde deutlich, dass Lateral Uhrneurone mehrere Neuropeptide exprimieren (insbesondere Allatotropin, FMRFamid, Orcokinin-A und PDF), welche denen der Schabenähneln, vi und am Lichteingang der Inneren Uhr beteiligt sind. Dorsale Uhrenneuronen weisen ebenfalls eine Immunreaktivität für Neuropeptide auf (insbesondere Allatostatin A, Diuretisches Hormon31, FMRFamid und Myoinhibitorisches Peptid), was ihre Beteiligung an der Modulation zirkadianer und saisonaler neurohormoneller Rhythmen belegt. Das vierte Kapitel befasst sich schließlich mit den möglichen Mechanismen der photoperiodischen Steuerung bei Blattläusen. Es beginnt mit den beteiligten Photorezeptoren und endend mit der zirkadianen Uhr und dem neuroendokrinen System.…