Falk Fred Finn Ponath

• The anaerobe Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) is an important member of the oral microbiome but can also colonize different tissues of the human body. In particular, its association with multiple human cancers has drawn much attention. This association has prompted growing interest into the interaction of F. nucleatum with cancer, with studies focusing primarily on the host cells. At the same time, F. nucleatum itself remains poorly understood, which includes its transcriptomic architecture but also gene regulation such as global stressThe anaerobe Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) is an important member of the oral microbiome but can also colonize different tissues of the human body. In particular, its association with multiple human cancers has drawn much attention. This association has prompted growing interest into the interaction of F. nucleatum with cancer, with studies focusing primarily on the host cells. At the same time, F. nucleatum itself remains poorly understood, which includes its transcriptomic architecture but also gene regulation such as global stress responses that typically enable survival of bacteria in new environments. An important aspect of such regulatory networks is the post-transcriptional regulation, which is entirely unknown in F. nucleatum. This paucity extents to any knowledge on small regulatory RNAs (sRNAs), despite their important role as post-transcriptional regulators of the bacterial physiology. Investigating the above stated aspects is further complicated by the fact that F. nucleatum is phylogenetically distant from all other bacteria, displays very limited genetic tractability and lacks genetic tools for dissecting gene function. This leaves many open questions on basic gene regulation in F. nucleatum, such as if the bacterium combines transcriptional and post-transcriptional regulation in its adaptation to a changing environment. To begin answering this question, this works elucidated the transcriptomic landscape of F. nucleatum by performing differential RNA-seq (dRNA-seq). Conducted for five representative strains of all F. nucleatum subspecies and the closely related F. periodonticum, the analysis globally uncovered transcriptional start sites (TSS), 5'untranslated regions (UTRs) and improved the existing annotation. Importantly, the dRNA-seq analysis also identified a conserved suite of sRNAs specific to Fusobacterium. The development of five genetic tools enabled further investigations of gene functions in F. nucleatum. These include vectors that enable the expression of different fluorescent proteins, inducible gene expression and scarless gene deletion in addition to transcriptional and translational reporter systems. These tools enabled the dissection of a Sigma E response and uncovered several commonalities with its counterpart in the phylogenetically distant Proteobacteria. The similarities include the upregulation of genes involved in membrane homeostasis but also a Simga E-dependent regulatory sRNA. Surprisingly, oxygen was found to activated Sigma E in F. nucleatum contrasting the typical role of the factor in envelope stress. The non-coding Sigma E-dependent sRNA, named FoxI, was shown to repress the translation of several envelope proteins which represented yet another parallel to the envelope stress response in Proteobacteria. Overall, this work sheds light on the RNA landscape of the cancer-associated bacterium leading to the discovery of a conserved global stress response consisting of a coding and a non-coding arm. The development of new genetic tools not only aided the latter discovery but also provides the means for further dissecting the molecular and infection biology of this enigmatic bacterium.…
• Das anaerobe Bakterium Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) ist ein wichtiger Bestandteil des oralen Mikrobioms, kann aber auch verschiedene Gewebe des menschlichen Körpers besiedeln. Insbesondere seine Verbindung mit mehreren menschlichen Krebsarten hat viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Diese Assoziation hat zu einem wachsenden Interesse an der Interaktion von F. nucleatum} mit Krebs geführt, wobei sich die Untersuchungen in erster Linie auf die Wirtszellen konzentrieren. Gleichzeitig ist F. nucleatum selbst nach wie vor schlechtDas anaerobe Bakterium Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) ist ein wichtiger Bestandteil des oralen Mikrobioms, kann aber auch verschiedene Gewebe des menschlichen Körpers besiedeln. Insbesondere seine Verbindung mit mehreren menschlichen Krebsarten hat viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Diese Assoziation hat zu einem wachsenden Interesse an der Interaktion von F. nucleatum} mit Krebs geführt, wobei sich die Untersuchungen in erster Linie auf die Wirtszellen konzentrieren. Gleichzeitig ist F. nucleatum selbst nach wie vor schlecht verstanden, einschließlich seiner transkriptomischen Architektur, als auch der Genregulation, wie z. B. globale Stressreaktionen, die typischerweise das Überleben von Bakterien in neuen Umgebungen ermöglichen. Ein wichtiger Aspekt solcher regulatorischer Netzwerke ist die post-transkriptionelle Regulation, die bei F. nucleatum völlig unbekannt ist. Diese Unkenntnis erstreckt sich auch auf das Wissen über kleine regulatorische RNAs, trotz ihrer wichtigen Rolle als post-transkriptionelle Regulatoren der bakteriellen Physiologie. Die Untersuchung der oben genannten Aspekte wird zusätzlich durch die Tatsache erschwert, dass F. nucleatum phylogenetisch von allen anderen Bakterien weit entfernt ist, eine sehr begrenzte genetische Traktabilität aufweist und keine genetischen Werkzeuge zur Untersuchung der Genfunktion vorliegen. Dies führt zu vielen offenen Fragen bezüglich grundlegendener Genregulation in F. nucleatum, z. B. ob das Bakterium transkriptionelle und post-transkriptionelle Regulation kombiniert, um sich an eine sich verändernde Umwelt anzupassen. Als erster Schritt zur Beantwortung dieser Frage wurde in dieser Arbeit die transkriptomische Landschaft von F. nucleatum durch differential RNA-seq (dRNA-seq) aufgeklärt. Anhand von fünf repräsentativen Stämmen aller Unterarten von F. nucleatum und dem eng verwandten F. periodonticum wurden durch die Analyse global transkriptionelle Startstellen (TSS) und 5'untranslatierte Regionen (5'UTRs) aufgedeckt als auch die bestehende Annotation verbessert. Weiterhin konnte die dRNA-seq-Analyse auch eine konservierte Anzahl von Fusobacterium-spezifischen sRNAs identifizieren. Die Entwicklung von fünf genetischen Werkzeugen ermöglichte weitere Untersuchungen der Genfunktionen in F. nucleatum. Dazu gehören Vektoren, welche die Expression verschiedener fluoreszierender Proteine ermöglichen als auch Systeme für die induzierbare Genexpression, narbenlose Gendeletion sowie transkriptionelle und translationale Reportersysteme. Mit diesen Werkzeugen konnte die Sigma E Antwort entschlüsselt werden, welche mehrere Gemeinsamkeiten mit ihrem Gegenstück in den phylogenetisch entfernten Proteobakterien aufweist. Zu diesen Gemeinsamkeiten gehört die Hochregulierung von Genen, die an der Membranhomöostase beteiligt sind, aber auch eine Sigma E-abhängige regulatorische sRNA. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Sauerstoff Sigma E in F. nucleatum aktiviert, was im Gegensatz zu der typischen Rolle des $\sigma$-Faktors bei Membranstress steht. Die nicht-kodierende sRNA mit dem Namen FoxI, die von Sigma E abhängt, unterdrückt nachweislich die Translation verschiedener Membranproteine, was eine weitere Parallele zur Membranstressreaktion in Proteobakterien darstellt. Insgesamt wirft diese Arbeit Licht auf die RNA-Landschaft des krebsassoziierten Bakteriums und führt zur Entdeckung einer konservierten globalen Stressantwort, die aus einem kodierenden und einem nicht-kodierenden Arm besteht. Die Entwicklung neuer genetischer Werkzeuge hat nicht nur zu dieser Entdeckung beigetragen, sondern bietet auch die Möglichkeit, die Molekular- und Infektionsbiologie dieses rätselhaften Bakteriums weiter zu entschlüsseln.…