Jan Humrich

• Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt diePhosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.…
• Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splicePhosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated.…