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Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle für die Virulenz von Legionella pneumophila
(2000)
Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein fakultativ intrazelluläres, ubiquitär vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilität der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen können, ist bisher noch nicht geklärt. Um etwas über noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region näher charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst kürzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide“-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adhärenz, Invasion, intrazellulärer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle für das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilitätsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gewählten Versuchsbedingungen bezüglich des Adhärenzvermögens der Stämme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz für die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgeprägt. Hinsichtlich der intrazellulären Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings führte vermutlich die Reduktion der Invasivität zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream“-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp überlappend, das Gen motB an, welches für den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilität an Vorgängen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adhärenz und die intrazelluläre Vermehrung nicht beeinträchtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst kürzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream“ auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabhängig reguliert werden.
Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht.
Pläne zur Dezentralsierung sind ein integrierter Bestandteil der Gesundheitssektorreform in einer zunehmenden Anzahl von Ländern. Die Fähigkeit derartiger Reformen, die Qualität und Effizienz des Gesundheitssystem zu verbessern, ist nur durch begrenzte wissenschaftliche Evidenz untermauert. Diese Studie beabsichtigt die Auswirkungen der Dezentralisierung auf ein spezielles Feld der Seuchenkontrolle, die Leprakontrolle, in Kolumbien und Brasilien zu untersuchen. Sie analysiert die zuzuordnende Gesetzgebung, epidemiologische Indikatoren und lokale Publikationen. Zudem wurden 39 semi-strukturierte Interviews mit Schlüsselinformanten durchgeführt. In beiden Ländern stellte die Devolution der technischen Verantwortlichkeit und der finanziellen Ressourcen die implementierte Form der Dezentralisierung dar. Der Zugang zu präventiven und kurativen Diensten wie auch die Einbindung der Bevölkerung in Entscheidungsprozesse verbesserten sich nur in Brasilien eindeutig. Die Dezentralisierung zu privaten Gesundheitsdiensten in Kolumbien hatte zweifelhafte Auswirkungen auf die Qualität der Leistungen und mehr noch auf die öffentliche Gesundheitsvorsorge (Public Health). Der Finanzfluss (einschließlich der Finanzadquisition durch staatliche Steuern statt durch Versicherungsgesellschaften) schien in Brasilien besser kontrolliert zu sein. Leprakontrolle in Brasilien profitierte von der Dezentralisierung, in Kolumbien nahm sie massiven Schaden.