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ResearcherID
- D-1221-2009 (1)
- J-8841-2015 (1)
- N-2030-2015 (1)
In a variety of established tumour cell lines, but also in primary mammary epithelial cells metalloprotease-dependent transactivation of the EGFR, and EGFR characteristic downstream signalling events were observed in response to stimulation with physiological concentrations of GPCR agonists such as the mitogens LPA and S1P as well as therapeutically relevant concentrations of cannabinoids. Moreover, this study reveals ADAM17 and HB-EGF as the main effectors of this mechanism in most of the cancer cell lines investigated. However, depending on the cellular context and GPCR agonist, various different members of the ADAM family are selectively recruited for specific ectodomain shedding of proAR and/or proHB-EGF and subsequent EGFR activation. Furthermore, biological responses induced by LPA or S1P such as migration in breast cancer and HNSCC cells, depend on ADAM17 and proHB-EGF/proAR function, respectively, suggesting that highly abundant GPCR ligands may play a role in tumour development and progression. Moreover, EGFR signal transactivation could be identified as the mechanistic link between cannabinoid receptors and the activation of mitogen activated protein kinases (MAPK) ERK1/2 as well as pro-survival Akt/PKB signalling. Depending on the cellular context, cannabinoid-induced signal cross-communication was mediated by shedding of proAmphiregulin and/or proHB-EGF by ADAM17. Most importantly, our data show that concentrations of THC comparable to those detected in the serum of patients after THC administration accelerate proliferation of cancer cells instead of apoptosis and thereby may contribute to cancer progression in patients.
Die in dieser Arbeit etablierte Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM ermöglicht es, das Genom von pathogenen Bakterien zu mutagenisieren und die so generierte Mutantenbank im high-throughput-Format auf Gene zu untersuchen, die unter bestimmten Bedingungen für das infektiöse Potential oder für das Überleben dieser Keime von Bedeutung sind. Die Grundlage von IDM bildet ein konditional replizierender Vektor, in den eine Genbank des Wirtsorganismus kloniert wird und der unter nicht-permissiven Replikationsbedingungen mittels homologer Rekombination ins Chromosom integriert und dadurch einen Gen-Knockout bedingt. Das IDM-Verfahren weist gegenüber der Transposon-Mutagenese den Vorteil auf, dass das Genom nach dem Zufallsprinzip saturierend mutagenisiert werden kann und dass keine hot spots für die Insertion auftreten. Darüber hinaus kann der mutierte Genlocus nach Screening der Mutanten schnell per PCR identifiziert werden, indem die Exzision des Vektors induziert und das klonierte, homologe Fragment sequenziert wird. Die Insertion des Vektors ins Chromosom und damit der Gen-Knockout ist selbst ohne Selektionsdruck sehr stabil, so dass die Mutanten im Zellkultur- oder Tier-System untersucht werden können. IDM wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf Salmonella enterica Serovar typhimurium und Listeria monocytogenes angewandt. Die Applikation von IDM auf S. typhimurium hatte zum Ziel, Gene zu identifizieren, deren Produkte für das Überleben dieses Gram-negativen Keims in Vollmedium unter Laborbedingungen essentiell sind. Ausgehend von 14.000 S. typhimurium Fragmentbank-Klonen konnten durch Induktion der Integration des Vektors 262 Klone identifiziert werden, für welche die Mutation zu einem lethalen Phänotyp führte. 116 der 262 entsprechenden Proteine konnte durch IDM erstmalig eine essentielle Funktion für die Vitalität von S. typhimurium zugewiesen werden. Darunter befinden sich sowohl Proteine, die homolog sind zu Proteinen anderer klinisch-relevanter Keime, als auch Proteine, die Salmonella-spezifisch sind. Der größte Teil der identifizierten Proteine ist in die Speicherung und Weitergabe von Information (Transkription, Translation, DNA-Reparatur etc.) involviert, viele sind allerdings auch Proteine unbekannter Funktion. Die Essentialität der durch IDM identifizierten Gene konnte durch die Konstruktion von konditional lethalen Mutanten bestätigt werden. IDM ist demnach das erste Mutagenese-Verfahren, welches das essentielle Gen-Set von S. typhimurium für das Überleben in Vollmedium zu definieren vermochte. Basierend auf den IDM Daten konnte es auf 511 Gene, d.h. auf 11 % des Gesamt-Genoms beziffert werden. Bei der Applikation von IDM auf L. monocytogenes lag der Fokus auf der Identifizierung von Genen, die für das Überleben dieses Gram-positiven Bakteriums im Zytosol von eukaryontischen Zellen von Bedeutung sind. Im Screening von bis dato 720 der 1491 L. monocytogenes Insertionsmutanten auf ein attenuiertes Replikationsverhalten in Caco-2 Zellen konnten 69 Mutanten selektioniert werden. In diesen Mutanten sind Gene ausgeknockt, deren Produkte hauptsächlich wichtige Funktionen in der Nährstoffbereitstellung, in der Energiesynthese und im Metabolismus inne haben. Mit der Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM steht ein molekulares Werkzeug zur Verfügung, welches für die Identifzierung neuer targets für sowohl Breitband- als auch Spezies-spezifische Antiinfektiva eingesetzt werden kann und welches unbekannten Proteinen eine biologische Funktionen zuweisen kann.
HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären.
Säugerzellen sind die bevorzugten Wirtszellen zur Produktion komplexer biopharmazeutischer Proteine, da die post-translational durchgeführten Modifikationen sowohl in funktionaler als auch in pharmakokinetischer Hinsicht humankompatibel sind. Ein großes Problem bei der Etablierung von Zelllinien mit hoher Expression des gewünschten Proteins ergibt sich aus der willkürlichen und ungerichteten Integration des rekombinanten Vektors in transkriptionsaktive oder -inaktive Loki des Wirtszellgenoms. Dadurch erhält man eine Population von Zellen, die völlig unterschiedliche Expressionsraten des heterologen Gens aufweist, wobei die Produktivität der Zellen in der Regel einer Normalverteilung folgt. Zur Identifizierung von Zellklonen, die eine sehr hohe Expression des heterologen Produktgens aufweisen, muss deshalb eine Vielzahl von Klonen überprüft und getestet werden, resultierend in einem hohen Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand. Optimierungen des zur Transfektion eingesetzten Vektorsystems zielen deshalb darauf ab, durch geeignete Selektionsstrategien den Anteil von Hochproduzenten in der transfizierten Zellpopulation zu erhöhen und somit den Aufwand in der Klonidentifizierung zu reduzieren. Die Entwicklung eines derartigen Expressionssystemes ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zwei alternative Strategien, die beide auf der Beeinträchtigung des Selektionsmarkers basieren wurden untersucht. Die Beeinträchtigung des Selektionsmarkers sollte bewirken, dass Klone mit einer Integration in transkriptionsinaktiven Genloki die Selektion nicht überstehen und absterben, während Klone mit einer Integration in transkriptionsaktiven Genloki die Beeinträchtigung des Selektionsmarkers durch eine erhöhte Expression kompensieren können. Diese Klone sollten überleben und gleichzeitig eine hohe Produktexpression aufweisen. Eine der Strategien beruhte auf der Beeinträchtigung der Enzymfunktion des Selektionsmarkers, indem Mutationen in das Leseraster des Enzyms eingeführt wurden. Diese Arbeit zeigt, dass die Verwendung von mutierten Neomycin Phosphotransferase-Varianten als Selektionsmarker in CHO-DG44-Zellen für die Anreicherung von Hochproduzenten geeignet ist. Eine weitere Möglichkeit, die Expressionsrate eines stabil integrierten Produktgens zu erhöhen, ist der Einsatz von cis- und transwirkenden genetischen Elementen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Sequenz aus dem Genom von CHO-Zellen auf mögliche expressionssteigernde Wirkung hin untersucht (Transcription Enhancing TE-Element). Es konnte gezeigt werden, dass dieses TE-Element die Expression eines rekombinanten Antikörpers in stabil transfizierten CHO-DG44-Zellpools verdoppelt.
Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es möglich sein, einen Synapsin-„Rescue“ Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Phänotyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt veröffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu klären, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen Fällen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der früheren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleiß-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen bestätigten die RT-PCR Sequenzen die früheren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch führt zu einer Veränderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht für ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleinsäure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits für verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die für die Reaktion benötigte doppelsträngige Sekundärstruktur der RNA kann durch die Sequenz der prä-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence“ (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabwärts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten Stämmen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in späteren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu können wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgeführt werden können. Zur phänotypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive Rückkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm für Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf phänotypische Veränderungen überprüft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringfügigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out Mäusen für SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS Männchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin’sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Phänotypen könnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erklären. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verfügbaren Gal4 Linien den Calciumsensor für eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zugänglich machen. In weiterführenden Arbeiten konnte die Funktionalität des Fusionsproteins überprüft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgeführt werden.
IL-4 und IL-13 sind wichtige Faktoren bei der Entwicklung allergischer Erkrankungen. In dieser Arbeit wird die Rolle von IL-4 und IL-13 in einem Maus-Modell für allergisches Asthma während der allergischen Sensibilisierung und in einer etablierten asthmatischen Erkrankung untersucht. Weiterhin wird die Rolle von IL-4 und IL-13 in frühen Stadien der atopischen Dermatitis in einem Maus-Modell betrachtet. In einem Maus-Modell für allergisches Asthma mit anhaltender IgE-Synthese und einer persistierenden allergischen Atemwegspathologie konnte gezeigt werden, dass die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems während der allergischen Sensibilisierung zu einer dosisabhängigen Reduktion der allergen-spezifischen IgE-Titer, zur Inhibition der Atemwegseosinophilie, zur Reduktion der IL-5-Spiegel in der BAL und zu einer gesenkten Anzahl von IL-4 sezernierenden CD4+ T-Zellen. Weiterhin konnte durch die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems die Becherzellmetaplasie signifikant gesenkt werden. Die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems nach der Entwicklung der allergischen Atemwegspathologie führte hingegen nicht zu einer signifikanten Reduktion der gemessenen Allergie-Parameter. Daraus lässt sich schließen, dass IL-4 und IL-13 nur eine untergeordnete Rolle in einer etablierten Allergie spielt. Diese Ergebnisse sind insbesondere wichtig, wenn man über das Verwendungspotential eines IL-4/IL-13-Inhibitors in der Allergie-Therapie bei asthmatischen Patienten spekuliert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die NC/Nga-Maus ein Modell für die humane atopische Dermatitis darstellt. NC/Nga Mäuse, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden, entwickeln makroskopische und histologische Hautpathologien, die der humanen atopischen Dermatitis sehr ähneln. Weiterhin entwickeln unter konventionellen Bedingungen gehaltenen NC/Nga Mäuse hohe IgE-Titer im Serum, die mit einer erhöhten Produktion an Th2-Zytokinen verbunden war. Die Inhibition des IL-4/IL-13-Systems führte in diesem Modell jedoch nicht zu einer Reduktion von Symptomen und Pathologien der humanen atopischen Dermatitis. Deswegen kann man spekulieren, dass die Inhibition des IL-4/IL-13-Systems zu einem zu späten Zeitpunkt erfolgte. Des Weiteren kann eine nicht-standardisierte Sensibilisierung bei Mäusen, die in einer konventionellen Tierhaltung gehalten werden, zu einem sehr unterschiedlichen Ausbruch der Dermatitis führen. Deshalb werden weitere Tierversuche mit einer höheren Anzahl von Tieren, die zwischen den Würfen randomisiert werden, nötig sein, um die Rolle von IL-4 und IL-13 in der atopischen Dermatitis zu klären.
Das menschliche MHS2 Gen ist eine sehr gut charakterisierte Komponente des Mismatch-Reparatur-Systems (MMR) und häufig mit der HNPCC Erkrankung assoziiert. Der Mechanismus über den MSH2 an der Karzinomentwicklung beteiligt ist, sind Defekte in der DNA-Reparatur. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen in den kodierenden Regionen dieses Gens direkt in die Mikrosatelliteninstabilität involviert sind. Generell ist MSH2 ein Teil des postreplikativen Reparatursystems der Zellen, und schützt so vor der Akkumulation von Mutationen. Dadurch wird die genetische Stabilität und Integrität gewährleistet. Ein anderer Teil der zellulären Krebsabwehr ist das p53 Tumorsuppressorgen. Ein möglicher DNA Schaden, der in der Lage ist, p53 zu aktivieren, ist UV-Licht. Eine weitere gut charakterisierte Komponente der zellulären UV Reaktion ist der Transkriptionsfaktor c-Jun. Ziel der Arbeit war es die Regulation und Signalfunktion von MSH2 näher zu charakterisieren. Dazu wurde der Promotor des Gens in ein Luziferase Promotorgenkonstrukt kloniert. Dieses Konstrukt wurde in menschliche Keratinozyten transfiziert, die nachfolgend mit UV bestrahlt wurden. Es konnte eine zeit- und dosisabhängige Hochregulation von MSH2 gezeigt werden. Diese Transkriptionserhöhung wurde von p53 initiiert, denn durch eine gezielte Mutation der p53-Bindungsstelle im MSH2 Promotor war dieser Effekt vollkommen aufgehoben. Interessanterweise war dieser Effekt von einem zusätzlichen Faktor abhängig, ohne den keine Hochregulation erkennbar war. Verantwortlich hierfür war der Transkriptionsfaktor c-Jun. Dadurch konnte eine funktionelle Interaktion von p53 und c-Jun in der transkriptionellen Aktivierung von hMSH2 gezeigt werden. Dieser zeit- und dosisabhängige Effekt war sowohl auf RNA als auch auf Proteinebene nachvollziehbar. Der größte Anstieg war bei 50 J/m2 zu verzeichnen, wohin gegen bei Verwendung von 75 J/m2 die Transkriptmenge geringer wurde, um bei 100 J/m2 erneut anzusteigen. Um diesen erneuten Anstieg des Proteins näher zu beschreiben wurden bei den stark bestrahlten Zellen TUNEL-Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an MSH2 Protein und an TUNEL-positiven apoptotischen Zellen. Um weiter zu zeigen, dass der zweite Anstieg des Proteins nicht mit einer Reparaturfunktion verbunden ist, wurde ein biochemisch basierter Test durchgeführt, welcher die Reparaturkapazität semiquantitativ beschreibt. Dabei konnte klar gezeigt werden, dass die mit 100 J/m2 bestrahlten Zellen keine Reparaturfunktion mehr erfüllen. FACS-Analysen und Zellfärbungen gegen Annexin V und mit Propidiumiodid bestätigten die stattfindende Apoptose in den Zellen. Eine weitere Komponente des MMR-Systems ist MSH6. MSH6 bildet mit MSH2 ein Dimer, welches den Fehler in der DNA erkennt und das weitere Reparaturprogramm einleitet. Die Expression dieses Proteins konnte nur bis zu einer Dosis von 50-75 J/m2 UV nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu MSH2 war MSH6 nicht in 100 J/m2 bestrahlten Keratinozyten detektierbar. Um über die Lokalisation dieser Proteine mehr zu erfahren wurden Immunfärbungen gegen MSH2 durchgeführt. Es zeigte sich eine Translokation des Proteins vom Kern in das Zytoplasma in Korrelation zum zunehmenden DNA-Schaden durch höhere Dosen an UV-Licht. Dies stellt eine mögliche Verbindung zwischen dem Mismatch-Reparatursystem und apoptotischen Signalwegen dar.
In der vorliegenden Arbeit wurde nach Wegen gesucht, den Import peroxisomaler Matrixproteine, der über ein peroxisomales Targeting Signal Typ 2 gesteuert wird, zu messen. Es war vorgesehen, in erster Linie einen enzymchemischen Nachweis zu etablieren, da diese Methode den Vorteil einer Quantifizierbarkeit der Aktivität der gemessenen Enzyme bietet und somit Rückschlüsse auf den Grad einer Beeinträchtigung des Importes zulassen würden. Von dem Test wurde eine Sensitivität gefordert, die eine Messung auch in Homogenaten kultivierter Zellen, insbesondere von CHO-Zellen, erlaubt. Dieses war deswegen gefordert, weil der Test zur Charakterisierung induzierter CHO-Zell-Mutanten eingesetzt werden sollte, die die Merkmale eines PTS 2-Import-Defektes aufweisen. Dieser Nachweis sollte durch eine Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase erfolgen. Dieses Enzym ist eines von drei derzeit bekannten Proteinen, die eine PTS 2 besitzen und über diesen Weg importiert werden. Das Substrat für die Hydroxylase war als Phytansäure mit einer 2,3-3H-Markierung in der Arbeitsgruppe vorrätig und wurde für den Test zum CoA-Thioester chemisch umgesetzt. Nach erfolgter enzymatischer Umsetzung von Phytonoyl-CoA zu a-Hydroxyphytanoyl-CoA durch die Hydroxylase waren dann sowohl Edukt wie auch das Produkt durch eine radioaktive Markierung gekennzeichnet und konnten nach einer dünnschicht-chromatographischen Trennung über Kieselgel durch einem Radiodünnschichtscanner nachgewiesen werden. Zunächst wurde mit Hilfe von Homogenaten aus Rattenlebergewebe ein bereits beschriebenes Verfahren zur Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase optimiert. Es stellte sich jedoch heraus, daß die Sensitivität dieses Testes nicht hoch genug ist, um die Hydroxylase-Aktivität in Homogenaten kultivierter CHO-Zellen zu messen. An dieser Stelle wurde die Etablierung eines immunchemischen Nachweises begonnen. Hierzu sollten Antikörper gegen die Hydroxylase des chinesischen Zwerghamsters, des Ursprungsorganismus der CHO-Zellen, generiert werden. Eine Reinigung des Enzyms kam nicht in Betracht, weil die Hamster nicht im Labortierhandel erhältlich waren. Folglich musste die cDNA der Hydroxylase aus einer Hamster-cDNA-Bank kloniert werden, nachdem sie durch ihre bekannten Homologe aus Mensch und Maus identifizierbar war. In den verfügbaren cDNA-Banken fand sich keine vollständige Sequenz, so daß mit einer partiellen Sequenz ohne 5´-Ende weitergearbeitet werden musste. Es bot sich im Institut die Möglichkeit, aus dieser Sequenz Pepetide zu bestimmen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit stark immunogen wirken. Solche Peptide wurden synthetisiert und nach Koppelung an Trägerproteine neuseeländischen weißen Kaninchen geimpft. Im Elisa wies das Antiserum zum Zeitpunkt seiner Gewinnung einen Titer von etwa 1:10000 auf, zeigte aber im Westernblot neben einer starken Detektion in Laufweite der Hydroxylase auch eine unspezifische Anfärbung der Proben. In der nun durchgeführten Affinitätsreinigung des Antiserums über einer mit den antigenen Peptiden beladenen Säule tauchte das Problem auf, daß die Antikörper so fest binden, daß sie von ihren Antigenen nicht mehr ohne dentaturierende Bedingungen zu lösen waren. Für die weitere Arbeit sollte sich nun eine affinitätschromatographische Reinigung über Peptide, die den Antikörper mit geringerer Avidität binden, anschließen, so daß nach Trennung der Immunkomplexe native Antikörper isoliert werden könnten. Hierzu wäre ein Epitop-mapping wünschenswert, damit auf dieser Grundlage Peptide mit den geforderten Eigenschaften synthetisiert werden können.
The aim of current work was contribution to the long-term ongoing project on developing human IL-5 agonists/antagonists that intervene with or inhibit IL-5 numerous functions in cell culture and/or in animal disease models. To facilitate design of an IL-5 antagonist variant or low-molecular weight mimetics only capable of binding to the specific receptor alpha chain, but would lack the ability to attract the receptor common β-chain and thus initiate receptor complex activation it is necessary to gain the information on minimal structural and functional epitopes. Such a strategy was successfully adopted in our group on example of Interleukin 4. To precisely localize minimal structural epitope it is essential to have structure of the ligand in its bound form and especially informative would be structure of complex of the ligand and its specific receptor alpha chain. For this purpose large quantities (tens of milligrams), retaining full biological activity IL-5 and extracellular domain of IL-5 specific receptor α-chain were expressed in a bacterial expression system (E.coli). After successful refolding proteins were purified to 95-99% Stable and soluble receptor:ligand complex was prepared. Each established purification and refolding procedures were subjected to optimization targeting maximal yields and purity. Produced receptor:ligand complex was applied to crystallization experiments. Microcrystals were initially obtained with a flexible sparse matrix screening methodology. Crystal quality was subsequently improved by fine-tuning of the crystallization conditions. At this stage crystals of about 800x150x30µm in size can be obtained. They possess desirable visible characteristics of crystals including optical clarity, smooth facecs and sharp edges. Crystals rotate plane polarized light reflecting their well internal organization. Unfortunately relative slimness and sometimes cluster nature of the produced crystals complicates acquisition of high-resolution dataset and resolution of the structure. With some of obtained crystals diffraction to a resolution up to 4Å was observed.
Netzhauterkrankungen, wie Retinitis pigmentosa, sind in der Bevölkerung weit verbreitet (1,5 Millionen weltweit). Gewöhnlich berichten die Betroffenen über Nachtblindheit und periphere Gesichtsfeldausfälle. Häufig führt diese Erkrankung, die durch eine fortschreitende Degeneration von Photorezeptoren verursacht wird, zur vollständigen Erblindung. Bisher beschrieb man den pathologischen Prozess vor allem an rd-Mäusen. Allerdings setzt bei diesen die Degeneration sehr früh ein. Somit ist die Übertragbarkeit auf den Menschen erschwert, da abgesehen von wenigen Ausnahmen, der Verlust von Photorezeptoren hier erst im zweiten Lebensabschnitt beginnt. Deshalb war es interessant, im Rahmen dieser Arbeit anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus ein Modell zu untersuchen, das ähnlich dem menschlichen System, zunächst eine intakte Morphologie zeigt. Dadurch war es möglich eine genaue zeitliche Abfolge der Degeneration zu dokumentieren. Dies kann medizinisch zur Entwicklung eines Therapieansatzes genutzt werden, der bereits zu Beginn der Degeneration greift, und damit den fortlaufenden Prozess zum Stillstand bringen kann. Die CNGA3-/-Rho-/- Maus repräsentiert ein System funktionsloser Photorezeptoren, bei dem der zyklische Nukleotid-Kanal (CNGA3) der Zapfenaußensegmente und das Rhodopsin (Rho) der Stäbchenaußensegmente ausgeschaltet wurde. Bestätigt wurde dies durch ein Elektroretinogramm mit einer negativen Photoantwort bezüglich Zapfen und Stäbchen. Die Degeneration führt zu einem vollständigen Verlust aller Photorezeptoren nach drei Monaten (Pm3). Zum Zeitpunkt Pw4 konnte, vergleichbar dem Wildtyp, eine intakte äußere Retina nachgewiesen werden, bei der lediglich die äußeren Stäbchensegmente fehlen. Die synaptischen Kontakte zwischen den Terminalien der Photorezeptoren, der Horizontalzellen und Bipolarzelldendriten waren normal entwickelt und Stäbchenendigungen als auch Zapfenendfüßchen bildeten funktionelle Triaden aus. Bei den Stäbchenendigungen konnte mit zunehmender Degeneration (Pw5, Pw6) eine Akkumulation synaptischer Bänder und postsynaptischer Elemente beobachtet werden. Im Zeitraum Pw4-7 zeigten sowohl die Zapfen, als auch die Horizontalzellen und Stäbchen-Bipolarzellen, eine bemerkenswerte strukturelle Plastizität. Obwohl durch die Photorezeptoren kein Lichtsignal vermittelt wurde, konnten präsynaptische Marker (bassoon) und postsynaptische Glutamatrezeptoren (GluR1, mGluR6) an den Photorezeptorterminalien nachgewiesen werden. Dies lässt die Vermutung zu, dass eine Transmitterfreisetzung theoretisch möglich wäre. Darüber hinaus konnte im Zeitraum von 12 Monaten keine nennenswerte Auswirkung auf die IPL beobachtet werden: Amakrin- und Zapfen-Bipolarzellen waren normal stratifiziert und die Expression der Transmitter-Rezeptoren zeigte ein charakteristisches Verteilungsmuster. Außerdem war die Ultrastruktur von konventionellen und Bandsynapsen der des Wildtyps vergleichbar. Darüber hinaus bildeten sowohl Amakrinzellen, als auch Bipolar- und Ganglienzellen, Fortsätze in die INL hinein. Allgemein zeigt die immunhistochemisch und ultrastrukturell untersuchte CNGA3-/-Rho-/- Maus, dass weder funktionell aktive Photorezeptoren noch Licht eine stimulierende Wirkung auf die Ausbildung synaptischer Strukturen und die Expression verschiedener Rezeptoren haben.
Immuntherapien auf der Basis gut charakterisierter, tumorspezifischer Antigene stellen ein vielversprechendes Konzept der Tumortherapie dar. Ein potentielles Antigen für immuntherapeutische Strategien sollte möglichst tumorspezifisch exprimiert sein und es sollte einen Hinweis auf bereits erfolgte Immunantworten im Patienten geben, wie z.B. die Existenz spezifischer Antikörper oder zytotoxischer T-Zellen (CTL). Eine membranständige Lokalisation ist für die Verwendung von Tumorantigenen in Antikörpertherapien notwendig. Während für viele Neoplasien Tumorantigene bekannt sind, wurden für das kutane T-Zell Lymphom (CTCL) bislang nur sehr wenige tumorassoziierte Antigene identifiziert. Die Antigene se57-1, se70-2, cTAGE-1 und GBP-5ta wurden durch serologisches Durchsuchen einer Phagenbank aus Testis- bzw. Tumorgewebe (SEREX-Methode) identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunogenität dieser vier Tumorantigene in einem neu entwickelten ELISA mit CTCL-, Parapsoriasis-, Melanom- und Kontrollseren untersucht. se70-2 und cTAGE-1 Protein erkannten nur wenige Patientenseren. Für GBP-5ta konnte dagegen eine signifikant höhere Reaktivität der CTCL-Seren im Vergleich zu den Kontrollseren ermittelt werden. Bei se57-1 waren die CTCL- und die Parapsoriasisseren hoch signifikant verschieden zu den Kontrollseren. Dieses putativ virusinduzierte Antigen sollte in zukünftigen Arbeiten auf seine mögliche Funktion als Entzündungsmarker weiter untersucht werden. Für das CTCL sollten weitere Kombinationen von Tumorantigenen auf ihren diagnostischen Wert in der Serologie getestet werden. Des Weiteren konnten in dieser Arbeit die CTCL assoziierten Antigene se2-2 und die GBP-5 Familie genauer charakterisiert werden: Die Expressionsanalyse von se2-2 Protein und mRNA in verschiedenen Normalgeweben zeigte ein differentielles Expressionsmuster. Im SEREX wurde se2-2 serologisch spezifisch nur von CTCL-Seren erkannt. Möglicherweise wäre se2-2 eine geeignete Zielstruktur für die serologische Diagnostik des CTCL. Aufgrund seiner fehlenden Tumorspezifität ist se2-2 für die Immuntherapie jedoch wenig geeignet. Die neu identifizierte GBP-5 Familie besteht aus mindestens drei Spleißvarianten (GBP-5ta, GBP-5a und GBP-5b), die zwei Proteine, GBP-5ta und GBP-5a/b, kodieren. GBP-5ta ist gegenüber GBP-5a/b C-terminal um 97 AS verkürzt. GBP-5ta mRNA wird differentiell exprimiert, während GBP-5ta Protein PBMC-spezifisch exprimiert wird. In CTCL-Tumorgewebe konnte GBP-5ta nachgewiesen werden, wogegen in Melanomzelllinien fast ausschließlich GBP-5a/b vorliegt. Gegen GBP-5ta konnte eine humorale Immunantwort bei CTCL-Patienten nachgewiesen werden: Im SEREX wurde GBP-5ta nur von CTCL-Patientenseren erkannt. Auch in der ELISA-Methode reagierten signifikant mehr Patientenseren als Kontrollseren mit GBP-5ta. Die höhere Immunogenität von GBP-5ta gegenüber GBP-5a/b im SEREX unterstreicht die Bedeutung der verkürzten Variante. Ob CTL gegen GBP-5ta präsentierende Zellen existieren, wird momentan untersucht. Die GBP-5 Spleißvarianten sind hoch homolog zur Familie der GTPasen, zu denen auch das Onkogen Ras gehört. Das verkürzte Protein von GBP-5ta könnte durch den Verlust der C-terminalen Domäne seine eventuelle anti-proliferierende Funktion verlieren. Ein Knock-out Versuch von GBP-5 könnte die Bedeutung von GBP-5 in der Tumorzelle untersuchen. Darüber hinaus wäre es vielversprechend, die GTPase Aktivität der GBP-5 Varianten in einem GTP-Bindungs-Assay zu überprüfen. GBP-5ta könnte eine mögliche Ursache des unkontrollierten Wachstums der Tumorzelle und somit eine vielversprechende potentielle Zielstruktur für therapeutische Ansätze für das CTCL sein.
SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt.
In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites.
Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf.
Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Domänen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).
Density arrested AKR-2B cells die rapidly in response to serum starvation or treatment by Anisomycin. Cell death is associated with typical hallmarks of apoptosis including membrane blebbing and chromatin condensation but lacks energy dissipation in mitochondria and intranucleosomal fragmentation. During apoptosis a considerable DEVDase activity has been detected which seemed to be represented by a single enzyme. This enzyme had typical effector caspase characteristics, like caspase-3, but exhibited an unusual high KM values of ~100 µM and its large subunit exhibited a molecular weight of 19 kDa, instead of expected 17 kDa. In the present study, this enzyme was identified to be caspase-3 with the help of the generation of recombinant mcaspase-3 protein. N-terminal sequencing of the recombinant mcaspase-3 protein revealed that its prodomain cleavage site differs from that in the human homologue (Asp-9 instead of Asp-28). Thus the large subunit of active caspase-3 was found to be 19 kDa. Furthermore the KM value of recombinant mcaspase-3 was ~100 µM in perfect agreement with that found in cell extracts. Affinity labeling in combination with 2D-GE confirmed that indeed caspase-3 is activated as the main executioner in AKR-2B cells during apoptosis. Since the receptor mediated pathway has already been excluded previously [129], a possible involvement of mitochondria mediated pathway in the activation of caspase-3 was examined. Gel filtration experiments revealed that caspase-3 is mainly eluted as free enzyme and in lower levels within the differently sized high molecular weight complexes of ~600 kDa and 250 kDa in response to serum starvation or Anisomycin treatment. Though the apparent molecular weight of the complexes containing caspase-3 are in accordance with recently published data, they were devoid of Apaf-1 and caspase-9. Apparently, mitochondria mediated pathway is also not involved since neither formation of high molecular weight complexes of Apaf-1 nor cleavage of caspase-9 was observed. Thus, the activation of caspase-3 is caused by a noncanonical pathway during apoptosis. In addition a new 450 kDa complex containing activated caspase-6 was found in response to serum starvation which is clearly separated from caspase-3 containing complexes. Generally caspase-3 has been found to be responsible for most of the morphological changes during apoptosis. One of those is intranucleosomal fragmentation. Although caspase-3 was found to be the main executioner caspase in AKR-2B cells the lack of the intranucleosomal fragmentation led to examine its localization. As detected by overexpression of the Caspase-3-GFP fusion construct in AKR-2B, procaspase-3 was localized in the cytoplasm, wheras the active caspase-3 was mainly found in the membrane blebs and partially in the cytoplasm. Clearly no nuclear localization of active caspase-3 was detected. These data gave first hints on the mechanism of degradation of AKR-2B cells demonstrating that cytoplasmic membrane is the primary site of activation of caspase-3. The possible role of caspase-12 and ER stress mediated pathway of apoptosis was also examined in AKR-2B cells. Kinetic studies showed that caspase-12 is activated at the same time together with caspase-3 in response to serum starvation or Anisomycin treatment resulting in two cleavage products of 47 kDa and 35 kDa, respectively. It was therefore examined whether these two caspases were eluted in the same complexes. Gel filtration experiments revealed that caspase-12 is released as free enzyme during apoptosis. To date all the studies have identified that caspase-12 is specifically activated in response to ER stress. After serum starvation or Anisomycin addition there was no increase of the protein expression level of the chaperone protein Grp 78 which is known to be higly elevated in response to ER stress indicating that both treatments did not lead to ER stress. In contrast treatment with ER stressor substances i.e. Thapsigargin, A23187 (ionophore) induced an ER stress in AKR-2B which lead to unspecifically degradation of caspase-12. Thus it is unlikely that caspase-12 is activated in response to ER stress in AKR-2B cells. However, after the in vitro addition of recombinant caspase-3 to cytosolic extracts caspase-12 is cleaved into 47 kDa and 35 kDa fragments similiar to those observed in vivo. In conclusion the present data demostrated that caspase-12 is activated in AKR-2B cells during apoptosis triggered through pathways that do not involve (the) ER stress and provided evidence that caspase-3 might be involved in activation of caspase-12. Thus the present study in AKR-2B cells gives hints for the existence of additional pathways for apoptosis other than the classical ones.