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In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren.
In der vorliegenden Studie wurde die Remineralisationswirkung von Fruchtgummiprodukten, die mit einer neuartigen calciumhaltigen Salzhydratschmelze angereichert waren, vergleichend in-vitro und in-situ getestet. Als Vergleich diente ein handelsübliches Fruchtgummiprodukt ohne Zusatz der zu testenden Salzhydratschmelze. Die remineralisierende Wirkung der calciumreichen Salzhydratschmelze beruhte auf dem Prinzip der forcierten dynamischen Remineralisation. Um die Mineralisationseffekte messbar zu machen, wurden künstliche, standardisiert hergestellte Schmelzplättchen den unterschiedlichen Fruchtgummiprodukten ausgesetzt und die Mineralisationseffekte in regelmäßigen Abständen gravimetrisch und radiographisch gemessen, sowie abschließend einer Härtemessung unterzogen. Dabei ergaben sich zusammengefasst folgende Resultate, die die Quantität an eingebautem Mineral betreffen: 1.Der Effekt aller salzhydratschmelzehaltigen Fruchtgummis ist signifikant größer als der der Plazebopräparate 2.Die schmelzehaltigen Fruchtgummis bewirken einen signifikant größeren Mineraleinbau als herkömmliche Fluoridpräparate in Zahnpasten, wie aus früheren gleichgearteten Untersuchungen abgeleitet werden kann. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass trotz des Verzehrs zuckerhaltiger Fruchtgummiprodukte das Gleichgewicht zwischen Demineralisation und Remineralisation an der Zahnoberfläche nicht nur statiönär gehalten wird, sondern sogar zugunsten der Remineralisation verschoben wird, sofern die Fruchtgummiprodukte mit einer calciumhaltigen Salzhydratschmelze angereichert sind.
In dieser Arbeit untersuchten wir den Einfluss von Testosteron auf den myokardialen Ischämie- Reperfusions-Schaden und den entsprechenden intrazellulären Calciumstoffwechsel ([Ca2+]i ). Non-orchiektomierte geschlechtsreife männliche Wistar-Ratten wurden zufällig Gruppen mit verschiedener hormoneller Behandlung zugewiesen; einer Placebo-Gruppe, einer Gruppe mit Testosteronundecanoat-Behandlung und einer Gruppe mit 5- Dihydrotestosteron-Behandlung. Zusätzlich wurden in weiteren Serien orchiektomierte Ratten mit Placebo behandelt. Zwei Wochen nach der jeweiligen hormonellen Behandlung wurden die Herzen entnommen und in eine Langendorff-Apparatur platziert. Die isolierten, mit Puffer perfundierten Herzen wurden 30 Minuten lang einer no-flow-Ischämie-Phase und anschließend einer 30minütigen Reperfusionsphase ausgesetzt. Die Wiederherstellung der myokardialen Funktion wurde gemessen durch Untersuchungen des prä- und postischämischen linksventrikulären (LV) systolischen bzw. diastolischen Drucks, des koronaren Perfusiondrucks und der Veränderungen der [Ca2+]i (mittels Aequorin-Lumineszenz-Methode). Calciumregulierende Proteine wurden mittels Westernblotting analysiert. Der Quotient aus linksventrikulärem Gewicht zum Körpergewicht (LVG/KG) stieg unter Testosteronbehandlung im Vergleich zu den orchiektomierten Ratten an. Die Wiederherstellung der kontraktilen Funktion war verbessert bei den mit Testosteron behandelten Tieren: Am Ende der Reperfusion war bei den testosteron-behandelten Ratten der linksventrikuläre systolische Druck höher und der enddiastolische Druck niedriger. Die endischämische [Ca2+]i und die intrazelluläre Calciumüberladung erwiesen sich ebenfalls nach Reperfusion als signifikant niedriger bei den testosteronbehandelten Tieren im Vergleich zu den orchiektomierten Ratten. Jedoch blieben die Niveaus der calciumregulierenden Proteine unberührt. Zusammenfassend kann man nun sagen, dass die Gabe von Testosteron zur Erhaltung der akuten mechanischen myokardialen Funktion nach globaler Ischämie führt. Dieser begünstigende Effekt war mit einer Verminderung der reperfusionsinduzierten intrazellulären Calciumüberladung assoziiert.
Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden.
Die Technik des optischen Imaging unter Verwendung DNA-codierter Sensoren ermöglicht es, Messungen neuraler Aktivitäten in genetisch definierten Populationen von Neuronen durchzuführen. In der Vielzahl der verschiedenen entwickelten Sensoren konnten die Calciumsensoren bisher das beste Verhältnis zwischen Signal und Rauschen und die beste zeitliche Auflösung aufzeigen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um zwei Typen von Sensoren, zum einen ratiometrische Sensoren, deren Signal auf einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) basiert, und zum anderen um zirkulär permutierte Sensoren, die auf einem modifizierten GFP-Molekül basieren, wobei das Signal auf einer veränderten Protonierung des Chromophors beruht. Beide Arten dieser Sensoren wurden schon erfolgreich zum Messen neuraler Aktivitäten in Nervensystemen verschiedener Tierarten verwendet. Ein Teil dieser Arbeit bestand darin, zu untersuchen, welche Sensoren sich für die Messung an einem lebenden Organismus am besten eignen. Hierfür wurden die Eigenschaften von vier verschiedenen FRET basierten Sensoren und zwei der zyklisch permutierten Sensoren nach Expression im zentralen Nervensystem von Drosophila charakterisiert. Die Sensoren wurden in Neuronen zweiter und dritter Ordnung des olfaktorischen Signalwegs exprimiert und ihre Antworten auf physiologische Duftstimulation oder artifiziell induzierte Depolarisation des Gehirns untersucht. Während die calciumabhängigen Signale der zyklisch permutierten Sensoren in der Regel größer waren als die der FRET basierten Sensoren, zeichneten sich letztere durch ein besseres Signal zu Rausch-Verhältnis aus, wenn Bewegungen der fluoreszierenden Strukturen nicht zu vermeiden waren. Dies war auch der ausschlaggebende Grund für die Verwendung eines FRET basierten Sensors im anschließenden Teil der Arbeit. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt untersucht, den die Paarung eines neutralen Stimulus mit einem bestrafenden Stimulus auf dopaminerge Neurone hat. Eine solche Paarung kann zu einer klassischen Konditionierung führen, einer einfachen Form des Lernens, in welcher das Tier einem ursprünglich neutralen Stimulus einen Wert zuordnet, und dadurch sein Verhalten dem Stimulus gegenüber ändert. Die olfaktorische klassische Konditionierung in Drosophila wird seit vielen Jahren intensiv untersucht, um die molekularen und neuronalen Grundlagen von Lernen und Gedächtnis zu charakterisieren. Dabei hat sich gezeigt, dass besonders die Pilzkörper von essentieller Bedeutung für die Ausbildung eines olfaktorischen Gedächtnisses sind. Während das olfactorische System bei Insekten bereits detailiert analysiert wurde, ist über die Neurone, die den bestrafenden Stimulus vermitteln, nur sehr wenig bekannt. Unter Anwendung des funktionellen optischen Calcium Imaging konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass die Projektionen von dopaminergen Neuronen im Bereich der Loben der Pilzkörper schwach auf die Präsentation eines Duftes, jedoch sehr stark auf eine Stimulation durch einen Elektroschock antworten. Nach mehrmaliger Paarung eines Duftes mit einem Elektroschock während eines Trainings, verlängert sich die Aktivität dieser dopaminergen Neurone auf den bestraften Duft hin im Test ohne Elektroschock drastisch, während die Antwort auf den Kontrollduft keine signifikanten Veränderungen aufweist. Während bei Säugetieren belohnende Reize bei appetitiven Lernvorgängen über dopaminerge Neurone vermittelt werden, spielen bei Drosophila diese Neurone offensichtlich eine Rolle bei der aversiven Konditionierung. Jedoch blieb, auch wenn sich die Rolle des Dopamins im Laufe der Evolution geändert zu haben scheint, die Fähigkeit dieses Neuronentyps, nicht nur auf einen eintreffenden verstärkenden Stimulus zu reagieren, sondern diesen auch vorhersagen zu können, zwischen Säugern und Drosophila erhalten.
Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice
(2014)
Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells.
In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro.
The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals.
Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo.
Ca2+-empfindliche K+-Kanäle mittlerer Leitfähigkeit (IK1-Kanäle) übernehmen wichtige Funktionen bei vielen physiologischen Prozessen wie z.B. bei der Zell-Proliferation, der epithelialen Salz- und Wasser-Sekretion und der Zellmigration. Die Kanäle werden durch die intrazeluläre Ca2+-Konzentration reguliert, wobei ihre Ca2+-Sensitivität durch Phosphorylierungsreaktionen moduliert werden kann. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des aus transformierten Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) klonierten Ca2+-sensitiven K+-Kanals mittlerer Leitfähigkeit (cIK1) und die Untersuchung seiner Regulierung durch die Proteinkinase C (PKC). Dazu wurde der Kanal heterolog in CHO- und HEK293-Zellen exprimiert. Seine biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sowie der Einfluß der Proteinkinase C auf die Kanalaktivität wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die cIK1-Ströme sind schwach einwärtsrektifizierend, zeigen keine Aktivierungs- oder Inaktivierungskinetik und weisen im physiologischen Bereich keine Spannungsabhängigkeit auf. Der cIK1 ist K+-selektiv und wird durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert. Der Kanal wird durch Barium, Charybdotoxin und Clotrimazol blockiert und durch 1-Ethyl-2-Benzimidazolon aktiviert. Die funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften des klonierten cIK1 entsprechen damit denen des nativen Kanals aus MDCK-F-Zellen und stimmen mit denen anderer Mitglieder der IK1-Kanalfamilie überein. Neben der Regulierung durch die intrazelluläre Ca2+-Konzentration wird der cIK1 auch durch eine PKC-abhängige Phosphorylierung reguliert. Sowohl ATP als auch ATP?S stimulieren die Kanalaktivität. Die ATP-abhängige Aktivierung wird durch Inhibitoren der Proteinkinase C (Bisindolylmaleimid, Calphostin C) gehemmt, während die mit ATP?S induzierte Kanalaktivität weitgehend resistent gegen diese PKC-Inhibitoren ist. Eine Stimulierung der Proteinkinase C mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) führt zu einer sofortigen Aktivierung des cIK1. Im Gegensatz dazu sind die cIK1-Kanäle nach fast vollständigem Abbau der Proteinkinase C durch eine langfristige Inkubierung der Zellen mit PMA nicht mehr aktiv. Um zu untersuchen, ob diese Regulierung eine direkte Interaktion der Proteinkinase C mit dem Kanalprotein erfordert, wurden die drei putativen PKC-Konsensussequenzen des cIK1 mittels zielgerichteter Mutagenese so verändert, daß eine Phosphorylierung an diesen Stellen nicht mehr möglich ist. Weder die einzelne Mutation der PKC-Konsensussequenzen (T101, S178, T329) noch die gleichzeitige Mutation aller drei Phosporylierungsstellen zu Alanin beeinflußt die akute Regulierung des cIK1 durch die Proteinkinase C. Die cIK1-Mutante T329A und die Dreifachmutante reagieren jedoch nach einem Abbau der Proteinkinase C mit einem extremen Anstieg der Kanalaktivität und demaskieren damit einen zweiten Weg der Kanalregulierung. Die Ergebnisse zeigen, daß der cIK1 durch zwei voneinander unabhängige Mechanismen reguliert wird. Eine PKC-abhängige Phosphorylierung erhöht die Aktivität der Kanäle, findet jedoch nicht an den bekannten PKC-Konsensusesquenzen des Kanalproteins statt. Dagegen werden die cIK1-Kanäle über einen zweiten ATP-abhängigen Mechanismus, der wahrschenlich eine direkte Interaktion mit dem Kanalprotein erfordert, gehemmt.
Zielsetzung: In einer Population im Westen der nigerianischen Stadt Kaduna wurden seit 20-30 Jahren vermehrt Kinder mit einer deformierenden Knochenerkrankung registriert. Ziel der Studie war, eine Diagnose zu stellen und Risikofaktoren für die Erkrankung zu identifizieren. Studiendesign: 26 Familien aus 20 Dörfern wurden in die Studie einbezogen. In einer nicht-randomisierten Fall-Kontroll-Studie wurden 53 erkrankte Kinder mit 48 gesunden sowie 16 fraglich erkrankten Geschwistern anhand ihrer Ergebnisse aus Anamnese, klinischer Untersuchung und Laborchemie miteinander verglichen. Ebenfalls wurden Daten von 24 Vätern und 36 Müttern ausgewertet. Weitere Untersuchungen umfassten Ernährung, Anthropometrie, Umweltfaktoren und Genetik der teilnehmenden Familien. Ergebnisse: Die betroffenen Kinder wiesen deutliche Rachitissymptome auf, bei allen lag eine Kalzium-defiziente Rachitis vor. Zwischen den Laborergebnissen von Fall- und Kontrollgruppe bestanden signifikante Unterschiede, nicht jedoch zwischen der Gruppe der fraglichen Fälle und der Kontrollgruppe. In der Fallgruppe waren die Serumspiegel von Kalzium und 25-Vit. D signifikant niedriger, die Serumspiegel von 1,25-Vit. D, ALP und PTH signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Bei den Eltern zeigten die Mütter insbesondere in der Stillzeit signifikant niedrigere Kalzium- und signifikant höhere 1,25- Vit. D- und PTH-Serumspiegel als die Väter. Als Ursache für den Kalziummangel der Studienteilnehmer konnte eine kalziumarme und phytatreiche Diät der Familien identifiziert werden. Hinweise auf einen gesunkenen Lebensstandard und eine Abnahme der Bodenqualität erklären die in den letzten Jahrzehnten stark gestiegene Prävalenz der Erkrankung. Bei weitgehend gleichen Ernährungs- und Umweltfaktoren innerhalb einer Familie konnten keine individuellen Faktoren identifiziert werden, die bei einzelnen Familienmitgliedern zum Ausbruch der Erkrankung führten. Trotz einzelner Hinweise auf eine mögliche genetische Prädisposition war kein einheitliches Vererbungsmuster in den Stammbäumen der Familien erkennbar. Schlussfolgerung: Neben dem Hauptfaktor einer kalziumarmen Ernährung müssen weitere Faktoren für eine Kalzium-defiziente Rachitis vorliegen. Mehrere Hinweise deuten auf eine multifaktorielle Genese der Erkrankung hin. Die noch offenstehenden Fragen sollten durch weitere Studien geklärt werden, um die richtigen Maßnahmen für Prävention und Therapie zu treffen.
Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in höheren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette für WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht möglich. Demgegenüber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch für stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen bestätigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der Überexpression eine starke Überladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis für einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotentialänderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkanäle führen könnte. Für die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden. Transkriptionelle Änderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakblättern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form gänzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, während kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten.