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Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes.
For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus.
In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human.
Die Kostimulation über den CD28 Oberflächenrezeptor spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der Proliferation von T-Zellen, in deren Differenzierung zu Effektorzellen, als auch in der Entwicklung und Kontrolle von regulatorischen T-Zellen. Diese Schlüsselrolle macht CD28 zu einer interessanten Zielstruktur, um den Einfluss monoklonaler Antikörper auf die Entwicklung und Homöostase von T-Zellen zu analysieren. Die hier verwendeten Antikörper lassen sich funktionell in zwei verschiedene Kategorien einteilen: zum Einen in konventionelle Antikörper (E18 mAk), welche die physiologische Rezeptor-Liganden Interaktion blockieren, und zum Anderen in superagonistische Antikörper (D665 mAk), die in der Lage sind ruhende T-Zellen ohne eine Ligation des T-Zell Rezeptors voll zu aktivieren. In der vorliegenden Arbeit konnte in verschiedenen in-vitro und in-vivo Experimenten gezeigt werden, dass eine Behandlung mit dem CD28 Superagonisten keinen Einfluss auf die Differenzierung von T-Zellen im Thymus nimmt, und die Zusammensetzung der einzelnen Zellpopulationen in diesem Organ unbeeinflusst bleibt. Bei Verwendung blockierender anti-Maus CD28 mAk zeigte sich in sämtlichen Untersuchungen eine beeinträchtigte Entwicklung von regulatorischen T-Zellen innerhalb des Thymus, während die anderen Zellpopulationen unbeeinflusst blieben. Auch in Analysen peripherer Lymphknoten lag der Anteil regulatorischer T-Zellen nach Behandlung mit E18 mAk unter den Kontrollwerten. Durch eine chronische Blockade von CD28 mittels E18 mAk ließ sich die Gesamtanzahl an Tregs in peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus drastisch senken, ohne dass es zu einem vollständigen Verschwinden dieser Zellpopulation kam. Auch die absolute Zahl an CD4 positiven T-Zellen innerhalb der peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus der behandelten Tiere lag deutlich unter der Kontrolle. Diese Beobachtungen waren 13 Wochen nach Beendigung der Antikörper-Applikationen vollständig reversibel und zu keinem Zeitpunkt des Experimentes ergaben sich klinische oder serologische Hinweise auf die Entwicklung von Autoimmunität trotz niedriger Treg- Zahlen über mehrere Wochen.