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Priority tasks of the present thesis were to generate various enantiopure C-3-substituted pyroglutamates as well as C-3-substituted glutamates, and furthermore to ameliorate the serious drawback of the bad atom-economy in the reaction sequence of previously published silylether-mediated procedures. To meet these requirements, the ortho ester functionality (OBO ester) developed by Corey was introduced. According to the plan of synthesis, the starting material, non-racemic (S)-pyroglutamic acid, was converted to the corresponding oxetane ester via a DCC-mediated esterification. The latter was N-protected to provide N-acceptor substituted pyroglutamic acid oxetane esters (Acceptor=Boc,Cbz,CO2Me). After rearrangement with boron trifluoride, the ortho ester derivatives (Acceptor=Cbz,CO2Me) were at hand and exclusively the N-Cbz derivative was converted to the corresponding alpha,beta-unsaturated lactam via a syn-elimination reaction. The formation of the C-3-substituted ortho ester compounds (R=methyl,ethyl,butyl,allyl,phenyl,4-chlorophenyl,biphenyl,naphthyl) was performed via a copper-mediated conjugate addition to the alpha,beta-enone system of the N-Cbz-alpha,beta-unsaturated lactam. The OBO functionality hence was envisaged to support perfect trans selectivity in this cuprate addition to the Michael system of the N-Cbz-alpha,beta-unsaturated lactam. Spectroscopic NMR-data, on the basis of 1H-, 13C- and DEPT spectra, proved the assumption that the C-3-substituted ortho ester derivatives exclusively are trans-configurated, i.e. the alkyl derivatives (R=methyl,ethyl,butyl,allyl) are (2S,3S)-configurated and the aryl derivatives (R=phenyl,4-chlorophenyl,biphenyl,naphthyl) are (2S,3R)-configurated). The C-3-substituted ortho ester derivatives were completely deprotected to yield the C-3-substituted pyroglutamates (R=ethyl,phenyl,4-chlorophenyl,naphthyl). Finally, ring opening reaction via route A-2 lead to the desired enantiopure C-3-substituted glutamates. Alternatively, latter preferably were reacted via route A-1 to yield the C-3-substituted glutamates (R=methyl,ethyl,butyl,phenyl,4-chlorophenyl,naphthyl). Their (2S,3R)-configuration (R=aryl) and (2S,3S)-configuration (R=alky), respectively, unambiguously was proved on the basis of available spectroscopic NMR-data. To ensure this assumption, diastereomeric (2S,3R)-3-methyl glutamic acid (i.e. cis-configurated) examplarily was synthesized via route A-3 and spectroscopic NMR-data was compared to that of (2S,3S)-3-methyl glutamic acid (i.e. trans-configurated). Conclusively, there can be recorded the fact that the serious drawback of the bad atom-economy in the reaction sequence previously used can be circumvented by the introduction of the OBO functionality, so the concept of an improved atom-economy is achieved. Additionally, in comparison to the silyl-ether-mediated synthesis, the OBO functionality provided crystalline ortho ester derivatives, which facilitated their purification as well as characterization.
In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Applikation von Glutamat zur transienten Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration sowie zu einer Depolarisation der Plasmamembran von Mesophyllzellen führt. Pharmakologische Studien weisen auf mögliche Orthologe tierischer ionotroper Glutamatrezeptoren (iGLuRs) hin. Ziel dieser Arbeit war eine vertiefte molekulare und funktionelle Analyse der Glutamatrezeptoren (GLRs) aus Arabidopsis thaliana. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: i. Zugabe von extrazellulärem Glutamat in Kombination mit Glycin führt in Abhängigkeit der extrazellulären ATP-Konzentration (eATP) zu einer transienten Erhöhung der Calciumkonzentration in Mesophyllzellen. ii. Die Reaktion von Mesophyllprotoplasten auf die Applikation von Glutamat und Glycin ist im Vergleich zum intakten Blatt stark reduziert, kann jedoch in Gegenwart von eATP oder Glucose signifikant gesteigert werden. iii. Diese Responsibilität von Mesophyllprotoplasten ist zum Zeitpunkt des Einsetzens der Zellwandsynthese (48h) am höchsten. iv. In Patch-Clamp Experimenten führt die photolytische Freisetzung von extrazellulärem caged-Glutamat bei 34 % der gemessenen A. thaliana Mesophyllprotoplasten zu einem verstärkten Kationentransport über die Plasmamembran. Dieser Kationenstrom kann durch gleichzeitige Anwesenheit von extrazellulärem ATP noch verstärkt werden und ist durch einen Desensitivierungsprozess gekennzeichnet. Die Empfindlichkeit dieser Ströme gegenüber Antagonisten tierischer iGluRs stellt eine Verbindung zu der Genfamilie der AtGLRs dar. v. Coexpressionexperimente ausgewählter AtGLRs geben erste Hinweise auf eine Homo- bzw. eine Heteromerbildung von AtGLR1.1 und AtGLR1.4. Aufgrund fehlender Kanalaktivität konnten einzelne, in Oozyten exprimierte AtGLRs bislang nicht funktionell charakterisiert werden. vi. Studien zur transienten und stabilen Überexpression im homologen Expressionssystem zeigen einen cytotoxischen Effekt bei funktioneller Überexpression ausgewählter AtGLRs. vii. Die Analyse der Stellung des Glutamatrezeptors 3.4 in kälteregulierten Signalnetzwerken via Microarrays weist auf ein überlappendes Aufgabenspektrum der Familie der AtGLRs hin. viii. Im Rahmen von Microarray Transkriptionsanalysen an der glr3.4-1 Mutante konnte ein bisher nicht charakterisiertes, co-reguliertes Protein identifiziert werden. Dieses Protein ist durch den Besitz einer transmembranen Region sowie einer ATP-Bindedomäne charakterisiert und könnte einen möglichen Regulator des AtGLR3.4-Kanals darstellen. ix. Die Überprüfung einer möglichen Beteiligung der pflanzlichen Glutamatrezeptoren an der Generierung der glutamatabhängigen Ca2+-Signale sowie die Suche nach Regulatoren bzw. fehlenden Untereinheiten erfolgte mithilfe Mutanten-„Sreenings“. Die Analyse der bis dato identifizierten, Glutamat-insensitiven Mutanten konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden.