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- § 1901b BGB (1)
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- Ösophaguskarzinom (1)
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- Übergangsmetalldichalkogenide (1)
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Institute
- Graduate School of Life Sciences (45)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (37)
- Physikalisches Institut (31)
- Institut für Physikalische und Theoretische Chemie (19)
- Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (16)
- Institut für Mathematik (14)
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (14)
- Institut für Anorganische Chemie (12)
- Institut für Organische Chemie (12)
- Institut für Psychologie (11)
Sonstige beteiligte Institutionen
- ATLAS Collaboration (1)
- Adam Opel AG (1)
- Bayerisches Zentrum für Angewandte Energieforschung e.V. (1)
- CERN (1)
- Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD) (1)
- Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt (DLR), Institut für Raumfahrtsysteme (1)
- Département de géographie, Université Abdou Moumouni Dioffo de Niamey, Niger (1)
- Fraunhofer-Institut für Silicatforschung ISC (1)
- Hochschule Aalen (1)
- Institut für Biopsychologie, Universität Dresden (1)
ResearcherID
- B-1911-2015 (1)
- C-2593-2016 (1)
- N-2030-2015 (1)
- N-3741-2015 (1)
Die Möglichkeiten der operativen Rekonstruktion degenerativ veränderter Hüftgelenke sind komplex und vielfältig. Bei den derzeit zur Verfügung stehenden operativen Behandlungsmassnahmen führen die Vor- und Nachteile immer wieder zur Diskussionen und Abwägung der Operationsverfahren. Hierbei stehen sich die rasche postoperative Mobilisierung sowie eine verminderte Rekonvaleszenzzeit mit den diskutierten Nachteilen einer schlechteren Übersichtlichkeit und damit verbundenen Fehlimplantationen gegenüber. Dies und die damit verbundene volkswirtschaftliche Bedeutung sind ein ständiger Ausgangspunkt für das Bemühen den optimalen Zugangsweg zu etablieren. Daher stellte das von Smith-Peterson 1949 publizierte Verfahren einen Meilenstein in der operativen Therapie dar. Hierdurch konnten zum einen die operationstechnischen Vorteile wie auch das volkswirtschaftliche Begehren nach kürzeren postoperativen Verweildauern vereint werden. Die Modifizierung dieses Zugangsweges hat sich bereits in einer großen Anzahl prospektiver Studien als zuverlässiges Rekonstruktionsverfahren etabliert und erfüllt zudem auch die Anforderungen der heutigen Medizin nach ästhetisch schönen Ergebnissen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine prospektive Fallstudie des direkten anterioren Zugangs mit einem gesunden Vergleichskollektiv durchgeführt. Mit dem Ziel, die Aktivität ein Jahr postoperativ nach Implantation einer HTEP mit gesunden Probanden zu vergleichen. Von Januar 2009 bis Mai 2011 wurden insgesamt 77 Patienten und 59 Probanden in die Studie aufgenommen. Als Vergleichswerte wurde zum einen die klinische wie auch die radiologische Untersuchung herangezogen. In der klinischen Untersuchung zeigte sich insgesamt ein signifikanter Anstieg der untersuchten Scores im Vergleich mit den präoperativen Ergebnissen bei den Operierten. Im Vergleich zu den Probanden erzielen die Patienten ein Jahr nach HTEP teilweise noch schlechtere Werte in dem Bewegungsumfang und den Aktivitätsniveaus welche mittels der Auswertung des Stepwatches, des TWB und des Arzt-Patienten-Fragebogens erhoben wurden. Die radiologische Bewertung diente zur Feststellung der Positionierung der HTEP. Mit guten Positionierungen durch den direkten anterioren Zugang. Die Bewertung der Funktionalität zwischen den beiden Gruppen erfolgte durch den HHS, XSFMA- D und den Arzt-Patientenfragenbogen. Hierbei konnten ähnliche Ergebnisse, wie bereits oben beschrieben, verzeichnet werden mit guten Werten in der Gruppe der untersuchten Patienten, jedoch einer geringeren Funktionalität im Vergleich zu den Probanden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der direkte anteriore Zugang die Wiederherstellung eines guten postoperativen Gesundheitszustandes mit erreichen eines hohen postoperativen Aktivitätslevels der Patienten ermöglicht. Ebenso erfüllt dieser Zugangsweg die Anforderungen der heutigen Medizin im Sinne einer schnellen postoperativen Mobilisation. Im Vergleich zu anderen minimal-invasiven Verfahren zeigen sich eine gute Implantierbarkeit, eine gute Positionierung und ein niedriges Komplikationsniveau. Prinzipiell hat der minimal-invasive anteriore Zugang das Potenzial sich als ein Standardverfahren in der operativen Rekonstruktion bei Hüftgelenksersatz zu etablieren, jedoch wäre ein direkter Vergleich mit dem lateralen Zugang erstrebenswert und sollte in weiteren Studien verglichen werden.
In the present thesis the MBE growth and sample characterization of HgTe structures is investigated
and discussed. Due to the first experimental discovery of the quantum Spin Hall effect
(QSHE) in HgTe quantum wells, this material system attains a huge interest in the spintronics
society. Because of the long history of growing Hg-based heterostructures here at the Experimentelle
Physik III in Würzburg, there are very good requirements to analyze this material
system more precisely and in new directions. Since in former days only doped HgTe quantum
wells were grown, this thesis deals with the MBE growth in the (001) direction of undoped
HgTe quantum wells, surface located quantum wells and three dimensional bulk layers. All
Hg-based layers were grown on CdTe substrates which generate strain in the layer stack and
provide therefore new physical effects. In the same time, the (001) CdTe growth was investigated
on n-doped (001) GaAs:Si because the Japanese supplier of CdTe substrates had a
supply bottleneck due to the Tohoku earthquake and its aftermath in 2011.
After a short introduction of the material system, the experimental techniques were demonstrated
and explained explicitly. After that, the experimental part of this thesis is displayed.
So, the investigation of the (001) CdTe growth on (001) GaAs:Si is discussed in chapter 4.
Firstly, the surface preparation of GaAs:Si by oxide desorption is explored and analyzed.
Here, rapid thermal desorption of the GaAs oxide with following cool down in Zn atmosphere
provides the best results for the CdTe due to small holes at the surface, while e.g. an atomic
flat GaAs buffer deteriorates the CdTe growth quality. The following ZnTe layer supplies the
(001) growth direction of the CdTe and exhibits best end results of the CdTe for 30 seconds
growth time at a flux ratio of Zn/Te ~ 1/1.2. Without this ZnTe layer, CdTe will grow in the
(111) direction. However, the main investigation is here the optimization of the MBE growth
of CdTe. The substrate temperature, Cd/Te flux ratio and the growth time has to be adjusted
systematically. Therefore, a complex growth process is developed and established. This optimized
CdTe growth process results in a RMS roughness of around 2.5 nm and a FWHM value
of the HRXRD w-scan of 150 arcsec. Compared to the literature, there is no lower FWHM
value traceable for this growth direction. Furthermore, etch pit density measurements show
that the surface crystallinity is matchable with the commercial CdTe substrates (around 1x10^4
cm^(-2)). However, this whole process is not completely perfect and offers still room for improvements.
The growth of undoped HgTe quantum wells was also a new direction in research in contrast
to the previous n-doped grown HgTe quantum wells. Here in chapter 5, the goal of very low
carrier densities was achieved and therefore it is now possible to do transport experiments in
the n - and p - region by tuning the gate voltage. To achieve this high sample quality, very precise
growth of symmetric HgTe QWs and their HRXRD characterization is examined. Here,
the quantum well thickness can now determined accurate to under 0.3 nm. Furthermore, the transport analysis of different quantum well thicknesses shows that the carrier density and
mobility increase with rising HgTe layer thickness. However, it is found out that the band
gap of the HgTe QW closes indirectly at a thickness of 11.6 nm. This is caused by the tensile
strained growth on CdTe substrates. Moreover, surface quantum wells are studied. These
quantum wells exhibit no or a very thin HgCdTe cap. Though, oxidization and contamination
of the surface reduces here the carrier mobility immensely and a HgCdTe layer of around 5 nm
provides the pleasing results for transport experiments with superconductors connected to the
topological insulator [119]. A completely new achievement is the realization of MBE growth
of HgTe quantum wells on CdTe/GaAs:Si substrates. This is attended by the optimization of
the CdTe growth on GaAs:Si. It exposes that HgTe quantum wells grown in-situ on optimized
CdTe/GaAs:Si show very nice transport data with clear Hall plateaus, SdH oscillations, low
carrier densities and carrier mobilities up to 500 000 cm^2/Vs. Furthermore, a new oxide etching
process is developed and analyzed which should serve as an alternative to the standard
HCl process which generates volcano defects at some time. However, during the testing time
the result does not differ in Nomarski, HRXRD, AFM and transport measurements. Here,
long-time tests or etching and mounting in nitrogen atmosphere may provide new elaborate
results.
The main focus of this thesis is on the MBE growth and standard characterization of HgTe bulk
layers and is discussed in chapter 6. Due to the tensile strained growth on lattice mismatched
CdTe, HgTe bulk opens up a band gap of around 22 meV at the G-point and exhibits therefore
its topological surface states. The analysis of surface condition, roughness, crystalline quality,
carrier density and mobility via Nomarski, AFM, XPS, HRXRD and transport measurements
is therefore included in this work. Layer thickness dependence of carrier density and mobility
is identified for bulk layer grown directly on CdTe substrates. So, there is no clear correlation
visible between HgTe layer thickness and carrier density or mobility. So, the carrier density is
almost constant around 1x10^11 cm^(-2) at 0 V gate voltage. The carrier mobility of these bulk
samples however scatters between 5 000 and 60 000 cm^2/Vs almost randomly. Further experiments
should be made for a clearer understanding and therefore the avoidance of unusable
bad samples.But, other topological insulator materials show much higher carrier densities and
lower mobility values. For example, Bi2Se3 exhibits just density values around 1019 cm^(-2)
and mobility values clearly below 5000 cm2/Vs. The carrier density however depends much
on lithography and surface treatment after growth. Furthermore, the relaxation behavior and
critical thickness of HgTe grown on CdTe is determined and is in very good agreement with
theoretical prediction (d_c = 155 nm). The embedding of the HgTe bulk layer between HgCdTe
layers created a further huge improvement. Similar to the quantum well structures the carrier
mobility increases immensely while the carrier density levels at around 1x10^11 cm^(-2) at 0
V gate voltage as well. Additionally, the relaxation behavior and critical thickness of these
barrier layers has to be determined. HgCdTe grown on commercial CdTe shows a behavior as
predicted except the critical thickness which is slightly higher than expected (d_c = 850 nm).
Otherwise, the relaxation of HgCdTe grown on CdTe/GaAs:Si occurs in two parts. The layer
is fully strained up to 250 nm. Between 250 nm and 725 nm the HgCdTe film starts to relax
randomly up to 10 %. The relaxation behavior for thicknesses larger than 725 nm occurs than
linearly to the inverse layer thickness. A explanation is given due to rough interface conditions
and crystalline defects of the CdTe/GaAs:Si compared to the commercial CdTe substrate. HRXRD and AFM data support this statement. Another point is that the HgCdTe barriers protect the active HgTe layer and because of the high carrier mobilities the Hall measurements provide new transport data which have to be interpreted more in detail in the future. In addition, HgTe bulk samples show very interesting transport data by gating the sample from the top and the back. It is now possible to manipulate the carrier densities of the top and bottom surface states almost separately. The back gate consisting of the n-doped GaAs substrate and the thick insulating CdTe buffer can tune the carrier density for Delta(n) ~ 3x10^11 cm^(-2). This is sufficient to tune the Fermi energy from the p-type into the n-type region [138].
In this thesis it is shown that strained HgTe bulk layers exhibit superior transport data by embedding between HgCdTe barrier layers. The n-doped GaAs can here serve as a back gate.
Furthermore, MBE growth of high crystalline, undoped HgTe quantum wells shows also new
and extended transport output. Finally, it is notable that due to the investigated CdTe growth
on GaAs the Hg-based heterostructure MBE growth is partially independent from commercial
suppliers.
In der vorliegenden Arbeit wird die Rotated-Cone-UTE-Sequenz (RC-UTE), eine 3D k-Raum-Auslesetechnik mit homogener Verteilung der Abtastdichte, vorgestellt. Diese 3D MR-Messtechnik ermöglicht die für die Detektion von schnell abfallenden Signalen notwendigen kurzen Echozeiten und weist eine höhere SNR-Effizienz als konventionelle radiale Pulssequenzen auf. Die Abtastdichte ist dabei in radialer und azimutaler Richtung angepasst. Simulationen und Messungen in vivo zeigen, dass die radiale Anpassung das T2-Blurring reduziert und die SNR-Effizienz erhöht. Die Drehung der Trajektorie in azimutale Richtung ermöglicht die Reduzierung der Unterabtastung bei gleicher Messzeit bzw. eine Reduzierung der Messzeit ohne Auflösungsverlust.
Die RC-UTE-Sequenz wurde erfolgreich für die Bildgebung des Signals des kortikalen Knochens und der Lunge in vivo angewendet. Im Vergleich mit der grundlegenden UTE-Sequenz wurden die Vorteile von RC-UTE in allen Anwendungsbeispielen aufgezeigt. Die transversalen Relaxationszeit T2* des kortikalen Knochen bei einer Feldstärke von 3.0T und der Lunge bei 1.5T und 3.0T wurde in 3D isotroper Auflösung gemessen. Außerdem wurde die Kombination von RC-UTE-Sequenz mit Methoden der Magnetisierungspräparation zur besseren Kontrasterzeugung gezeigt. Dabei wurden die Doppel-Echo-Methode, die Unterdrückung von Komponenten mit langer Relaxationszeit T2 durch Inversionspulse und der Magnetisierungstransfer-Kontrast angewendet.
Die Verwendung der RC-UTE-Sequenz für die 3D funktionelle Lungenbildgebung wird ebenfalls vorgestellt. Mit dem Ziel der umfassenden Charakterisierung der Lungenfunktion in 3D wurde die simultane Messung T1-gewichteter Bilder und quantitativer T2*-Karten für verschiedene Atemzustände an sechs Probanden durchgeführt. Mit der hier vorgestellten Methode kann die Lungenfunktion in 3D über T1-Wichtung, quantitative T2*-Messung und Rekonstruktion verschiedener Atemzustände durch Darstellung von Ventilation, Sauerstofftransport und Volumenänderung beurteilt werden.
Kohärenz- und Magnetfeldmessungen an Polariton-Kondensaten unterschiedlicher räumlicher Dimensionen
(2015)
Die Bose-Einstein-Kondensation (BEK) und die damit verbundenen Effekte wie Superfluidität und Supraleitung sind faszinierende Resultate der Quantennatur von Bosonen. Nachdem die Bose-Einstein-Kondensation für Atom-Systeme nur bei Temperaturen nahe dem absoluten Nullpunkt realisierbar ist, was einen enormen technologischen Aufwand benötigt, wurden Bosonen mit wesentlich kleineren Massen zur Untersuchung der BEK gesucht. Hierfür bieten sich Quasiteilchen in Festkörpern wie Magnonen oder Exzitonen an, da deren effektive Massen sehr klein sind und die Kondensationstemperatur dementsprechend höher ist als für ein atomares System. Ein weiteres Quasiteilchen ist das Exziton-Polariton als Resultat der starken Licht-Materie-Wechselwirkung in Halbleitermikrokavitäten, welches sowohl Materie- als auch Photoneigenschaften hat und dessen Masse theoretisch eine BEK bis Raumtemperatur erlaubt. Ein weiterer Vorteil dieses System ist die einfache Erzeugung des Bose-Einstein-Kondensats in diesen Systemen durch elektrisches oder optisches Injizieren von Exzitonen in die Halbleiter-Quantenfilme der Struktur. Außerdem kann die Impulsraumverteilung dieser Quasiteilchen leicht durch einfache experimentelle Methoden mittels eines Fourierraumspektroskopie-Aufbaus bestimmt werden. Durch die winkelabhängige Messung der Emission kann direkt auf die Impulsverteilung der Exziton-Polaritonen in der Quantenfilmebene zurückgerechnet werden, die zur Identifikation der BEK hilfreich ist. Deshalb wird das Exziton-Polariton als ein Modellsystem für die Untersuchung von Bose-Einstein-Kondensation in Festkörpern und den damit in Relation stehenden Effekten angesehen. In dieser Arbeit wird die Grundzustandskondensation von Exziton-Polaritonen in Halbleitermikrokavitäten verschiedener Dimensionen realisiert und deren Emissionseigenschaften untersucht. Dabei wird vor allem die Wechselwirkung des Polariton-Kondensats mit der der unkondensierten Polaritonen bzw. der Quantenfilm-Exzitonen im externen Magnetfeld verglichen und ein Nachweis zum Erhalt der starken Kopplung über die Polariton-Kondensationsschwelle hinaus entwickelt. Außerdem werden die Kohärenzeigenschaften von null- und eindimensionalen Polariton-Kondensaten durch Bestimmung der Korrelationsfunktion erster beziehungsweise zweiter Ordnung analysiert. Als Materialsystem werden hierbei die III/V-Halbleiter gewählt und die Quantenfilme bestehen bei allen Messungen aus GaAs, die von einer AlAs Kavität umgeben sind.
Eindimensionale Polariton-Kondensation - räumliche Kohärenz der Polariton-Drähte
Im ersten experimentellen Teil dieser Arbeit (Kapitel 1) wird die Kondensation der Polaritonen in eindimensionalen Drähten unter nicht-resonanter optischer Anregung untersucht. Dabei werden verschiedene Drahtlängen und -breiten verwendet, um den Einfluss des zusätzlichen Einschlusses auf die Polariton-Dispersion bestimmen zu können. Ziel dieser Arbeit ist es, ein eindimensionales Bose-Einstein-Kondensat mit einer konstanten räumlichen Kohärenz nach dem zentralen Abfall der g^(1)(r)-Funktion für große Abstände r in diesen Drähten zu realisieren (sogenannte langreichweitige Ordnung im System, ODLRO (Abkürzung aus dem Englischen off-diagonal long-range order).
Durch Analyse der Fernfeldemissionseigenschaften können mehrere Polariton-Äste, der eindimensionale Charakter und die Polariton-Kondensation in 1D-Systemen nachgewiesen werden. Daraufhin wird die räumliche Kohärenzfunktion g^(1)(r) mithilfe eines hochpräzisen Michelson-Interferometer, das im Rahmen dieser Arbeit aufgebaut wurde, bestimmt. Die g^(1)(r)-Funktion nimmt hierbei über große Abstände im Vergleich zur thermischen De-Broglie-Wellenlänge einen konstanten Plateauwert an, der abhängig von der Anregungsleistung ist. Unterhalb der Polariton-Kondensationsschwelle (Schwellleistung P_S) ist kein Plateau sichtbar und die räumliche Kohärenz ist nur im zentralen Bereich von unter |r| < 1 µm vorhanden. Mit ansteigender Anregungsleistung nimmt das zentrale Maximum in der Weite zu und es bildet sich das Plateau der g^(1)(r)-Funktion aus, das nur außerhalb des Drahtes auf Null abfällt. Bei P=1,6P_S ist das Plateau maximal und beträgt circa 0,15. Außerdem kann nachgewiesen werden, dass mit steigender Temperatur die Plateauhöhe abnimmt und schließlich bei T=25K nicht mehr gemessen werden kann. Hierbei ist dann nur noch das zentrale Maximum der Kohärenzfunktion g^(1)(r) sichtbar. Weiterhin werden die Ergebnisse mit einer modernen mikroskopischen Theorie, die auf einem stochastischen Mastergleichungssystem basiert, verglichen, wodurch die experimentellen Daten reproduziert werden können. Im letzten Teil des Kapitels wird noch die Kohärenzfunktion g^(1)(r) im 1D-Fall mit der eines planaren Polariton-Kondensats verglichen (2D).
Nulldimensionale Polariton-Kondensation - Kondensation und Magnetfeldwechselwirkung in einer Hybridkavität
Im zweiten Teil der Arbeit wird die Polariton-Kondensation in einer neuartigen Hybridkavität untersucht. Der Aufbau des unteren Spiegels und der Kavität inklusive der 12 verwendeten Quantenfilme ist analog zu den gewöhnlichen Mikrokavitäten auf Halbleiterbasis. Der obere Spiegel jedoch besteht aus einer Kombination von einem DBR (Abkürzung aus dem Englischen distributed Bragg reflector) und einem Brechungsindexkontrast-Gitter mit einem Luft-Halbleiterübergang (größt möglichster Brechungsindexkontrast). Durch die quadratische Strukturgröße des Gitters (Seitenlänge 5µm) sind die Polaritonen zusätzlich zur Wachstumsrichtung noch in der Quantenfilmebene eingesperrt, so dass sie als nulldimensional angesehen werden können (Einschluss auf der ungefähren Größe der thermischen De-Broglie-Wellenlänge). Um den Erhalt der starken Kopplung über die Kondensationsschwelle hinaus nachweisen zu können, wird ein Magnetfeld in Wachstumsrichtung angelegt und die diamagnetische Verschiebung des Quantenfilms mit der des 0D-Polariton-Kondensats verglichen. Hierdurch kann das Polariton-Kondensat von dem konventionellen Photonlasing in solchen Strukturen unterschieden werden. Weiterhin wird als letztes Unterscheidungsmerkmal zwischen Photonlasing und Polariton-Kondensation eine Messung der Autokorrelationsfunktion zweiter Ordnung g^(2)(t) durchgeführt. Dabei kann ein Wiederanstieg des g^(2)(t = 0)-Werts mit ansteigender Anregungsleistung nachgewiesen werden, nachdem an der Kondensationsschwelle der g^(2)(t = 0)-Wert auf 1 abgefallen ist, was auf eine zeitliche Kohärenzzunahme im System hinweist. Oberhalb der Polariton-Kondensationsschwelle P_S steigt der g^(2)(t = 0)-Wert wieder aufgrund zunehmender Dekohärenzprozesse, verursacht durch die im System ansteigende Polariton-Polariton-Wechselwirkung, auf Werte größer als 1 an. Für einen gewöhnlichen Photon-Laser (VCSEL, Abkürzung aus dem Englischen vertical-cavity surface-emitting laser) im monomodigen Betrieb kann mit steigender Anregungsleistung kein Wiederanstieg des g^(2)(t = 0)-Werts gemessen werden. Somit stellt dies ein weiteres Unterscheidungsmerkmal zwischen Polariton-Kondensation und Photonlasing dar.
Zweidimensionale Polariton-Kondensation - Wechselwirkung mit externem Magnetfeld
Im letzten experimentellen Kapitel dieser Arbeit wird die Magnetfeldwechselwirkung der drei möglichen Regime der Mikrokavitätsemission einer planaren Struktur (zweidimensional) untersucht. Dazu werden zuerst durch eine Leistungsserie bei einer Verstimmung des Photons und des Quantenfilm-Exzitons von d =-6,5meV das lineare, polaritonische Regime, das Polariton-Kondensat und bei weiterer Erhöhung der Anregungsleistung das Photonlasing identifiziert. Diese drei unterschiedlichen Regime werden daraufhin im Magnetfeld von B=0T-5T auf ihre Zeeman-Aufspaltung und ihre diamagnetische Verschiebung untersucht und die Ergebnisse der Magnetfeldwechselwirkung werden anschließend miteinander verglichen. Im linearen Regime kann die Abhängigkeit der Zeeman-Aufspaltung und der diamagnetischen Verschiebung vom exzitonischen Anteils des Polaritons bestätigt werden. Oberhalb der Polariton-Kondensationsschwelle wird eine größere diamagnetische Verschiebung gemessen als für die gleiche Verstimmung im linearen Regime. Dieses Verhalten wird durch Abschirmungseffekte der Coulomb-Anziehung von Elektronen und Löchern erklärt, was in einer Erhöhung des Bohrradius der Exzitonen resultiert. Auch die Zeeman-Aufspaltung oberhalb der Polariton-Kondensationsschwelle zeigt ein vom unkondensierten Polariton abweichendes Verhalten, es kommt sogar zu einer Vorzeichenumkehr der Aufspaltung im Magnetfeld. Aufgrund der langen Spin-Relaxationszeiten von 300ps wird eine Theorie basierend auf der im thermischen Gleichgewichtsfall entwickelt, die nur ein partielles anstatt eines vollständigen thermischen Gleichgewicht annimmt. So befinden sich die einzelnen Spin-Komponenten im Gleichgewicht, während zwischen den beiden Spin-Komponenten kein Gleichgewicht vorhanden ist. Dadurch kann die Vorzeichenumkehr als ein Zusammenspiel einer dichteabhängigen Blauverschiebung jeder einzelner Spin-Komponente und der Orientierung der Spins im Magnetfeld angesehen werden. Für das Photonlasing kann keine Magnetfeldwechselwirkung festgestellt werden, wodurch verdeutlicht wird, dass die Messung der Zeeman-Aufspaltung beziehungsweise der diamagnetischen Verschiebung im Magnetfeld als ein eindeutiges Werkzeug zur Unterscheidung zwischen Polariton-Kondensation und Photonlasing verwendet werden kann.
Identification of human host cell factors involved in \(Staphylococcus\) \(aureus\) 6850 infection
(2015)
Staphylococcus aureus is both a human commensal and a pathogen. 20%-30% of all individuals are permanently or occasionally carriers of S. aureus without any symptoms. In contrast to this, S. aureus can cause life-threatening diseases e.g. endocarditis, osteomyelitis or sepsis. Here, the increase in antibiotic resistances makes it more and more difficult to treat these infections and hence the number of fatalities rises constantly. Since the pharmaceutical industry has no fundamentally new antibiotics in their pipeline, it is essential to better understand the interplay between S. aureus and the human host cell in order to find new, innovative treatment options.
In this study, a RNA interference based whole genome pool screen was performed to identify human proteins, which play a role during S. aureus infections. Since 1,600 invasion and 2,271 cell death linked factors were enriched at least 2 fold, the big challenge was to filter out the important ones. Here, a STRING pathway analysis proved to be the best option. Subsequently, the identified hits were validated with the help of inhibitors and a second, individualised small interfering RNA-based screen.
In the course of this work two important steps were identified, that are critical for host cell death: the first is bacterial invasion, the second phagosomal escape. The second step is obligatory for intracellular bacterial replication and subsequent host cell death. Invasion in turn is determining for all following events. Accordingly, the effect of the identified factors towards these two crucial steps was determined. Under screening conditions, escape was indirectly measured via intracellular replication. Three inhibitors (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) could be identified for the invasion process. In addition, siRNAs targeted against 16 different genes (including CAPN2, CAPN4 and PIK3CG), could significantly reduce bacterial invasion. Seven siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) were able to inhibit intracellular replication significantly. Further studies showed that the IP3 receptor inhibitor 2-APB, the calpain inhibitor calpeptin and the proteasome inhibitor MG-132 are able to prevent phagosomal escape and as a consequence intracellular replication and host cell death.
In this context the role of calpains, calcium, the proteasome and the mitochondrial membrane potential was further investigated in cell culture. Here, an antagonistic behaviour of calpain 1 and 2 during bacterial invasion was observed. Intracellular calcium signalling plays a major role, since its inhibition protects host cells from death. Beside this, the loss of mitochondrial membrane potential is characteristic for S. aureus infection but not responsible for host cell death. The reduction of membrane potential can be significantly diminished by the inhibition of the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger.
All together, this work shows that human host cells massively contribute to different steps in S. aureus infection rather than being simply killed by bacterial pore-forming toxins. Various individual host cell factors were identified, which contribute either to invasion or to phagosomal escape and therefore to S. aureus induced cytotoxicity. Finally, several inhibitors of S. aureus infection were identified. One of them, 2-APB, was already tested in a sepsis mouse model and reduced bacterial load of kidneys.
Thus, this study shows valuable evidence for novel treatment options against S. aureus infections, based on the manipulation of host cell signalling cascades.
Pavlovian fear conditioning describes a form of associative learning in which a previously neutral stimulus elicits a conditioned fear response after it has been temporally paired with an aversive consequence. Once acquired, the fear response can be extinguished by repeatedly presenting the former neutral stimulus in the absence of the aversive consequence. Although most patients suffering from anxiety disorders cannot recall a specific conditioned association between a formerly neutral stimulus and the feeling of anxiety, the produced behavioral symptoms, such as avoidance or safety behavior to prevent the anticipated aversive consequence are commonly exhibited in all anxiety disorders. Moreover, there is considerable similarity between the neural structures involved in fear and extinction in the rodent and in the human. Translational research thus contributes to the understanding of neural circuitries involved in the development and maintenance of anxiety disorders, and further provides hypotheses for improvements in treatment strategies aiming at inhibiting the fear response.
Since the failure to appropriately inhibit or extinguish a fear response is a key feature of pathological anxiety, the present preclinical research focuses on the interplay between the amygdala and the medial prefrontal cortex (mPFC) during fear learning with particular regard to the prefrontal recruitment during fear extinction and its recall. By firstly demonstrating an increased mPFC activity over the time course of extinction learning with functional near-infrared spectroscopy, the main study of this dissertation focused on repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) as brain stimulation technique suitable to enhance extinction learning. Since hypofrontality is assumed to underlie the maintenance of pathological anxiety, rTMS application revealed an increased mPFC activity, which resulted in a decreased fear response on the behavioral level both during extinction learning as well as during the recall of extinction 24 hours later and in the absence of another stimulation. The following attempt to improve the generalization of extinction with rTMS from an extinguished stimulus to a second stimulus which was reinforced but not extinguished was at least partially evidenced. By revealing an increased prefrontal activity to the non-extinguished stimulus, the active and the placebo rTMS condition, however, did not differ on behavioral parameters. These preclinical findings were discussed in the light of genetic and environmental risk factors with special regard to the combination of a risk variant of the neuropeptide S receptor 1 gene polymorphism (NPSR1 rs324981) and anxiety sensitivity. While the protective homozygous AA genotype group showed no correlation with anxiety sensitivity, the NPSR1 T genotype group exhibited an inverse correlation with anxiety sensitivity in the presence of emotionally negative stimuli. In light of other findings assuming a role of the NPSR1 T allele in panic disorder, the revealed hypofrontality was discussed to define a risk group of patients who might particularly benefit from an augmentation of exposure therapy with rTMS.
Taken together, the presented studies support the central role of the prefrontal cortex in fear extinction and suggest the usefulness of rTMS as an augmentation strategy to exposure therapy in order to decrease therapy relapse rates. The combination of rTMS and extinction has been herein evidenced to modulate fear processes in a preclinical approach thereby establishing important implications for the design of future clinical studies.
Zusammenfassung
Im Rahmen einer HIV-Infektion treten bei etwa der Hälfte aller Infizierten im Verlauf der Erkrankung neurokognitive Störungen auf. Zwar ist seit der Einführung der ART die Prävalenz der schweren HIV-Demenz zurückgegangen, aber vor allem mildere Formen sprechen nicht zufriedenstellend auf diese Therapie an und spielen auf Grund der insgesamt verbesserten Lebenserwartung von HIV-Patienten eine immer größere werdende Rolle. Um eine wirksame Therapie gegen HAND entwickeln zu können, sind detaillierte Kenntnisse über die Pathogenese und die Identifizierung von Risikofaktoren notwendig. In der vorliegenden Arbeit sollten daher drei unterschiedliche Faktoren auf ihren Zusammenhang mit HAND überprüft werden: der HIV-Protease Subtyp, die Höhe der Immunaktivierung und der DAT-Polymorphismus.
Hierfür standen Blut- und Plasmaproben von 112 HIV-Patienten und 30 Kontrollpersonen aus Tansania zur Verfügung, bei denen zuvor im Rahmen einer anderen medizinischen Doktorarbeit verschiedene neuropsychologische Tests durchgeführt worden waren. Zur Bestimmung des HIV-Protease Subtyps wurde die Virus-RNA aus dem Patienten-Plasma isoliert, in DNA umgeschrieben, gereinigt und anschließend sequenziert. Die Sequenz wurde mit Hilfe der Stanford University Database in Hinblick auf den HIV-Subtyp analysiert. Die Höhe der Immunaktivierung wurde durch Konzentrationsbestimmung der Immunaktivierungsmarker suPAR und human LBP mittels ELISA erfasst. Die Bestimmung des DAT-Polymorphismus erfolgte durch Isolation der Patienten-DNA aus den Blutproben, nachfolgender PCR und anschließender Agarosegelelektrophorese.
Die Untersuchung dieser drei Faktoren auf ihren Zusammenhang mit der neuropsychologischen Performance ergaben folgende Ergebnisse: 1. Der HIV-Protease Subtyp A und rekombinante Formen, die Subtyp A enthalten, gehen mit signifikant schlechteren Testergebnissen einher als die anderen HIV-Protease Subtypen. 2. Eine höhere Immunaktivierung korreliert ebenfalls mit schlechteren Testergebnissen. 3. Der DAT-Polymorphismus zeigt keine signifikanten Zusammenhänge mit HAND. Des Weiteren geht der HIV-Protease Subtyp C mit einer niedrigeren Immunaktivierung einher als die anderen Subtypen.
Diese Beobachtungen führen zu der Überlegung, dass der HIV-Protease Subtyp A sowie eine hohe periphere Immunaktivierung Risikofaktoren für die Entwicklung von HAND darstellen könnten und eventuell für die Pathogenese von Bedeutung sind. Der DAT-Polymorphismus scheint hierbei hingegen keine Rolle zu spielen. Bei dem Vorliegen des Subtyps A bzw. einer hohen Immunaktivierung sollte demnach über einen früheren Zeitpunkt für den Therapiebeginn mit ART nachgedacht werden, um die Entstehung von HAND zu verzögern oder sogar zu verhindern. Auf Grund der hohen Immunaktivierung als Risikofaktor für neuropsychologische Beeinträchtigungen sollte auch der Einsatz von immunmodulierenden Substanzen diskutiert werden. Die niedrigere Immunaktivierung, die bei einer Infektion mit dem HIV-Protease Subtyp C nachgewiesen werden konnte, könnte ein Hinweis auf eine niedrigere Pathogenität infolge einer Anpassung dieses Subtyps an den Menschen sein.
Da es sich bei all den durchgeführten Untersuchungen um Post-hoc-Analysen handelt, sind dringend weitere Studien zur Überprüfung der gefundenen Zusammenhänge notwendig.
Aspergillus fumigatus is the most common cause for invasive fungal infections, a disease associated with high mortality in immune-compromised patients. CD1d-restricted invariant Natural Killer T (iNKT) cells compose a small subset of T cells known to impact the immune response towards various infectious pathogens. To investigate the role of human iNKT cells during A. fumigatus infection, we studied their activation as determined by CD69 expression and cytokine production in response to distinct fungal morphotypes in the presence of different CD1d⁺ antigen presenting cells using flow cytometry and multiplex ELISA. Among CD1d⁺ subpopulations, CD1d⁺CD1c⁺ mDCs showed the highest potential to activate iNKT cells on a per cell basis. The presence of A. fumigatus decreased this effect of CD1d⁺CD1c⁺ mDCs on iNKT cells and led to reduced secretion of TNF-α, G-CSF and RANTES. Production of other Th1 and Th2 cytokines was not affected by the fungus, suggesting an immune-modulating function for human iNKT cells during A. fumigatus infection.
In this work, Emilio de’ Cavalieri’s musical sources will serve as a platform in an attempt to overcome the lack of explicit original guidance and guidelines of performance practice of early basso continuo. It will offer a methodology that will allow the unraveling of implicit theory and practice hidden in the music sources themselves. The methodology of this work is based on the fact that Cavalieri’s Rappresentatione di Anima e di Corpo (Rome, 1600) is printed using a unique continuo notation, which is detailed, precise, and coherent—more so than any other contemporaneous printed source. Through thorough investigation of this continuo notation, it will be possible to enrich our practical as well as theoretical knowledge of the early basso continuo. A wide range of evidences will emerge, covering a wide spectrum, from general questions of instrumentation up to the very notes that should be played. Using a special notation for illustration, I will demonstrate how Cavalieri’s basso continuo figuration, when combined with the known rules of counterpoint, is at times equivalent to written-out realizations.
As part of this study, different models of contrapuntal phenomena will be analyzed, mainly in the context of cadences but also in the context of other progressions that deserve to be recognized as formulas. Their theoretical structure will be uncovered as well as their actual application in music and their manner of execution. The prevalence of each phenomenon will be examined in order to distinguish common and recurrent phenomena from rarely-used formulas. In order to do this, and due to problematic historical terminology, it will be necessary to create a set of new terms inspired by Cavalieri’s notation. Those terms will not be solely relevant to Cavalieri’s music; the models were made flexible so that they may prove useful for future discussions or studies of early continuo in general.
Out of the known early basso continuo sources, a “mini-compendium” of practical implications will be extracted in order to exhaust the practical knowledge implicit in them. This endeavor will be concluded with a list of rules and general advice drawn from the sources, but it will also reveal some problematic aspects of these sources.
This endeavor will make it possible to compare the “new” implicit practical information deduced in this study with the explicit known continuo sources, and assess to what extant Cavalieri’s continuo practices illuminate and complement the known knowledge from previously-studied yet opaque sources of basso continuo.
The focus of this dissertation is on Cavalieri’s music, but the findings proposed here will be traced so as to illuminate the broader realm of the early Baroque and the 17th century musical style at large. Finally, this new research about Cavalieri’s music and continuo, along reevaluating of its place among the common continuo sources, calls for redistribution of source materials on the traditional “shelf” of early basso continuo sources.
Summary (English)
I. Human induced global change threatens biodiversity and trophic interactions. Fragmentation is considered as one of the major threats to biodiversity and can cause reduced species richness, population declines, loss of genetic diversity and disruption of trophic interactions such as predation and parasitism. However forest fragmentation effects can be eclectic due to species specific traits. Specialist species with narrower niches or at higher trophic levels may be in danger of extinction whereas generalist species with less specific habitat requirements may even profit from fragmentation. In the tropics, known as “the” terrestrial biodiversity hotspots, even biodiversity inventories are often lacking, especially in forest canopies. Ongoing deforestation and resulting fragmentation in tropical regions are expected to heavily affect ecosystem functions by changes in biodiversity, community compositions and disruption of trophic interactions. It is even less unknown in what extent different global change drivers for example climate change and fragmentation interact. It is unlikely that deforestation will end, so that small secondary forest fragments will be important habitat elements that must be investigated to optimize their potential contribution to biodiversity conservation.
This dissertation aimed to disentangle the effects of forest fragmentation on trap-nesting bee and wasp communities in small secondary forest fragments addressing the following main questions:
1) Are there interactive effects between microclimate and fragmentation on the abundance of bees and wasps, their mortality - and parasitism rates (Chapter II)?
2) How does fragmentation affect bee biodiversity from canopy to the understory with considerations of single species patterns (Chapter III)?
3) How is fragmentation affecting diversity and community composition of different trophic levels between understory and canopy with emphasis on the host-antagonist relation? (Chapter IV).
II. A variety of global change drivers affect biodiversity and trophic interactions. The combined effects of habitat fragmentation and climate change are poorly understood and with ongoing deforestation and agricultural intensification secondary rainforest fragments might contribute to biodiversity conservation and mitigation of climate warming. This chapter investigated the interactive effects of habitat fragmentation and microclimate on the abundance and biotic interactions of trap-nesting bees and wasps in secondary forest fragments in the Northeastern lowlands of Costa Rica.
Habitat area did not affect hymenopteran abundance, parasitism and mortality rates, but tree location- from the forest border to the forest center- influenced all variables. Interactive effects were found such as in the higher mortality rates at interior locations in larger fragments. Mean temperature at edge and interior locations led to significant effects on all tested variables and interactive effects between temperature and tree locations were found. Abundances at interior locations were significantly higher with increasing temperatures. Mortality rates at interior location increased at lower mean temperatures, whereas higher temperatures at edges marginally increased mortality rates. Our results indicate, that edge effects, mediated by altered microclimatic conditions, significantly change biotic interactions of trap-nesting hymenopterans in small secondary fragments.
III. This chapter focusses on the vertical distribution of bees, their parasitism and mortality rates as well as single species patterns in relation to fragment size and edge effects in secondary rainforest remnants.
No size effects on bee abundance, bee diversity and on parasitism- and mortality rates were found. Bees were least abundant at the intermediate height and were most abundant in the understory; whereas the highest diversity was found in the canopy. Tree location had no effect on bee abundance, but on bee diversity since most species were found in the forest interior. The cuckoo bees Aglaomelissa duckei and Coelioxys sp. 1 only partly followed the patterns of their hosts, two Centris species.
Edge effects greatly influenced the bee community, so that the amount of edge habitat in secondary forest fragments will influence the conservation value for bees.
IV. In this section the effects of habitat fragmentation on biodiversity, on community structure of hosts and natural enemies as well as the relation of hosts and antagonists were investigated from the understory to the canopy. The results stress the importance to monitor biodiversity, community composition and trophic interactions from the understory to the canopy. The higher trophic level of the antagonists was found to be more sensitive to fragment size compared to their hosts. Again edge effects were found to be the dominant driver since both host and antagonist richness, as well as community compositions were strongly affected. Ongoing fragmentation and increased amount of edge habitat could favor few abundant disturbance-adapted species over the rare and more diverse forest-adapted species. A positive-density dependent parasitism rate was demonstrated, as well as an increase of the parasitism rate not only with antagonist abundance but also diversity.
Small secondary forest fragments surely can contribute to the conservation of biodiversity and trophic interactions, but increase of edge habitat will have negative consequences on above-ground nesting Hymenoptera, so that important interactions such as pollination, predation and parasitism could be disrupted. Therefore small forest fragments could contribute to biodiversity conservation but will not be able to compensate for the loss of large areas of primary forests.
V. This dissertation contributes to the understanding of habitat area - and edge effects as well as the interaction of those with microclimatic conditions in small secondary rainforest fragments. As study system trap nests inhabited by solitary above-ground nesting bees, wasps and their natural enemies were chosen because they allow to study trophic interactions along their whole vertical distribution from the understory to the canopy. The effect of fragment size was rather weak, however, larger sizes affected the diversity of natural enemies positively, proofing the hypothesis that higher trophic levels react more sensitive to habitat loss. Edge effects heavily affected the abundance, diversity and community composition of hosts and their natural enemies as well as parasitism and mortality rates. Increased edge conditions resulting from ongoing fragmentation and deforestation will therefore negatively affect bees, wasps and their trophic interactions with natural enemies. Those changes affect important processes such as pollination, predation and parasitism, which could result in changes of ecosystem functioning. This study showed the importance to include all strata in biodiversity monitoring since height did matter for the trap-nesting communities. Diversity was shown to be higher in the canopy and community composition did change significantly. To conclude we could show that secondary forest fragments can sustain a trap-nesting bee and wasp community, but the amount of interior habitat is highly important for the conservation of forest-adapted species. Probably the conservation of large primary forest in combination with a high habitat connectivity, for example with small secondary forest fragments, will help to sustain biodiversity and ecosystem functioning better than the mere presence of small forest fragments.
Merocyanine Dyes as Organic Semiconductors for Vacuum-processed Solar Cell and Transistor Devices
(2015)
The present thesis comprises the synthesis of new functional merocyanine dyes, the study of their electro-optical properties as well as solid state packing and their application as p-type semiconductor materials in transistor and solar cell devices. The absorption properties of the obtained compounds could be modified by variation of the donor unit, the introduction of electron-withdrawing substituents in the acceptor unit or elongation of the polymethine chain. For a particular dye, the absorption band could be shifted by more than 160 nm by increasing the solvent polarity due to a conformational switch between a merocyanine-like and a cyanine-like structure. Single crystal analyses revealed that the studied dyes tend to pack either in an antiparallel fashion forming dimers with no overall dipole moment or in a staircase-like pattern where the dipole moments point to the same direction and are only balanced by another staircase oriented in the opposite direction (stair dimer). With respect to application as semiconductor materials, the latter packing arrangement resulted most favorable for charge carrier mobility. We concluded that this packing motif is preserved in the solar cell devices, where the selenium-containing dye afforded the highest performance of this series for an optimized planar-mixed heterojunction solar cell (6.2 %).
In this work, Emilio de’ Cavalieri’s musical sources will serve as a platform in an attempt to overcome the lack of explicit original guidance and guidelines of performance practice of early basso continuo. It will offer a methodology that will allow the unraveling of implicit theory and practice hidden in the music sources themselves. The methodology of this work is based on the fact that Cavalieri’s Rappresentatione di Anima e di Corpo (Rome, 1600) is printed using a unique continuo notation, which is detailed, precise, and coherent—more so than any other contemporaneous printed source. Through thorough investigation of this continuo notation, it will be possible to enrich our practical as well as theoretical knowledge of the early basso continuo. A wide range of evidences will emerge, covering a wide spectrum, from general questions of instrumentation up to the very notes that should be played. Using a special notation for illustration, I will demonstrate how Cavalieri’s basso continuo figuration, when combined with the known rules of counterpoint, is at times equivalent to written-out realizations.
As part of this study, different models of contrapuntal phenomena will be analyzed, mainly in the context of cadences but also in the context of other progressions that deserve to be recognized as formulas. Their theoretical structure will be uncovered as well as their actual application in music and their manner of execution. The prevalence of each phenomenon will be examined in order to distinguish common and recurrent phenomena from rarely-used formulas. In order to do this, and due to problematic historical terminology, it will be necessary to create a set of new terms inspired by Cavalieri’s notation. Those terms will not be solely relevant to Cavalieri’s music; the models were made flexible so that they may prove useful for future discussions or studies of early continuo in general.
Out of the known early basso continuo sources, a “mini-compendium” of practical implications will be extracted in order to exhaust the practical knowledge implicit in them. This endeavor will be concluded with a list of rules and general advice drawn from the sources, but it will also reveal some problematic aspects of these sources.
This endeavor will make it possible to compare the “new” implicit practical information deduced in this study with the explicit known continuo sources, and assess to what extant Cavalieri’s continuo practices illuminate and complement the known knowledge from previously-studied yet opaque sources of basso continuo.
The focus of this dissertation is on Cavalieri’s music, but the findings proposed here will be traced so as to illuminate the broader realm of the early Baroque and the 17th century musical style at large. Finally, this new research about Cavalieri’s music and continuo, along reevaluating of its place among the common continuo sources, calls for redistribution of source materials on the traditional “shelf” of early basso continuo sources.
The thesis focuses on the valuation of firms in a system context where cross-holdings of the firms in liabilities and equities are allowed and, therefore, systemic risk can be modeled on a structural level. A main property of such models is that for the determination of the firm values a pricing equilibrium has to be found. While there exists a small but growing amount of research on the existence and the uniqueness of such price equilibria, the literature is still somewhat inconsistent. An example for this fact is that different authors define the underlying financial system on differing ways. Moreover, only few articles pay intense attention on procedures to find the pricing equilibria. In the existing publications, the provided algorithms mainly reflect the individual authors' particular approach to the problem. Additionally, all existing methods do have the drawback of potentially infinite runtime.
For these reasons, the objects of this thesis are as follows. First, a definition of a financial system is introduced in its most general form in Chapter 2. It is shown that under a fairly mild regularity condition the financial system has a unique existing payment equilibrium. In Chapter 3, some extensions and differing definitions of financial systems that exist in literature are presented and it is shown how these models can be embedded into the general model from the proceeding chapter. Second, an overview of existing valuation algorithms to find the equilibrium is given in Chapter 4, where the existing methods are generalized and their corresponding mathematical properties are highlighted. Third, a complete new class of valuation algorithms is developed in Chapter 4 that includes the additional information whether a firm is in default or solvent under a current payment vector. This results in procedures that are able find the solution of the system in a finite number of iteration steps. In Chapter 5, the developed concepts of Chapter 4 are applied to more general financial systems where more than one seniority level of debt is present. Chapter 6 develops optimal starting vectors for non-finite algorithms and Chapter 7 compares the existing and the new developed algorithms concerning their efficiency in an extensive simulation study covering a wide range of possible settings for financial systems.
\textbf{Molecular Determinants of Drug-Target Residence Times of Bacterial Enoyl-ACP Reductases.} Whereas optimization processes of early drug discovery campaigns are often affinity-driven, the drug-target residence time $t_R$ should also be considered due to an often strong correlation with \textit{in vivo} efficacy of compounds. However, rational optimization of $t_R$ is not straightforward and generally hampered by the lack of structural information about the transition states of ligand association and dissociation. The enoyl-ACP reductase FabI of the fatty acid synthesis (FAS) type II is an important drug-target in antibiotic research. InhA is the FabI enzyme of \textit{Mycobacterium tuberculosis}, which is known to be inhibited by various compound classes. Slow-onset inhibition of InhA is assumed to be associated with the ordering of the most flexible protein region, the substrate binding loop (SBL). Diphenylethers are one class of InhA inhibitors that can promote such SBL ordering, resulting in long drug-target residence times. Although these inhibitors are energetically and kinetically well characterized, it is still unclear how the structural features of a ligand affect $t_R$.
Using classical molecular dynamics (MD) simulations, recurring conformational families of InhA protein-ligand complexes were detected and structural determinants of drug-target residence time of diphenyl\-ethers with different kinetic profiles were described. This information was used to deduce guidelines for efficacy improvement of InhA inhibitors, including 5'-substitution on the diphenylether B-ring. The validity of this suggestion was then analyzed by means of MD simulations.
Moreover, Steered MD (SMD) simulations were employed to analyze ligand dissociation of diphenylethers from the FabI enzyme of \textit{Staphylococcus aureus}. This approach resulted in a very accurate and quantitative linear regression model of the experimental $ln(t_R)$ of these inhibitors as a function of the calculated maximum free energy change of induced ligand extraction. This model can be used to predict the residence times of new potential inhibitors from crystal structures or valid docking poses.
Since correct structural characterization of the intermediate enzyme-inhibitor state (EI) and the final state (EI*) of two-step slow-onset inhibition is crucial for rational residence time optimization, the current view of the EI and EI* states of InhA was revisited by means of crystal structure analysis, MD and SMD simulations. Overall, the analyses affirmed that the EI* state is a conformation resembling the 2X23 crystal structure (with slow-onset inhibitor \textbf{PT70}), whereas a twist of residues Ile202 and Val203 with a further opened helix $\alpha 6$ corresponds to the EI state. Furthermore, MD simulations emphasized the influence of close contacts to symmetry mates in the SBL region on SBL stability, underlined by the observation that an MD simulation of \textbf{PT155} chain A with chain B' of a symmetry mate in close proximity of the SBL region showed significantly more stable loops, than a simulation of the tetrameric assembly. Closing Part I, SMD simulations were employed which allow the delimitation of slow-onset InhA inhibitors from rapid reversible ligands.
\textbf{Prediction of \textit{Mycobacterium tuberculosis} Cell Wall Permeability.} The cell wall of \textit{M. tuberculosis} hampers antimycobacterial drug design due to its unique composition, providing intrinsic antibiotic resistance against lipophilic and hydrophilic compounds. To assess the druggability space of this pathogen, a large-scale data mining endeavor was conducted, based on multivariate statistical analysis of differences in the physico-chemical composition of a normally distributed drug-like chemical space and a database of antimycobacterial--and thus very likely permeable--compounds. The approach resulted in the logistic regression model MycPermCheck, which is able to predict the permeability probability of small organic molecules based on their physico-chemical properties. Evaluation of MycPermCheck suggests a high predictive power. The model was implemented as a freely accessible online service and as a local stand-alone command-line version.
Methodologies and findings from both parts of this thesis were combined to conduct a virtual screening for antimycobacterial substances. MycPermCheck was employed to screen the chemical permeability space of \textit{M. tuberculosis} from the entire ZINC12 drug-like database. After subsequent filtering steps regarding ADMET properties, InhA was chosen as an exemplary target. Docking to InhA led to a principal hit compound, which was further optimized. The quality of the interaction of selected derivatives with InhA was subsequently evaluated using MD and SMD simulations in terms of protein and ligand stability, as well as maximum free energy change of induced ligand egress. The results of the presented computational experiments suggest that compounds with an indole-3-acethydrazide scaffold might constitute a novel class of InhA inhibitors, worthwhile of further investigation.
Einleitung
Fokale Gelenkknorpeldefekte treten in der Deutschen Bevölkerung mit einer geschätzten Inzidenz von über 300 000 jährlichen Fällen auf. In der US-amerikanischen Bevölkerung wird jährlich von über 600 000 Fällen ausgegangen. Aufgrund der Insuffizienz körpereigener Heilungskapazitäten und verfügbarer Therapieverfahren, schreitet die Erkrankung regelhaft zur post-traumatischen Arthrose fort. Neben der individuellen Lebensqualitätseinschränkung besteht eine sozioökonomische Bedeutung mit geschätzten Krankheitskosten von jährlich über 10 Milliarden US Dollar in den Vereinigten Staaten.
Das Versagen zellbasierter Therapieverfahren beruht unter anderem auf einer Insuffizienz der chondrogenen Differenzierung, sowie der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten mit nachfolgender Osteogenese analog den Vorgängen in der Wachstumsfuge. Für die Induktion der chondrogenen Differenzierung stehen insbesondere Mitglieder der TGF-β Superfamilie, wie BMP-2, zur Verfügung. Diese sind jedoch ebenso durch eine Induktion der hypertrophen Differenzierung gekennzeichnet. Zur Induktion der Chondrogenese unter Umgehung der TGF-β-Signalwege wurde IHH in-vitro als vielversprechend beschrieben. Bislang besteht jedoch kein Nachweis der in-vivo Effektivität von IHH zur Knorpelreparation.
Die Schaffung eines Wachstumsfaktor-Milieus in der Gelenkknorpelläsion in-vivo stellt ebenso eine Herausforderung dar. Diesbezüglich wurde ein vereinfachtes Verfahren zum lokalisierten in-vivo Gentransfer mittels adenoviraler Vektoren und autologen Knochenmarkskoagulaten anhand von Markergenen beschrieben. Die Effektivität jenes Verfahrens zur in-vivo Knorpelreparation wurde noch nicht gezeigt.
Zweck dieses kontrollierten in-vivo Experimentes ist es, mittels des oben genannten Gentransferverfahrens die Wirksamkeit von BMP-2 und IHH zur Reparation von osteochondralen Defekten in New Zealand White Rabbits nachzuweisen. Die zentrale Hypothese lautete, dass BMP2 beziehungsweise IHH Gentransfer in einer höheren langzeit-histologischen Qualität des Reparationsgewebes resultiert. Explorativ sollten dabei Unterschiede in den einzelnen Dimensionen der Gewebequalität anhand des ICRS-II Histology Scoring Systems, sowie der Grad der Typ I (als Faserknorpelmarker), Typ II (als Marker hyalinen Gelenkknorpels) und Typ X Kollagen Deposition (als Marker hypertropher Chondrozyten) beschrieben werden.
Material und Methoden
Als Tiermodel wurden bilaterale 3,2 mm durchmessende osteochondrale Bohrlochdefekte in der Trochlea von New Zealand White Rabbits verwendet (n=10 unabhängige Tiere, 20 Gelenke). Die Defekte wurden mit autologen Knochenmarkkoageln gefüllt, die nach vorheriger Beckenkammaspiration gewonnen wurden. In den experimentellen Gruppen wurden die Knochenmarkkoagel beladen mit jeweils 1 x 1011 infektiösen Partikeln adenoviraler Vektoren, die cDNA codierend für BMP2 (n=3 Tiere, entsprechend 6 Gelenken) oder IHH (n=4; 8) enthielten. In der Kontrollgruppe wurde das nicht-chondrogene Markergen GFP (n=3; 6) transferiert. Beide Gelenke eines Tieres wurden der gleichen Gruppe zugeordnet. Die histologische Gewebequalität wurde nach 13 Wochen anhand des ICRS-II Scoringsystems durch 3 unabhängige, verblindete Untersucher bewertet. Als primäre Outcomes wurden der ICRS-II Parameter „Generelles Assessment“, sowie die Typ II Kollagen positive Fläche designiert. Als explorative Outcomes wurden die verbleibenden ICRS-II Parameter, sowie die Typ I und Typ X Kollagen Deposition bewertet. Die Korrelation zwischen den Untersuchern wurde nach Pearson ermittelt. Zum Test auf Signifikanz der Gruppenunterschiede wurde ein lineares gemischtes Modell verwendet, welches einer mögliche Abhängigkeit beider Gelenke eines Tieres Rechnung trägt.
Ergebnisse
Qualitative Bewertung des Reparationsknorpels. Dreizehn Wochen nach der Intervention zeigten die meisten der BMP-2 behandelten Gelenke (4 von 6) und alle der IHH behandelten Gelenke (8 von 8) hyalin-artigen Reparationsknorpel, während alle GFP behandelten Kontrollgelenke (6 von 6) faserknorpel-artiges Reparationsgewebe zeigten. Zwei BMP-2 behandelten Gelenke zeigten eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation.
Primäre Outcomes - ICRS-II „Generelles Assessment“ und Typ II Kollagen positive Fläche. IHH und BMP-2 behandelte Gelenke zeigten im Vergleich zu GFP höhere Punktzahlen in dem ICRS-II „Generelles Assessment“ Parameter: +33.0 (95% Konfidenzintervall: -0.4, +66.4) Punkte für IHH und +8.5 (-26.6, +43.7) Punkte für BMP-2. Beide Effekte erreichten nicht das Level statistischer Signifikanz (p=0.052 und 0.537). IHH erhöhte die Typ II Kollagen Deposition in der Defektregion, während BMP-2 Gelenke keinen Unterschied zu GFP Kontrollen zeigten: +18.7 (-4.5, +42.0) Punkte für IHH und +0.0 (-29.7, +29.8) Punkte für BMP-2. Die erhöhte Typ II Kollagendeposition erreichte nicht das konventionelle Level statistischer Signifikanz (p=0.093).
Sekundäre Outcomes - ICRS-II Parameter. In dem Vergleich von BMP-2 mit GFP Kontrollen wurde in keinem der 12 untersuchten Parameter ein signifikanter Unterschied festgestellt. IHH Gentransfer resultierte hingegen in höheren Punktzahlen in allen untersuchten Parametern, wobei der Unterschied in 5 der 12 Parameter das Niveau statistischer Signifikanz erreichte. Ein um 21.5 Punkte (+3.6, +39.4) erhöhter Score wurde für den Parameter „Gewebemorphologie“ beobachtet, sowie +21.0 (+6.4, +35.7) für „Chondrozytäres Clustering“, +31.2 (+0.8, +61.5) für „Formation der Tidemark“, +17.3 (+0.2, +34.5) für „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und +35.0 (+4.6, +65.2) für das „Assessment der mittleren und tiefen Zone“.
Sekundäre Outcomes - Marker chondrozytärer Hypertrophie. Eine perizelluläre Deposition von Typ X Kollagen wurde in allen Gruppen beobachtet. Eine deutlich gesteigerte Deposition wurde nur in den Gelenken beobachtet, die nach BMP2 Gentransfer eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation zeigten.
Diskussion
Das hier beschriebene Experiment stellt die erste Veröffentlichung der Wirksamkeit von IHH zur Verbesserung der histologischen Knorpelqualität von in-vivo therapierten Gelenkknorpeldefekten dar [175]. Die Hypothese, dass IHH zu einer verbesserten histologischen Knorpelqualität führt wurde bestätigt, während die Hypothese zu den positiven Effekten von BMP-2 wiederlegt wurde. IHH führte zu besseren Ergebnissen in allen Untersuchten Parametern, das Niveau statistischer Signifikanz wurde dabei in den Parametern „Gewebemorphologie“, „Chondrozytäres Clustering“, „Formation der Tidemark“, „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und „Assessment der mittleren und tiefen Zone“ erreicht. Das primäre Ziel dieses Experimentes war es, den „Proof of concept“ zu liefern, dass IHH auch in-vivo ein attraktiver Faktor für die Induktion der Chondrogenese darstellt. Das langfristige Ziel ist die Induktion der Chondrogenese unter Umgehung des TGF-β Signalweges zu erzielen, um eine folgende hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten und die folgende Ossifikation des reparierten Defektes zu verhindern.
Die Limitationen der Studie umfassen die ausschließlich histologische und immunhistochemische durchgeführte Bewertung der Knorpelqualität und eine eingeschränkte statistische Power. Ob IHH es vermag die hypertrophe Differenzierung zu umgehen und somit eine langfristige hyaline Knorpelreparation zu ermöglichen, ist in weiteren präklinischen Studien mit biochemischer und molekulargenetischer Analyse der Hypertrophie-Marker zu untersuchen. In Bezug auf den klinischen Einsatz zur Knorpelreparation erscheint der Einsatz der Wachstumsfaktoren als Protein auf funktionalisierten Matrices vielversprechend.
BMP-2 wird aufgrund der hier beobachteten intraläsionalen Knochenformation nach BMP2 Gentransfer als nicht geeignet zur Unterstützung der Knorpelreparation in-vivo bewertet.
Diese Forschungsarbeit beschreibt alle Aspekte der Entwicklung eines neuartigen, autonomen Quadrokopters, genannt AQopterI8, zur Innenraumerkundung. Dank seiner einzigartigen modularen Komposition von Soft- und Hardware ist der AQopterI8 in der Lage auch unter widrigen Umweltbedingungen autonom zu agieren und unterschiedliche Anforderungen zu erfüllen. Die Arbeit behandelt sowohl theoretische Fragestellungen unter dem Schwerpunkt der einfachen Realisierbarkeit als auch Aspekte der praktischen Umsetzung, womit sie Themen aus den Gebieten Signalverarbeitung, Regelungstechnik, Elektrotechnik, Modellbau, Robotik und Informatik behandelt. Kernaspekt der Arbeit sind Lösungen zur Autonomie, Hinderniserkennung und Kollisionsvermeidung.
Das System verwendet IMUs (Inertial Measurement Unit, inertiale Messeinheit) zur Orientierungsbestimmung und Lageregelung und kann unterschiedliche Sensormodelle automatisch detektieren. Ultraschall-, Infrarot- und Luftdrucksensoren in Kombination mit der IMU werden zur Höhenbestimmung und Höhenregelung eingesetzt. Darüber hinaus werden bildgebende Sensoren (Videokamera, PMD), ein Laser-Scanner sowie Ultraschall- und Infrarotsensoren zur Hindernis-erkennung und Kollisionsvermeidung (Abstandsregelung) verwendet. Mit Hilfe optischer Sensoren kann der Quadrokopter basierend auf Prinzipien der Bildverarbeitung Objekte erkennen sowie seine Position im Raum bestimmen. Die genannten Subsysteme im Zusammenspiel erlauben es dem AQopterI8 ein Objekt in einem unbekannten Raum autonom, d.h. völlig ohne jedes externe Hilfsmittel, zu suchen und dessen Position auf einer Karte anzugeben. Das System kann Kollisionen mit Wänden vermeiden und Personen autonom ausweichen. Dabei verwendet der AQopterI8 Hardware, die deutlich günstiger und Dank der Redundanz gleichzeitig erheblich verlässlicher ist als vergleichbare Mono-Sensor-Systeme (z.B. Kamera- oder Laser-Scanner-basierte Systeme).
Neben dem Zweck als Forschungsarbeit (Dissertation) dient die vorliegende Arbeit auch als Dokumentation des Gesamtprojektes AQopterI8, dessen Ziel die Erforschung und Entwicklung neuartiger autonomer Quadrokopter zur Innenraumerkundung ist. Darüber hinaus wird das System zum Zweck der Lehre und Forschung an der Universität Würzburg, der Fachhochschule Brandenburg sowie der Fachhochschule Würzburg-Schweinfurt eingesetzt. Darunter fallen Laborübungen und 31 vom Autor dieser Arbeit betreute studentische Bachelor- und Masterarbeiten.
Das Projekt wurde ausgezeichnet vom Universitätsbund und der IHK Würzburg-Mainfranken mit dem Universitätsförderpreis der Mainfränkischen Wirtschaft und wird gefördert unter den Bezeichnungen „Lebensretter mit Propellern“ und „Rettungshelfer mit Propellern“. Außerdem wurde die Arbeit für den Gips-Schüle-Preis nominiert. Absicht dieser Projekte ist die Entwicklung einer Rettungsdrohne. In den Medien Zeitung, Fernsehen und Radio wurde über den AQopterI8 schon mehrfach berichtet.
Die Evaluierung zeigt, dass das System in der Lage ist, voll autonom in Innenräumen zu fliegen, Kollisionen mit Objekten zu vermeiden (Abstandsregelung), eine Suche durchzuführen, Objekte zu erkennen, zu lokalisieren und zu zählen. Da nur wenige Forschungsarbeiten diesen Grad an Autonomie erreichen, gleichzeitig aber keine Arbeit die gestellten Anforderungen vergleichbar erfüllt, erweitert die Arbeit den Stand der Forschung.
Following the early experiences in aviation, medical simulation has rapidly
evolved into one of the most novel educational tools of the last three decades. In addition to its
use in training individuals or teams in crisis resource management, simulation has been studied as
a tool to evaluate technical and non-technical skills of individuals as well as, more recently,
entire medical teams.
It is usually fairly difficult to obtain clinical reference data from critical events to refute
claims that the management of actual events fell below what could reasonably be expected and we
demonstrated the use of rank order statistics to calculate quantiles with confidence limits for
management times of critical obstetrical events using data from realistic simulation. This approach
could be used to describe the distribution of treatment times in order to assist in deciding what
performance may constitute an outlier. It can also identify particular challenges of clinical
practice and allow the development of educational curricula. While the information derived from
simulation has to be interpreted with a high degree of caution for a clinical context, it may
represent a further ‘added value’ or important step in establishing simulation as a training tool
and to provide information that could be used in an appropriate clinical context for adverse
events. Large amounts of data (such as from a simulation registry) would allow the calculation of
acceptable confidence intervals for the required
outcome parameters as well as actual tolerance limits.
Lattice forces are based on the attraction between the single moieties of molecules. The strength of lattice forces has an impact on the solid state and related physical properties such as melting point, boiling point, vapor pressure solvation and solubility. For solvation to occur, energy is required to break the lattice forces attracting ions and molecules among themselves. The energy for breaking up the attraction between the molecules is gained from the energy released when ions or molecules of the lattice associate with molecules of the solvent. Solubility is therefore, directly linked to the energy which is required to break the lattice forces and the energy which is liberated by solvation of the molecules or ions. Based on this relation, the lattice forces in two acidic compounds and a neutral compound were subsequently lowered by different approaches with the intention to increase the solubility, supersaturation, and dissolution rate.
The conversion to an ionic liquid and the embedding of the compound in a pH-sensitive matrix in an amorphous state were investigated with an acidic compound and its pro-drug. The tetrabutylphosphonium (TBPH) salt showed the most promising properties among the tested counter ions. It alters the properties of the compound from a highly crystalline physicochemical state to an amorphous readily soluble material showing supersaturation in a wider pH range and higher solubility than the sodium and potassium salts. A solid dispersion approach was developed in parallel. Solid dispersions with two different pH-sensitive polymers and different drug load were prepared by lyophilization to determine the miscibility of the compound and the polymer by differential scanning calorimetry (DSC). A miscibility of 50% of the amorphous acid with the pH-sensitive Eudragit L100-55 matrix and a miscibility of 40% with hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate (HPMC-AS) was found. Both approaches, the TBPH salt and the solid dispersion based on the pH-sensitive Eudragit L100-55 were tested in vivo. The TBPH salt was dosed in a buffered solution to prevent precipitation in the acidic stomach pH. This resulted in BAV higher than the crystalline suspension but lower than the solid dispersion. There were no acute toxicology effects seen. Thus, TBPH was considered safe for further studies. The TBPH salts were very hygroscopic, sticky and prone to precipitation as free compound when exposed to low pH when simulating the passage through the stomach. Thus, the principle of the ionic liquid was combined with the principle of an amorphous solid dispersion. This mitigated the risk of precipitation of the TBPH salt during the passage of the stomach. Also delinquency upon open storage was improved by embedding the TBPH salt in a pH-sensitive polymer. Dissolution tests mimicking the pH gradient in the gastro intestinal tract confirmed the protective properties of the pH-sensitive polymer matrices against recrystallization at low stomach pH in vitro. Furthermore, supersaturation at pH ranges relevant in the intestines of preclinical species or humans was observed. The TBPH solid dispersion showed superior supersaturation behavior in vitro compared to the free acid in pH-sensitive matrix. However, equally increased bioavailability (BAV) was observed when the amorphous solid dispersion contained the free acid form or the TBPH salt. Absorption seemed to be so fast that the short in vitro supersaturation observed for the free from in pH-sensitive matrix was already sufficient for complete absorption within 15 - 30 minutes. This is in accordance with the short tmax of around 15 - 30 minutes after oral application of the low lattice force principles. The pharmacokinetic (PK) profile became the main focus of further optimization as the BAV was maximized already. Early maximal plasma concentration (tmax) went along with high maximal plasma concentration (Cmax) for the low lattice force principles. Central nervous system related side effects as consequence of the PK profile with such a high Cmax were likely to happen and therefore, the formulation principles were modified to maintain the doubled BAV and reduce the observed Cmax. Additionally, the compound showed a short half-life requiring a two times daily dose, which is suboptimal for a chronic treatment. The amorphous acid in pH-matrix showed a modified PK profile when dosed in a hydrogel but not in an oleo gel. Surprisingly, administration of the TBPH salt in pH-matrix suspended in oil showed a massive delay of the tmax to 8 hours and a reduction of Cmax by factor 2 - 3 with unchanged good BAV when administered as a suspension in oil without increased viscosity. TBPH salt solution with a high viscosity resulted in the same PK profile as when administered without increased viscosity.
The animal model was changed from rat to dog. The dose was limited to 15 mg/dog since they reacted much more sensitively to the drug. BAV at this dose level was 100% for the crystalline suspension already, thus the focus of this study was not increasing BAV but to achieve prolonged and/or delayed exposure using different formulation principles elaborated in rats before. An immediate release formulation of 3 mg was combined with a delayed/modified release principle containing 12 mg of the compound. An additional study arm was conducted with a remote controlled device programmed to deliver a first dose of 3 mg instantaneously after passing the stomach and a second dose of 12 mg when entering the caecum. The tmax remained short for all formulation principles and it seemed that delayed and modified release lead to BAV reduction. The modified PK profiles could not be translated to an oral dog model which endorsed the hypothesis of an absorption window; however, the in vitro results could be translated to a dog model for colonic absorption. A nanosuspension of the crystalline compound, the TBPH salt in pH-matrix and the TBPH salt of the pro-drug of the compound were administered rectally to determine colonic absorption. The nanosuspension showed exposure around the limit of quantification whereas the TBPH in pH-matrix showed 4% BAV and the pro-drug as TBPH salt in pH-matrix resulted in 12% BAV although the pro-drug is factor 3 less soluble. This was in line with the increased permeation of the pro-drug which was observed in the Caco2 experiments. The bioavailability was increased by using the low lattice force principles and validated the hypothesis for the acidic drug and its pro-drug in the colonic dog model. Chemical and physicochemical stability of the investigated solid dispersions was confirmed for at least 18 months at room temperature.
Amorphous solid dispersions were investigated to lower lattice forces of a neutral molecule. Solid dispersions are well known from literature; however, they are not frequently used as principles for dosage forms due to limitations in physical stability and complex manufacturing processes. A viable formulation principle was developed for a neutral compound assuming that the stability of a solid dispersion with a drug load below the maximal miscibility will be better than one which exceeds the maximal miscibility. The dispersed and amorphous state of the neutral compound resulted in a higher energy level and chemical potential compared to a crystalline form implying that they are thermodynamically instable and sensitive to recrystallization. This was confirmed by the fast recrystallization of an amorphous solid dispersion made from HPMC with 50% drug load which recrystallized within a few days. Solid dispersions with different drug loads in different polymers and in polymer mixtures were prepared by lyophilization. The miscibility of the compound and the polymer was determined by DSC as the miscibility is a surrogate for maximal stable drugload of the solid dispersion. HPMC was found to be miscible with 20% compound confirming the instability of the 50% HPMC solid dispersion observed earlier. Based on dosing needs, a miscibility/drug load of at least 30% was mandatory because of the dosing requirements to dose less than 1500 mg of final formulation. This was considered as maximal swallowable volume for later clinical development. Thus, all systems with a miscibility higher or equal to 30% drug in polymer were evaluated in an in vitro dissolution test and ranked in comparison with amorphous pure compound, crystalline compound and a 20% drug load solid dispersion made from HPMC. The HPMC based solid dispersion which gave good exposure in previous in vivo experiments did not support the high drugload that was needed. Therefore, similar in vitro behavior of this solid dispersion should result in similar in vivo performance. The polyvinylpyrrolidone (PVP) based solid dispersions scored with high drug load and medium initial kinetic solubility. The Soluplus based solid dispersion offer lower drug load and slightly lower initial kinetic solubility, but showed an extended supersaturation. The 4 best performing systems were evaluated in rats. They resulted in a short Tmax of 15 minutes and BAV higher than 85% indicating fast and complete absorption. The reference HPMC based solid dispersion with a drug load of 20% showed 65% BAV. This showed that higher drug loads were feasible and did not limit absorption in this animal model.
Since the estimated human dose required a higher formulation density than obtained from lyophilization or spray drying, melt extrusion of the solid dispersion was considered to be the most adequate technology. The process temperature needed to be below 200 °C as this value represents the degradation temperature of the polymers. It was investigated by differential scanning calorimetry whether the compound can be mixed with the molten polymer. None of the polymers could dissolve the crystalline compound below the degradation point of the polymer. The temperature had to be increased to 260 °C until the compound was molten together to a monophasic system with polymer. This resulted in degradation of the polymers. Therefore, different plasticizers and small organic molecules with similar functional groups as the compound were investigated on their ability to reduce the melting point of the mixture of polymer and compound. Positive results were obtained with several small molecules. Based on a literature review, nicotinamide had the least concerning pharmaceutical activities and was chosen for further development. Solid dispersions with the same composition as the ones tested in rat were prepared with 9% nicotinamide as softener. Extrusion without nicotinamide was not possible at 135 °C or at 170 °C whereas the addition of 9% nicotinamide led to a homogenous extrudate when processed at 135 °C. The solid state of the extrudates was not molecularly dispersed but the compound was in a crystalline state. They could not reach the in vitro performance observed for the lyophilized solid dispersions with Soluplus or PVP derivatives. Nevertheless, the performances in the supersaturation assay were comparable to the HPMC based lyophilized solid dispersion. The Soluplus and PVP based crystalline extrudates were evaluated in a dog PK showing that the crystalline solid dispersion does not enable BAV higher than 90% within 24 hours after application. In parallel, the hygroscopicity of the meltextrudates was investigated by DVS and the best performing system based on Kollidon VA64 was further optimized regarding the solid state after its extrusion. The minimal process temperature to obtain a fully amorphous solid dispersion was determined by hot stage X-ray powder diffraction analysis (XRPD) and confirmed by lab scale extrusion. Addition of 9% nicotinamide lowered the process temperature from 220 °C (without nicotinamide) to 200 °C with nicotinamide. The minimal temperature for obtaining crystal free material was independent of the nicotinamide amount as soon as it exceeded 9%. Lowering the process temperature with nicotinamide reduced the impurity levels from 3.5% at 220 °C to 1.1% at 200 °C. The fully amorphous extrudates performed now better in the in vitro supersaturation assay than the lyophilized amorphous HPMC solid dispersion and the crystalline extrudates which were extruded at 135 °C. The process was up-scaled to a pilot scale extruder with alternative screw designs increasing mechanical shear forces and mixing which enabled lower process temperatures. This resulted in a maximal process temperature of 195 °C when nicotinamide was present and 205 °C without nicotinamide. However, shorter process time and reduced process temperatures (compared to the lab scale equipment) resulted in impurity levels smaller than 0.5% for both compositions and temperatures and made the nicotinamide obsolete. The amorphous extrudates from the pilot scale extruder performed better in vitro than the crystalline extrudates from the lab scale extruder and the lyophilized HPMC solid dispersion. A comparable PK profile of the HPMC solid dispersion and the amorphous melt extruded formulation principle was anticipated from these in vitro results. This was confirmed by the pharmacokinetic profile in dogs after oral administration of the final extruded solid dispersion formulation which was equivalent with the pharmacokinetic profile of the HPMC based solid dispersion formulation. The assumption that using a drug load below the miscibility prevents the solid dispersion from recrystallization was verified at least for a limited time by a stability test at elevated temperatures for 3 months showing no change in solid state. This indicates the opportunities of the low lattice forces approach, but also showed the importance of developing principles first assuring stable solid state, performance in vitro and in vivo, tailor them in a second step based on performance and combine them with technology such as melt extrusion as third step. If these steps are done in the context of clinical needs and quality it can rationalize the development of a solid dispersion and minimalize the formulation related risks regarding biopharmacy and stability.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antikörper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, hämatopoetischer und Niereninsuffizienz äußert. Verbesserte Therapieansätze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einführung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) führten zu einer Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit, für die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum Überleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum Überleben der MM Zellen beiträgt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. Während die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das Überleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abhängigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in primären MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 führte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen führte, bestätigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker für die Pan-Raf-Aktivität dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls führte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivität mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der primären MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, könnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabhängie Qualität als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung möglicher MEK/ERK-unabhängiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei führte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. Für eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abhängigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abhängigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verstärkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in primären Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiemöglichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verstärkt werden kann.
Auswirkungen unterschiedlicher Haltungsbedingungen auf Phänotyp und Genexpression im Mausmodell
(2015)
In zahlreichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Umweltbedingungen im frühen Lebensalter einerseits die Entwicklung von Resilienz, d.h. Widerstandsfähigkeit gegenüber Stressoren, andererseits aber auch die Entwicklung physischer und psychischer Erkrankungen im weiteren Lebensverlauf beeinflussen können. Dabei wird angenommen, dass sich sowohl dezidiert positive als auch in Maßen aversive Umweltbedingungen mit rezidivierender Stressbelastung günstig auf die Resilienz im späteren Leben auswirken können. Auf neurobiologischer Ebene scheinen dabei das CRH und seine Rezeptoren (CRHR1 und CRHR2), das NPY-System sowie das NPS-System (insbesondere NPS-Rezeptor) eine besondere Rolle zu spielen. Jedoch sind die exakten Zusammenhänge und neurobiologischen Grundlagen weiterhin nur unzureichend aufgeklärt. Dies ist insbesondere insofern bedauernswert, da weiterer Erkenntnisgewinn auf diesem Gebiet möglicherweise Präventionsstrategien und Therapieoptionen für den Menschen begründen könnte. Um die Auswirkung der Umweltbedingungen im frühkindlichen Lebensalter auf die Resilienz im späteren Leben weiter aufzuklären, wurden im Rahmen dieser Arbeit insgesamt 310 Cd1-Mäuse den Haltungsbedingungen "Environmental Enrichment" (EE, Stimulation durch Spielobjekte) und "Maternal separation" (MS, wiederholte Stressbelastung durch Separation der Nachkommen vom Muttertier) sowie Standardhaltungsbedingungen unterworfen. Insgesamt 31 männlichen Tieren wurde im Alter von vier Wochen die Gehirne entnommen und aus diesen jeweils die Regionen Frontalcortex,
Striatum, Nucleus accumbens, Hippocampus, Amygdala, dorsale Nuclei raphes und Hypothalamus herauspräpariert. Aus den gewonnenen Proben wurde RNA extrahiert, hieraus cDNA synthetisiert und abschließend - nach Ausschluss von Kontamination und Integritätsprüfung - die Expressionsraten der untersuchten Gene mittels RT-qPCR quantifiziert. Um auch verhaltensbiologische Konsequenzen der unterschiedlichen Haltungsbedingungen zu erfassen, wurden außerdem 30 weibliche sowie 30 männliche Tiere im weiteren Lebensverlauf verschiedenen Verhaltenstests zugeführt. In den Sucrose-Präferenz-Tests zeigten sich Effekte der Haltungsbedingung auf Sucrose-Konsum und Präferenz mit signifikant geringeren Werten der Haltungsgruppe EE. Bei der Auswertung der Openfield-Tests fanden sich Gruppen-Geschlechter-Interaktionseffekte mit signifikant geringeren Werten (Gesamtstrecke, Strecke und Aufenthaltsdauer im zentralen Bereich, Eintritte in den zentralen Bereich) der weiblichen EE-Tiere. In den Barnes Maze-Tests benötigten die Tiere
der Haltungsgruppe EE an den meisten Testtagen signifikant weniger Zeit, um in die Escape-Box zu "entkommen". Auf neurobiologischer Ebene fanden sich signifikante Unterschiede der CRH-Expressionsraten in Amygdalae und Frontalcortex, der CRHR 1-Expressionsraten in Amygdalae und Hypothalamus sowie der CRHR2-Expressionsraten in Amygdalae und Hippocampus. Demgegenüber konnte kein signifikanter Effekt der Haltungsbedingung auf das NPY-System gefunden werden.
Jedoch ließen sich signifikante Unterschiede der NPSR1-Expressionsraten in Amygdalae, Frontalcortex, dorsalen Nuclei raphes und Hypothalamus feststellen. Es kann also grundsätzlich von Auswirkungen unterschiedlich aversiver Haltungsbedingungen auf die Stress-Resilienz von Versuchstieren ausgegangen werden. Dies ist einerseits für Tierversuche allgemein von grundsätzlicher Bedeutung. Andererseits legen die Resultate eine entsprechende frühkindliche "Programmierung" auch im Menschen nahe.
The controlled shaping of ultrashort laser pulses is a powerful technology and applied in many laser laboratories today. Most of the used pulse shapers are only able to produce linearly polarized pulses shaped in amplitude and phase. Some devices are also capable of producing limited time-varying polarization profiles, but they are not able to control the amplitude. However, for some state-of-the-art non-linear time-resolved methods, such as polarization-enhanced two-dimensional spectroscopy, the possibility of controlling the amplitude and the polarization simultaneously is desirable.
Over the last years, different concepts have been developed to overcome these restrictions and to manipulate the complete vector-field of an ultrashort laser pulse with independent control over all four degrees of freedom - phase, amplitude, orientation, and ellipticity. The aim of this work was to build such a vector-field shaper. While the basic concept used for our setup is based on previous designs reported in the literature, the goal was to develop an optimized optical design that minimizes artifacts, allowing for the generation of predefined polarization pulse sequences with the highest achievable accuracy.
In Chapter 3, different approaches reported in the literature for extended and unrestricted vector-field control were examined and compared in detail. Based on this analysis, we decided to follow the approach of modulating the spectral phase and amplitude of two perpendicularly polarized pulses independently from each other in two arms of an interferometer and recombining them to a single laser pulse to gain control over the complete vector field.
As described in Chapter 4, the setup consists of three functional groups: i) an optical component to generate and recombine the two polarized beams, ii) a 4f setup, and iii) a refracting telescope to direct the two beams under two different angles of incidence onto the grating of the 4f setup in a common-path geometry. This geometry was chosen to overcome potential phase instabilities of an interferometric vector-field shaper. Manipulating the two perpendicularly polarized pulses simultaneously within one 4f setup and using adjacent pixel groups of the same liquid-crystal spatial light modulator (LC SLM) for the two polarizations has the advantages that only a single dual-layer LC SLM is required and that a robust and compact setup was achieved. The shaping capabilities of the presented design were optimized by finding the best parameters for the setup through numerical calculations to adjust the frequency distributions for a broad spectrum of 740 – 880 nm. Instead of using a Wollaston prism as in previous designs, a thin-film polarizer (TFP) is utilized to generate and recombine the two orthogonally polarized beams. Artifacts such as angular dispersion and phase distortions along the beam profile which arise when a Wollaston prism is used were discussed. Furthermore, it was shown by ray-tracing simulations that in combination with a telescope and the 4f setup, a significant deformation of the beam profile would be present when using a Wollaston prism since a separation of the incoming and outgoing beam in height is needed. The ray-tracing simulations also showed that most optical aberrations of the setup are canceled out when the incoming and outgoing beams propagate in the exact same plane by inverting the beam paths. This was realized by employing a TFP in the so-called crossed-polarizer arrangement which has also the advantage that the polarization-dependent efficiencies of the TFP and the other optics are automatically compensated and that a high extinction ratio in the order of 15000:1 is reached. Chromatic aberrations are, however, not compensated by the crossed-polarizer arrangement. The ray-tracing simulations confirmed that these chromatic aberrations are mainly caused by the telescope and not by the cylindrical lens of the 4f setup. Nevertheless, in the experimentally used wavelength range of 780 – 816 nm, only minor distortions of the beam profile were observed, which were thus considered to be negligible in the presented setup.
The software implementation of the pulse shaper was reviewed in Chapter 5 of this thesis. In order to perform various experiments, five different parameterizations, accounting for the extended shaping capabilities of a vector-field shaper, were developed. The Pixel Basis, the Spectral Basis, and the Spectral Taylor Basis can generally be used in combination with an optimization algorithm and are therefore well suited for quantum control experiments. For multidimensional spectroscopy, the Polarized Four-Pulse Basis was established. With this parameterization pulse sequences with up to four subpulses can be created. The polarization state of each subpulse can be specified and the relative intensity, phase, and temporal delay between consecutive subpulses can be controlled. In addition, different software programs were introduced in Chapter 5 which are required to perform the experiments conducted in this work.
The experimental results were presented in Chapter 6. The frequency distribution across the LC SLM was measured proving that the optimal frequency distribution was realized experimentally. Furthermore, the excellent performance of the TFP was verified. In general, satellite pulses are emitted from the TFP due to multiple internal reflections. Various measurements demonstrated that these pulses are temporally separated by at least 4.05 ps from the main pulse and that they have vanishing intensity. The phase stability between the two arms of the presented common-path setup σ = 28.3 mrad (λ/222) over 60 minutes. To further improve this stability over very long measurement times, an on-the-fly phase reduction and stabilization (OPRAS) routine utilizing the pulse shaper itself was developed. This routine automatically produces a compressed pulse with a minimized relative phase between the two polarization components. A phase stability of σ = 31.9 mrad (λ/197) over nearly 24 hours was measured by employing OPRAS. Various pulse sequences exceeding the capabilities of conventional pulse shapers were generated and characterized. The experimental results proved that shaped pulses with arbitrary phase, amplitude, and polarization states can be created. In all cases very high agreement between the target parameters and the experimental data was achieved.
For the future use of the setup also possible modifications were suggested. These are not strictly required, but all of them could further improve the performance and flexibility of the setup. Firstly, it was illustrated how a “dual-output” of the setup can be realized. With this modification it would be possible to use the main intensity of the shaped pulse for an experiment while using a small fraction to characterize the pulse or to perform OPRAS simultaneously. Secondly, the basic idea of replacing the telescope by focusing mirrors in order to eliminate the chromatic aberrations was presented. Regarding the different parameterizations for vector-field shaping, some modifications increasing the flexibility of the implemented bases and the realization of a von Neumann Basis for the presented setup were proposed. In future experiments, the vector-field shaper will be used in conjunction with a photoemission electron microscope (PEEM). This approach combines the temporal resolution provided by ultrashort laser pulses with the high spatial resolution gained by electron microscopy in order to perform two-dimensional spectroscopy and coherent control on nanostructures with polarization-shaped femtosecond laser pulses. In combination with other chiral-sensitive experimental setups implemented earlier in our group, the vector-field shaper opens up new perspectives for chiral femtochemistry and chiral control.
The designed vector-field shaper meets all requirements to generate high-precision polarization-shaped multipulse sequences. These can be used to perform numerous polarization-sensitive experiments. Employing the OPRAS routine, a quasi-infinitely long phase stability is achieved and complex and elaborated long-term measurements can be carried out. The fact that OPRAS demands no additional hardware and that only a single dual-layer LC SLM and inexpensive optics are required allows the building of a vector-field shaper at comparatively low costs. We hope that with the detailed insights into the optical design process as well as into the software implementation given in this thesis, vector-field shaping will become a standard technique just as conventional pulse shaping in the upcoming years.
Extreme value theory aims at modeling extreme but rare events from a probabilistic point of view. It is well-known that so-called generalized Pareto distributions, which are briefly reviewed in Chapter 1, are the only reasonable probability distributions suited for modeling observations above a high threshold, such as waves exceeding the height of a certain dike, earthquakes having at least a certain intensity, and, after applying a simple transformation, share prices falling below some low threshold. However, there are cases for which a generalized Pareto model might fail. Therefore, Chapter 2 derives certain neighborhoods of a generalized Pareto distribution and provides several statistical tests for these neighborhoods, where the cases of observing finite dimensional data and of observing continuous functions on [0,1] are considered. By using a notation based on so-called D-norms it is shown that these tests consistently link both frameworks, the finite dimensional and the functional one. Since the derivation of the asymptotic distributions of the test statistics requires certain technical restrictions, Chapter 3 analyzes these assumptions in more detail. It provides in particular some examples of distributions that satisfy the null hypothesis and of those that do not. Since continuous copula processes are crucial tools for the functional versions of the proposed tests, it is also discussed whether those copula processes actually exist for a given set of data. Moreover, some practical advice is given how to choose the free parameters incorporated in the test statistics. Finally, a simulation study in Chapter 4 compares the in total three different test statistics with another test found in the literature that has a similar null hypothesis. This thesis ends with a short summary of the results and an outlook to further open questions.
Spiroergometrische Dauerbelastung von Probanden mit Morbus Addison, Diabetes mellitus Typ 1, Polyglandulärem Autoimmunsyndrom Typ 2 (erkrankt sowohl an Mb. Addison als auch an Diabetes mellitus Typ1) und gesunden Kontrollen. Blutzuckerverlauf, hormonelle Gegenregulation und kognitive Leistungsfähigkeit vor und nach Belastung wurden gemessen.
Während einer spiroergometrischen Dauerbelastung von 23 Minuten zeigte sich bei keinem der 10 Probanden mit ausschließlich Morbus Addison eine Neigung zur Hypoglykämie trotz fehlender Einnahme der mittäglichen Glukokortikoiddosis. Die Blutzucker blieben bei sämtlichen Probanden stabil und es zeigte sich sogar ein leichter Anstieg in der der Ergometrie anschließenden Nachbeobachtungsphase, eventuell als Hinweis auf eine mögliche Entwicklung einer Inulin-Resistenz.
Auf die erwartungsgemäße Mindersekretion von Adrenalin zeigte sich eine ame ehesten kompensatorisch leicht höhere Sekretion von Noradrenalin als bei den nebennierengesunden Gruppen. Die übrige Sekretion gegenregulatorischer Hormone entsprach den Vergleichsgruppen.
Die geleistete Arbeit am Fahrradergometer war bei den Probandengruppen mit Morbus Addison und APS 2 nahezu identisch, die Morbus Addison – Probanden traten sogar minimal weniger Ergometerwiderstand über die 15 Minuten Dauerbelastung. Dennoch zeigten die Probanden mit ausschließlich M. Addison einen adäquaten Anstieg der gegenregulatorischen Hormone ohne starke Schwankungen der Plasmaglukose, wohingegen es bei den Probanden mit APS 2, zu einem deutlichen Abfall der Plasmaglukose kam trotz deutlich niedrigerer Insulinkonzentrationen im Vergleich zur Probandengruppe mit ausschließlich Diabetes mellitus Typ 1. Die unzureichende Sekretion von Adrenalin, sowie der geringste Konzentrationsanstieg von Noradrenalin und dieser Untersuchung auch Wachstumshormon aller Probandengruppen verhinderte einen adäquaten Wiederanstieg des Blutzuckers.
Die Probanden mit Nebennierenrindeninsuffizienz verzeichneten teils signifikant schlechtere Ergebnisse bei einem Konzentrations- und einem Kurzzeitgedächtnistest im direkten Anschluss an die Ergometrie im Vergleich mit den anderen Probandengruppen.
Es gab keine relevanten Unterschiede der Testergebnisse in Ruhe. Die nebenniereninsuffizienten Probanden verbesserten sich jedoch signifikant weniger nach der Ergometrie bzw. zeigten nach dem Dauertest teils sogar schlechtere Leistungen. Die Probandengruppen mit Diabetes mellitus Typ 1 und die Kontrollgruppe zeigten eine erwartungsgemäße Verbesserung ihrer Leistung als Reaktion auf die vorherige körperliche Aktivität. Die Unterschiede in der kognitiven Performance sind am ehesten mit der unzureichenden Adrenalinsekretion und einem fehlenden akuten Cortisolanstieg der nebenniereninsuffizienten Probanden zu erklären.
Die Probanden mit Nebennierenrindeninsuffizienz wurden mit signifikant niedrigeren Widerständen am Fahrradergometer belastet als die nebennierengesunden Probanden. Ein möglicher Erklärungsansatz hierfür könnte eine gewisse cortisonbedingte Myopathie sein. Dies verdeutlicht nochmals die Notwendigkeit der Optimierung der Glukokortikoidsubstitutionstherapie. Neue Substitutionsregime sollten möglichst die physiologische circadiane Sekretionsrhythmik besser imitieren und im Optimalfall die Tagesdosis an Hydrocortison reduzieren, um glukokortikoidbedingte Nebenwirkungen wie Myopathie und Insulin-Resistenz zu reduzieren.
Die Probanden mit polyglandulärem Autoimmunsyndrom Typ 2, welche sowohl an Morbus Addison als auch an Diabetes mellitus Typ 1 leiden, müssen im Rahmen von Patientenschulungen besonders auf das Risiko von Hypoglykämien bei vermehrter körperlicher Aktivität hingewiesen werden. Patienten mit Insulinpumpe sollten das Ausschalten währenddessen erwägen und darüber hinaus besondere Aufmerksamkeit auf die Einnahme einer zusätzlichen Kohlenhydrateinheit für den Sport walten lassen. Eine zusätzliche Einnahme des Glukokortikoids ist in diesem Zusammenhang nicht sinnvoll. [31]
Ein vor dem Sport beispielsweise inhalativ appliziertes Epinephrinpräparat wäre eine mögliche Strategie zur Verbesserung des Plasmaglukose-Outcomes nach sportlicher Betätigung auf moderatem bzw. hohem Anstrengungslevel bei Patienten mit Morbus Addison und Diabetes mellitus Typ 1 und sollte Gegenstand weiterführender Studien sein.
Die Dauer des Krankenhausaufenthaltes nach thoraxchirurgischen Eingriffen ist maßgeblich durch die Drainagezeit, also die Verweildauer der Thoraxdrainage im Patienten, beeinflusst. Bisher gibt es noch keine allgemeingültigen Leit- und Richtlinien, die ein Drainagemanagement durch eine standardisierte Vorgehensweise und eine damit einhergehende Verkürzung der Drainagezeit gewährleisten. Dadurch sind die Unterschiede bezüglich der Handhabung und der Kriterien zur Entfernung der Drainage in den unterschiedlichen Kliniken von persönlichen Erfahrungswerten der behandelnden Ärzte beeinflusst und führen zu unterschiedlichen Drainagezeiten im thoraxchirurgischen Patientengut.
Bisherige Studien untersuchten vorrangig die Unterschiede zwischen digitalen und analogen Drainagesystemen, wohingegen die Optimierung der Drainagetherapie durch Nutzung der Daten aus digitalen Systemen weitgehend unerforscht blieb.
Aus diesem Grund wurde die klinische ThopazTM-NICE-Studie (Non- Interventional Clinical Evaluation of the digital chest drain device ThopazTM) konzipiert. In dieser wurden 112 Patienten erfasst. Es handelt sich um eine mul- tizentrische, nicht-interventionelle Anwendungsbeobachtung.
Das Ziel dieser Untersuchung war es herauszufinden, ob die landläufig für das klinische Drainagemanagement herangezogenen Faktoren tatsächlich Einfluss auf die Drainagezeit nehmen und zu definieren, um welche Faktoren es sich dabei handelt.
Anhand von klinisch erhobenen Daten und den aus der ThopazTM stammenden Flow-Werten wurden regressionsanalytische Untersuchungen durchgeführt, um somit Rückschlüsse zu erhalten, welche Faktoren einerseits Einfluss auf die klinische und andererseits auf die „objektivierbare“ (eine aus den Flow-Werten abgeleitete medizinisch notwendige Drainagezeit) nehmen. Das Ende der „objektivierbaren“ Drainagezeit wurde dabei wie folgt definiert: ein vierstündiges Intervall am postoperativen Patienten, in dem der Flow-Wert erstmals unter 10mL/min liegt.
Anxiety is an affective state characterized by a sustained, long-lasting defensive response, induced by unpredictable, diffuse threat. In comparison, fear is a phasic response to predictable threat. Fear can be experimentally modeled with the help of cue conditioning. Context conditioning, in which the context serves as the best predictor of a threat due to the absence of any conditioned cues, is seen as an operationalization of sustained anxiety.
This thesis used a differential context conditioning paradigm to examine sustained attention processes in a threat context compared to a safety context for the first time. In three studies, the attention mechanisms during the processing of contextual anxiety were examined by measuring heart rate responses and steady-state-visually evoked potentials (ssVEPs). An additional focus was set on the processing of social cues (i.e. faces) and the influence of contextual information on these cues. In a last step, the correlates of sustained anxiety were compared to evoked responses by phasic fear, which was realized in a previously established paradigm combining predictable and unpredictable threat.
In the first study, a contextual stimulus was associated with an aversive loud noise, while a second context remained unpaired. This conditioning paradigm created an anxiety context (CTX+) and a safety context (CTX-). After acquisition, a social agent vs. an object was presented as a distractor in both contexts. Heart rate and cortical responses, with ssVEPs by using frequency tagging, to the contexts and the distractors were assessed. Results revealed enhanced ssVEP amplitudes for the CTX+ compared to the CTX− during acquisition and during presentation of distractor stimuli. Additionally, the heart rate was accelerated in the acquisition phase, followed by a heart rate deceleration as a psychophysiological marker of contextual anxiety.
Study 2 used the same context conditioning paradigm as Study 1. In contrast to the first study, persons with different emotional facial expressions were presented in the anxiety and safety contexts in order to compare the differential processing of these cues within periods of threat and safety. A similar anxiety response was found in the second study, although only participants who
Abstract
VIII
were aware of the contingency between contexts and aversive event showed a sensory amplification of the threat context, indicated by heart rate response and ssVEP activation. All faces irrespective of their emotional expression received increased attentional resources when presented within the anxiety context, which suggests a general hypervigilance in anxiety contexts.
In the third study, the differentiation of predictable and unpredictable threat as an operationalization of fear and anxiety was examined on a cortical and physiological level. In the predictable condition, a social cue was paired with an aversive event, while in the unpredictable condition the aversive event remained unpaired with the respective cue. A fear response to the predictable cue was found, indicated by increased oscillatory response and accelerated heart rate. Both predictable and unpredictable threat yielded increased ssVEP amplitudes evoked by the context stimuli, while the response in the unpredictable context showed longer-lasting ssVEP activation to the threat context.
To sum up, all three studies endorsed anxiety as a long-lasting defensive response. Due to the unpredictability of the aversive events, the individuals reacted with hypervigilance in the anxiety context, reflected in a facilitated processing of sensory information and an orienting response. This hypervigilance had an impact on the processing of novel cues, which appeared in the anxiety context. Considering the compared stimuli categories, the stimuli perceived in a state of anxiety received increased attentional resources, irrespective of the emotional arousal conveyed by the facial expression. Both predictable and unpredictable threat elicited sensory amplification of the contexts, while the response in the unpredictable context showed longer-lasting sensory facilitation of the threat context.
Magnetometrie mit Diamant
(2015)
Gegenstand der Arbeit ist die Magnetometrie mit Stickstoff-Fehlstellen-Zentren im Diamantgitter und die Entwicklung eines Rastersondenmagnetometers auf Basis eines Ensembles dieser Defektzentren. Ein solches Instrument verspricht eine bislang nicht erreichte Kombination von Feldsensitivität und räumlicher Auflösung während einer Magnetfeldmessung, und kann damit einen wichtigen Beitrag für das Verständnis von magnetischen Systemen und Phänomenen liefern.
Die Arbeit widmet sich zunächst dem Verständnis der elektronischen Zustände des Defekts, und wie diese optisch untersucht werden können. Gleichzeitige Anregung der Zentren durch sichtbares Licht und elektromagnetischer Strahlung im Bereich von Mikrowellenfrequenzen machen es möglich, die elektronische Spinstruktur des Defekts zu messen und zu manipulieren. Dadurch kann direkt der Einfluss von externen Magnetfeldern auf die Energie der Spinzustände ausgelesen werden. Die quantenmechanischen Auswahlregeln der verschiedenen Anregungen können für eine selektive Anregung der Zentren entlang einer bestimmten kristallographischen Achse verwendet werden. Damit kann eine Ensemble von Defekten zur Vektormagnetometrie, ohne auf ein zusätzliches äußeres Magnetfeld angewiesen zu sein, welches die untersuchte Probe nachhaltig beeinflussen kann.
Anschließend wird die Entwicklung einer geeigneten Mikrowellenantenne dargestellt, die in einem späteren Rastersondenexperiment mit den Defekten auf geringem Raum eingesetzt werden kann. Außerdem werden die einzelnen Schritte präsentiert, wie die Farbzentren im Diamantgitter erzeugt werden und aus großen Diamantplättchen Nanostrukturen erzeugt werden, die als Rasterkraftsonden eingesetzt werden können.
Die fertigen Sonden können in einem modularen Rasterkraftaufbau verwendet werden, der über einen zusätzlichen optischen Zugang verfügt, sodass die Information des Spinsensors ausgelesen werden kann. In verschiedenen Testexperimenten wird die Funktionsweise des gesamten Apparats demonstriert.
Pulsars (in short for Pulsating Stars) are magnetized, fast rotating neutron stars. The basic picture of a pulsar describes it as a neutron star which has a rotation axis that is not aligned with its magnetic field axis. The emission is assumed to be generated near the magnetic poles of the neutron star and emitted along the open magnetic field lines. Consequently, the corresponding beam of photons is emitted along the magnetic field line axis. The non-alignment of both, the rotation and the magnetic field axis, results in the effect that the emission of the pulsar is only seen if its beam points towards the observer.
The emission from a pulsar is therefore perceived as being pulsed although its generation is not. This rather simple geometrical model is commonly referred to as Lighthouse Model and has been widely accepted. However, it does not deliver an explanation of the precise mechanisms behind the emission from pulsars (see below for more details).
Nowadays more than 2000 pulsars are known. They are observed at various wavelengths. Multiwavelength studies have shown that some pulsars are visible only at certain wavelengths while the emission from others can be observed throughout large parts of the electromagnetic spectrum. An example of the latter case is the Crab pulsar which is also the main object of interest in this thesis. Originating from a supernova explosion observed in 1054 A.D. and discovered in 1968, the Crab pulsar has been the central subject of numerous studies. Its pulsed emission is visible throughout the whole electromagnetic spectrum which makes it a key figure in understanding the possible mechanisms of multiwavelength emission from pulsars.
The Crab pulsar is also well known for its radio emission strongly varying on long as well as on short time scales. While long time scale behaviour from a pulsar is usually examined through the use of its average profile (a profile resulting from averaging of a large number of individual pulses resulting from single rotations), short time scale behaviour is examined via its single pulses. The short time scale anomalous behaviour of its radio emission is commonly referred to as Giant Pulses and represents the central topic of this thesis.
While current theoretical approaches place the origin of the radio emission from a pulsar like the Crab near its magnetic poles (Polar Cap Model) as already indicated by the Lighthouse model, its emission at higher frequencies, especially its gamma-ray emission, is assumed to originate further away in the geometrical region surrounding a pulsar which is commonly referred to as a pulsar magnetosphere (Outer Gap Model). Consequently, the respective emission regions are usually assumed not to be connected. However, past observational results from the Crab pulsar represent a contradiction to this assumption.
Radio giant pulses from the Crab pulsar have been observed to emit large amounts of energy on very short time scales implying small emission regions on the surface of the pulsar. Such energetic events might also leave a trace in the gamma-ray emission of the Crab pulsar.
The aim of this thesis is to search for this connection in the form of a correlation study between radio giant pulses and gamma-photons from the Crab pulsar.
To make such a study possible, a multiwavelength observational campaign was organized for which radio observations were independently applied for, coordinated and carried out with the Effelsberg radio telescope and the Westerbork Synthesis Radio Telescope and gamma-ray observations with the Major Atmospheric Imaging Cherenkov telescopes. The corresponding radio and gamma-ray data sets were reduced and the correlation analysis thereafter consisted of three different approaches:
1) The search for a clustering in the differences of the times of arrival of radio giant pulses and gamma-photons;
2) The search for a linear correlation between radio giant pulses and gamma-photons using the Pearson correlation approach;
3) A search for an increase of the gamma-ray flux around occurring radio giant pulses.
In the last part of the correlation study an increase of the number of gamma-photons centered on a radio giant pulse by about 17% (in contrast with the number of gamma-photons when no radio giant pulse occurs in the same time window) was discovered. This finding suggests that a new theoretical approach for the emission of young pulsars like the Crab pulsar, is necessary.
Die Selbstorganisation von amphiphilen Molekülen zählt zu den am intensivsten bearbeiteten Forschungsgebieten der Supramolekularen Chemie. Die faszinierenden supramolekularen Architekturen der Natur zeigen eindrucksvoll, wie neuartige Funktionen durch das Zusammenspiel wohl-definierter Molekülensembles in einer wässrigen Umgebung entstehen. Es ist bekannt, dass der hydrophobe Effekt dabei eine entscheidende Rolle in der Selbstorganisation spielt und somit die Funktion eines Systems wesentlich bestimmt. Obwohl die Komplexität der bekannten Beispiele aus der Natur unerreicht ist, wurden in den letzten Jahren unzählige künstliche supramolekulare Architekturen basierend auf amphiphilen Molekülen erschaffen, mit vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten an der Schnittstelle von Chemie, Biologie und Physik.
Darunter eröffnen insbesondere amphiphile π-konjugierte Systeme einen einfachen Zugang zu vielfältigen Strukturen, da im wässrigen Medium starke π-π-Wechselwirkungen als strukturbildendes Element ausgenutzt werden können. Vor allem wegen vielversprechender Anwendungsmöglichkeiten spiegelt sich die Selbstorganisation solcher Systeme in einem hohen Forschungsinteresse wider. Dennoch ist das Wirken des hydrophoben Effekts in der Selbstassemblierung amphiphiler π-konjugierter Moleküle weitgehend unverstanden.
Die vorliegende Arbeit befasste sich daher mit der Frage, welche physikochemischen Grundprinzipien die Bildung von supramolekularen Polymeren basierend auf amphiphilen π-konjugierten Molekülen in Wasser steuern und wie der hydrophobe Effekt die Funktionalität solcher Strukturen beeinflusst. Bolaamphiphile Perylenbisimide (PBIs) und Naphthalinbisimide (NBIs) erwiesen sich dabei für das Moleküldesign als besonders geeignet, weil sie vergleichsweise einfach dargestellt werden können, ihre hohe Symmetrie weniger komplexe Assoziationsprozesse begründet und die Untersuchung ihrer Selbstassemblierung im wässrigen Medium weiterhin einen Vergleich erlaubt, wie sich der hydrophobe Effekt bezüglich unterschiedlich großen π-Systemen auswirkt.
Es konnte gezeigt werden, dass OEG-basierte Rylenbisimide unter bestimmten strukturgeometrischen Voraussetzungen eine entropiegetriebene Aggregation aufweisen, wenn die Freisetzung von Wassermolekülen aus einer wohl-definierten Hydrathülle ausreicht, um den Enthalpiegewinn aus den im wässrigen Medium verstärkten Dispersionswechselwirkungen zwischen den π-Flächen zu übertreffen. Im vorliegenden Fall wurde dies durch das Pinsel-Strukturmotiv der symmetrisch angebrachten Imidsubstituenten erreicht, für die sich damit einhergehend eine gänzlich andere Temperaturabhängigkeit beobachten ließ und somit eine gänzlich andere Funktionalität, als man sie aus organischen Lösungsmitteln kennt. Wasser als Lösungsmittel führt also nicht nur zu einer signifikanten Bindungsverstärkung, sondern öffnet Zugang zu supramolekularen Systemen mit neuartigen Funktionen. Die entropiegetriebene Freisetzung von Wassermolekülen konnte daher im Rahmen dieser Arbeit ausgenutzt werden, um gleichzeitig die intrinsische Ordnung im π-Stapel von PBIs zu erhöhen, was anhand eines temperatursensorischen Hydrogels anschaulich demonstriert wurde.
Darüber hinaus stellte sich heraus, dass Wasser ein geeignetes Lösungsmittel zur Darstellung supramolekularer Kompositmaterialien ist. Wie anhand sich instantan bildender Co-Aggregate gezeigt wurde, ist die entropiegetriebene Assemblierung der entscheidende Faktor zur Darstellung von komplexeren supramolekularen Strukturen, die überdies einen Schritt hin zu den hochkomplexen multimolekularen Anordnungen der Natur darstellen.
Eine Nabelhernie stellt im Kindesalter eine angeborene Faszienlücke im Bereich der ventralen Bauchwand dar. Material und Methoden: Über einen Zeitraum von über zehn Jahren wurden in der kinderchirurgischen Abteilung der Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie der Universität Würzburg 518 Patienten mit Nabelhernien operiert, wobei 499 Patienten nach Ausschlusskriterien in der Studie evaluiert wurden. Ergebnisse: Durch die Direktnaht und Sicherung mittels einer zweiten Fasziennaht nach semizirkulärer, subumbilicaler Inzision nach Spitzy konnte eine niedrige Rezidivquote von 1% (n=5 von n=499) erzielt werden. Die jungen Patienten waren im Durchschnitt 33,8 Monate alt und zu 44,1% weiblich und zu 55,9% männlich. Im Vergleich hierzu lag die Rezidivquote in der Erwachsenenchirurgie nach Direktnaht bei 12,9% (n=4 von n=31 Direktnähten bei n=62 Nabelhernien). Das Durchschnittsalter der erwachsenen Patienten betrug 54,5 Jahre; 32,3% waren weiblich, 67,7% männlich. Schlussfolgerung: Aufgrund der Studienergebnisse stellt die Nabelhernienversorgung im Kindesalter durch Direktnaht und Zugang nach Spitzy das Mittel der Wahl und den Goldstandard dar, sobald dringliche Operationsindikationen wie eine Größenprogredienz, Schmerzsymptomatik oder Inkarzerationszeichen vorliegen.
Die Transplantation nimmt, mehr noch als die verschiedenen Dialyseverfahren, den höchsten Stellenwert in der Therapie eines terminalen Nierenversagens ein. Eine Transplantation erfordert jedoch auch immer eine suffiziente Immunsuppression, ohne die die Funktionalität des Transplantats nicht gewährleistet werden kann. Kortikosteroide werden dabei immer noch sehr häufig nach Nierentransplantation eingesetzt. Jedoch bringt diese Medikation auch Risiken mit sich. In der vorliegenden retrospektiven Analyse wurden die Daten von insgesamt 809 Patienten ausgewertet. Die Patienten wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, wobei zwischen steroidfrei und nicht-steroidfrei in Jahr zwei nach Transplantation unterschieden wurde. Untersucht wurde, ob es Unterschiede im Patienten- und Transplantatüberleben, bei akuten Abstoßungen oder bei steroidtypischen Nebenwirkungen gibt.
Wir konnten ein tendenziell besseres Patientenüberleben in der steroidfreien Gruppe feststellen, vor allem zu sehen an der Zehn-Jahres-Überlebensrate (86,0% vs. 79,8%).
Bezüglich des Transplantatüberlebens zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied zugunsten der steroidfreien Patienten (nach fünf Jahren 92,2% vs. 79,7%). Ein Transplantatverlust war in der steroidfreien Kohorte seltener zu beobachten (23,1% vs. 33,8%). Bei den in Jahr zwei steroidfreien Patienten ereigneten sich weniger akute Abstoßungsereignisse, sowohl bioptisch gesicherte als auch nur klinisch verdächtige Episoden.
Steroidtypische Nebenwirkungen, zum Beispiel ein Posttransplantationsdiabetes sowie kardiovaskuläre Ereignisse wurden tendenziell häufiger in der Kohorte mit fortgesetzter Steroideinnahme diagnostiziert. Im Auftreten von Malignomen gab es keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Zu beachten ist die Möglichkeit eines Selektionsbias bei der retrospektiven Auswertung.
Somit ergeben sich in unserer Analyse für eine verkürzte Einnahme von Steroiden nach Transplantation greifbare Vorteile für das Patienten- und Transplantatüberleben. Die Steroidtherapie sollte jedoch mindestens bis sechs Monate nach Transplantation beibehalten werden. Nach diesem Zeitraum erscheint das Absetzen der Steroide sicherer zu sein, da akute Abstoßungsepisoden seltener auftreten. Sowohl Patienten- und Transplantatüberleben werden durch das Absetzen der Steroidtherapie günstig beeinflusst. Ein früheres Absetzen, wie es in anderen Studien durchgeführt wurde, führte häufiger zu höheren Raten an akuten Rejektionen. Kortikosteroide waren und bleiben somit ein unverzichtbarer Teil der initialen immunsuppressiven Therapie nach Nierentransplantation.
Adipositas ist weltweit ein verbreitetes und fortschreitendes gesundheitliches und ökonomisches Problem. Die therapeutischen Effekte von Diäten und Medikamenten sind insgesamt unbefriedigend und nicht andauernd. Einzig die Ansprechraten der bariatrischen Chirurgie auf die Gewichtsminderung sind langfristig erfolgversprechend. Unter den bariatrischen Methoden gilt der Roux-en-Y-Magenbypass (RYGB) als Goldstandard und wird wegen seines positiven Nutzen-Risiko-Verhältnisses häufig durchgeführt. Zunehmend rückt der Einfluss der RYGB-Operation auf den Knochenstoffwechsel in das Blickfeld der Forschung. In der Literatur konnte gezeigt werden, dass der Knochenmineralsalzgehalt nach RYGB-Operation abnimmt und der Knochenumsatz zunimmt. Langzeitstudien zur Knochengesundheit nach RYGB-Anlage existieren allerdings kaum und eine klinische Relevanz der verminderten BMD für das Frakturrisiko ist unbekannt.
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung der Langzeitveränderungen der Knochenqualität nach RYGB-Operation in der Ratte im biomechanischen Test und die Korrelation mit erhobenen Daten der Knochendichte. Dazu wurden 18 männliche Wistar-Ratten randomisiert in zwei Gruppen aufgeteilt. Neun der Ratten erhielten eine RYGB-, die anderen neun eine Sham-Operation. 200 Tage im Anschluss an die Operation wurden die Tiere geopfert und Tibiae und Femora für die biomechanische Untersuchung entnommen.
Im Torsionstest schnitten die getesteten RYGB-Knochen bezüglich Stärke und Steifigkeit signifikant schlechter ab als die der Sham-Vergleichsgruppe. Für die in der quantitativen Mikrocomputertomographie gemessene Knochendichte ergab sich das gleiche Ergebnis. Eine positive Korrelation zwischen der BMD und den Torsionsparametern ließ sich allerdings nicht nachweisen.
In dieser tierexperimentellen Studie konnte gezeigt werden, dass die veränderten Stoffwechselbedingungen durch Magenbypass-Anlage im Rattenmodell in einer biomechanisch reduzierten Knochenqualität resultieren und damit das potenzielle Frakturrisiko nach dieser Operation ansteigt.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Modifizierung von porösem, calciumdefizitärem, nanokristallinem Hydroxylapatit mit verschiedenen Metallionen zu testen. Es wurden α‑TCP‑basierende Zementproben hergestellt, die durch zwei verschiedene Dotierungsmethoden mit bestimmten Metallionen (Cu2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, V3+, Zn2+) modifiziert wurden. Die eine Methode bestand in der Zusinterung der entsprechenden Metallionen zum α‑TCP‑Pulver. Bei der anderen Methode waren die Ionen in unterschiedlicher Konzentration (1 mmolar, 100 μmolar, 10 μmolar) in der Binderlösung enthalten. Die hergestellten Zementproben wurden hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie der initialen Abbindezeit und Druckfestigkeit untersucht und zusätzlich rasterelektronenmikroskopischen, röntgen-diffraktometrischen und massenspektrometrischen Analysen unterzogen. Als Referenz diente ein bereits am Menschen erfolgreich als Knochenersatzmaterial eingesetzter nanokristalliner, calciumarmer Hydroxylapatit-Zement. Da Hydroxylapatit nahezu nur durch Osteoklasten mittels einer lokalen pH‑Wert-Absenkung resorbiert werden kann, wurden in‑vitro‑Versuche mit einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie durchgeführt. Über einen 15‑tägigen Versuchszeitraum wurde die Zytokompatibilität mittels bestimmter Zellproliferations- und Zellaktivitätsmessungen überprüft. Zusätzlich wurden die mit Zellen besiedelten Proben unter dem Rasterelektronenmikroskop betrachtet und eine TRAP‑Färbung durchgeführt, um die Differenzierung zu osteoklastenähnlichen Zellen beurteilen zu können.
Bei der Auswertung der Versuche wurde deutlich, dass nicht das Metall alleine maßgeblich für Veränderungen der physikalischen Eigenschaften im Vergleich zum metallfreien Referenzzement war. Auch die Art der Metallionendotierung, ob durch Zugabe mit der Binderlösung oder durch Zusinterung, hatte bei den Metallen unterschiedliche Auswirkungen auf die Zementeigenschaften. Während der Versuche wurden Abbindezeiten von 18 Minuten bis über 60 Minuten gemessen und Druckfestigkeiten zwischen 9,3 MPa und 30,5 MPa festgestellt. Bei der Auswertung der Zellversuchsreihe wurde festgestellt, dass die Zellen auf den mit Metallionen modifizierten Zementplättchen tendenziell eine niedrigere Aktivität bei gleich bleibender Proliferation aufwiesen als auf den metallfreien Referenzproben. Dieses Ergebnis konnte mikroskopisch bestätigt werden.
Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten
jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle
Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost.
Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und
Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch
die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden.
Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus
analysiert.
In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese
Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation
das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨
großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨
dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303-
positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet
werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen
unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs.
In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen
(moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil
und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im
Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu
keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden
sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht.
Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨
etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨
Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨
wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit.
In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT
immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression
von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT
beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur
Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154-
positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und
SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine
T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und
IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur
wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB
und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨
Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion
verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die
Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨
werden.
Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und
die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden.
Pluripotente Zellen sind sowohl in der Stammzellforschung als auch für regenerative Therapieansätze von großer Bedeutung. Erste Stammzelltherapien sind bereits erfolgreich am Menschen durchgeführt worden. Besonders wichtig ist die Sicherheit der Therapie, um Risiken, wie die „Entartung“ von Stammzellen zu Tumorzellen, zu minimieren. Als Ansatzpunkt für einheitliche Therapie-Standards, sind z.B. genaue Angaben zur Anzahl injizierter Zellen, dem Injektionsort und Biomarker (wie Pluripotenz- und Differenzierungs-Marker) zur Kategorisierung der Stammzellen zu nennen. Während der Embryonalentwicklung spielen die Polycomb-Proteinkomplexe PCR1 und PCR2 eine maßgebliche Rolle beim Aufrechterhalten der Pluripotenz, weil sie Chromatin-Modifikationen, wie z.B. Histonmethylierungen vermitteln und so die Genexpression kontrollieren können. Lange Zeit wurde angenommen, dass Histon-Methylierungen irreversibel sind, doch mit Entdeckung der Lysin-spezifischen Demethylase 1 (LSD1) wurde diese Sichtweise revidiert. Ein Mitglied der derzeit bekannten 32 Histon-Demethylasen ist Kdm6a (UTX), die die Histon-Demethylierung des Lysins an der Aminosäure-Position 27 von Histon H3 (H3K27me2/3) katalysiert. Kdm6a spielt eine wichtige Rolle bei der Embryogenese und wurde in der hier vorgestellten Arbeit am Teratommodell, einem benignen Keimzelltumor, untersucht.
In dieser Arbeit wurden Teratome von Mäusen untersucht, die aus embryonalen Stammzellen (ESC) mit Wildtyp- und shRNA vermittelter reduzierter Expression oder durch genetisch kontrollierten Knockdown sowie Knockout entstand sind. Diese wurden anschließend nach histologischen (H&E-Färbungen), histochemischen (PCNA-, SSEA-1- und TUNEL-Färbungen) sowie Analyse der Genexpressionsmuster aller drei Keimblätter mittels RT-PCR untersucht und ausgewertet.
Sowohl Wildtyp als auch Kdm6a-Knockdown und Knockout-Teratome bildeten Gewebe der drei Keimblätter aus. In Teratomen mit supprimierter Kdm6a-Expression gab es jedoch Unterschiede in der Bildung mesodermaler und endodermaler Gewebe mit einer signifikanten Abnahme von Knorpel- und Muskelgewebe. Da sich Kdm6a-defiziente Teratome zu wesentlich größeren Tumoren als Wildtyp-Teratome entwickelten, wurde deren Proliferations-, Pluripotenz- und Apoptose-Verhalten mittels PCNA und SSEA-1 und TUNEL histochemischen Färbungen untersucht. Wir beobachteten in Knockout-Teratomen eine höhere Anzahl von PCNA- und SSEA-1-positiven Zellen. Daraus folgt, dass Kdm6a-defiziente ESCs - im Gegensatz zu Wildtyp ESCs - zur Bildung von Teratomen mit einer höheren Anzahl von proliferierenden und pluripotenten Zellen neigen. In der Fraktion apoptotischer Zellen (TUNEL positiver Zellen) der Kdm6a-defizienten Teratome gab es keinen signifikanten Unterschied zu Teratomen, die aus Wildtyp-ESCs entstanden.
Nach Analyse der Genexpressionsmuster fanden wir in Zellen, in denen Kdm6a reprimiert bzw. deaktiviert wurde, einen Verlust der Pluripotenz und folglich eine starke Reduzierung der Pluripotenzmarker Oct4, Sox2 und Nanog. Die Analyse des Genexpressionsmusters läßt vermuten, dass der Verlust bzw. die Abnahme der Kdm6a-Aktivität in direkten Zusammenhang mit einer Abnahme der Pluripotenz durch Methylierung von H3K27 steht. Weitere Analysen, z.B. durch ChIP (Chromatin Immun-Präzipitations-) Assays mit H3K27me2/3 spezifischen Antikörpern, sind nötig, um dies endgültig zu beweisen. Unsere Arbeiten zeigten, dass die Kdm6-Demethylase-Aktivität essentiell für den Erhalt der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen ist.
Fulminant myocarditis is rare but a potentially life-threatening disease. Acute or mild myocarditis following acute ischemia is generally associated with a profound activation of the host’s immune system. On one hand this is mandatory to protect the host’s heart by fighting the invading agents (i.e., bacteria, viruses or other microbial agents) and/or to induce healing and repair processes in the damaged myocardium. On other hand, uncontrolled activation of the immune system may result in the generation of auto-reactive (not always beneficial) immune cells.
Myocarditis or inflammatory cardiomyopathy is characterized by focal or diffuse infiltrates, myocyte necrosis and/or apoptosis and subsequent fibrotic replacement of the heart muscle. In humans, about 30% of the myocarditis-patients develop dilated cardiomyopathy. As the clinical picture of myocarditis is multifaceted, it is difficult to diagnose the disease. Therefore, the main goal of the present work was to test and further develop novel non-invasive methods for the detection of myocardial inflammation by employing both contrast enhanced MRI techniques as well as novel nuclear tracers that are suitable for in vivo PET/ SPECT imaging.
As a part of this thesis, a pre-clinical animal model was successfully established by immunizing female Lewis rats with whole-porcine cardiac myosin (CM). Induction of Experimental Autoimmune Myocarditis (EAM) is considered successful when anti-myosin antibody titers are increased more than 100-fold over control animals and pericardial effusion develops. In addition, cardiac tissues from EAM-rats versus controls were analyzed for the expression of various pro-inflammatory and fibrosis markers. To further exploit non-invasive MRI techniques for the detection of myocarditis, our EAM-rats were injected either with (1) ultra-small Paramagnetic iron oxide particles (USPIO’s; Feraheme®), allowing for in vivo imaging , (2) micron sized paramagnetic iron oxide particles (MPIO) for ex vivo inflammatory cell-tracking by cMRI, or (3) with different radioactive nuclear tracers (67gallium citrate, 68gallium-labeled somatostatin analogue, and 68gallium-labeled cyclic RGD-peptide) which in the present work have been employed for autoradiographic imaging, but in principle are also suitable for in vivo nuclear imaging (PET/SPECT). In order to compare imaging results with histology, consecutive heart sections were stained with hematoxylin & eosin (HE, for cell infiltrates) and Masson Goldner trichrome (MGT, for fibrosis); in addition, immuno-stainings were performed with anti-CD68 (macrophages), anti-SSRT2A (somatostatin receptor type 2A), anti-CD61 (β3-integrins) and anti-CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule 1).
Sera from immunized rats strongly reacted with cardiac myosin. In immunized rats, echocardiography and subsequent MRI revealed huge amounts of pericardial effusion (days 18-21). Analysis of the kinetics of myocardial infiltrates revealed maximal macrophage invasion between days 14 and 28. Disappearance of macrophages resulted in replacement-fibrosis in formerly cell-infiltrated myocardial areas. This finding was confirmed by the time-dependent differential expression of corresponding cytokines in the myocardium. Immunized animals reacted either with an early or a late pattern of post-inflammation fibrosis. Areas with massive cellular infiltrates were easily detectible in autoradiograms showing a high focal uptake of 67gallium-citrate and 68gallium labeled somatostatin analogues (68Ga DOTA-TATE). Myocardium with a loss of cardiomyocytes presented a high uptake of 68gallium labeled cyclic RGD-peptide (68Ga NOTA-RGD). MRI cell tracking experiments with Feraheme® as the contrast-agent were inconclusive; however, strikingly better results were obtained when MPIOs were used as a contrast-agent: histological findings correlated well with in vivo and ex vivo MPIO-enhanced MRI images.
Imaging of myocardial inflammatory processes including the kinetics of macrophage invasion after microbial or ischemic damage is still a major challenge in, both animal models and in human patients. By applying a broad panel of biochemical, histological, molecular and imaging methods, we show here that different patterns of reactivity may occur upon induction of myocarditis using one and the same rat strain. In particular, immunized Lewis rats may react either with an early or a late pattern of macrophage invasion and subsequent post-inflammation fibrosis. Imaging results achieved in the acute inflammatory phase of the myocarditis with MPIOs, 67gallium citrate and 68gallium linked to somatostatin will stimulate further development of contrast agents and radioactive-nuclear tracers for the non-invasive detection of acute myocarditis and in the near future perhaps even in human patients.
The impact of acquired severe motor impairments is pervasive and may lead to a complete loss of communication and voluntary motor control, rendering the patient behaviourally unresponsive. In routine clinical care it may thus be unclear, whether some of these patients are even conscious. Given that finding a cure is unlikely, care focuses on providing the best possible quality of life (QoL), and knowing its predictors might contribute to that aim. Patients who still can communicate often report a high QoL, and several predictors have been identified. However, many instruments used to assess QoL require at least residual verbal and motor abilities. Thus, a method to assess QoL independent of these requirements is desirable. In addition, many instruments assume QoL to be temporarily stable, and little information is available on predictors of instantaneous QoL, i.e. QoL as it fluctuates from moment to moment throughout the day.
In der S3-Leitlinie „Diagnostik und Therapie des Morbus Crohn“ von 2008 war lediglich die Sonographie als primär bildgebendes Verfahren verankert; der Einsatz der Dünndarm-MRT blieb optional und ohne feste Position im Diagnostik-Algorithmus der CED. Im Unterschied hierzu stärkt die 2014 aktualisierte entsprechende S3-Leitlinie den Stellenwert der MRT als bildgebende Modalität. Weiterhin bestehen bleibt die Sonographie als primäre Bildgebung; eine MRT soll jedoch ebenfalls erfolgen: zur Primärdiagnostik, zur Erkennung extraintestinaler Komplikationen und zur Beurteilung endoskopisch nicht einsehbarer Darmabschnitte. Darüber hinaus kann sie in Verlaufskontrollen angewendet werden, falls erforderlich. Da sich diese jungen Patienten bei langer Krankheitsdauer in der Regel einer hohen Zahl an Untersuchungen unterziehen, sollte die Möglichkeit, dies strahlenexpositionsfrei durchführen zu können, unbedingt gewährleistet werden. Andernfalls ist mit einer erhöhten Rate an Malignomen im späteren Lebensalter zu rechnen.
Daraus ergibt sich die Bedeutung einer Korrelation von mittels Ultraschall wie MRT erhobenen Befunden bei kindlicher CED. Hierzu liegen bislang nur wenige Untersuchungen vor, die zumeist auf den additiven Wert der Sonographie zur MRT und/oder dem additiven Wert der MR-Perfusionsanalyse fokussieren. Der hier vorgestellte Ansatz einer direkten Korrelation der Parameter Wanddicke und Perfusionsmarker zwischen Sonographie und MRT sowie gegenüber klinischen Aktivitätsmarkern (shPCDAI) ist innovativ.
Für das MRT konnten wir eine signifikante Korrelation von Wanddicke und Signalintensitätszunahme zwei Minuten nach Kontrastmittelgabe für das terminale Ileum, der Prädilektionsstelle des Morbus Crohn, nachweisen. Ein Zusammenhang zwischen Wanddicke und klinischem Aktivitätsindex konnte nicht gezeigt werden, jedoch zwischen Signalintensitätszunahme und short PCDAI. Die Perfusionsanalyse sollte daher unserer Ansicht nach bei MRT-Untersuchungen zur Beantwortung der Frage „aktive Entzündung“ herangezogen werden.
Für die Sonographie konnten wir keinen Zusammenhang von Wanddicke und Perfusion, jedoch eine signifikante Korrelation von Wanddicke und short PCDAI nachweisen. Die Perfusion korrelierte wiederum nicht mit dem klinischen Aktivitätsindex. Die morphologische Wanddickenanalyse sollte daher für Sonographie-Untersuchungen zur Beantwortung der Frage „aktive Entzündung“ herangezogen werden.
Bei der Korrelation der MRT- und Sonographie-Ergebnisse zeigte sich ein gutes Übereinstimmen der Daten der Darmwanddicken-Messungen, die höchste Korrelation ergab sich im terminalen Ileum. Auch für Signalintensitätszunahmen (MRT) und Perfusion (FKDS) zeigte sich ein gutes Übereinstimmen – mit Ausnahme des Rektosigmoids (späte KM-Phase). Die größte Korrelation war auch hier im terminalen Ileum zu finden. Dies belegt die gute Vergleichbarkeit beider Modalitäten. Eine Korrelation von MRAIs – USAI – shPCDAI ließ sich nicht nachweisen. Dies könnte an einer divergenten Einschätzung der Erkrankungsaktivität, jedoch auch an der kleinen Fallzahl liegen. Zur Erstellung des shPCDAI waren die retrospektiv erhobenen Variablen teils nicht ausreichend. Hauptlimitation für den USAI war die – teils durch Darmgasüberlagerung bedingte – unvollständige Dokumentation. Die Stärke des MRAI lag dagegen bei konstant vorliegenden Messungen in fünf Darmabschnitten.
Trotz dieser Limitationen belegt die vorliegende Arbeit die Gleichwertigkeit beider Methoden in der Beurteilung von Darmwanddicken und eine bessere Korrelation wie Aussagekraft der MRT bei der Perfusionsanalyse. Aktuelle Publikationen belegen die Bedeutung Diffusionsgewichteter-MR-Bildgebung bei der CED-Diagnostik. Die DWI wurde im Rahmen unserer Untersuchung nicht angewendet, wird aber in Zukunft als vielversprechender, additiver Baustein oder sogar Ersatz für die Kontrastmittelgabe (Perfusionsanalyse) für MRT bei CED zu evaluieren sein.
The correct regulation of cell growth and proliferation is essential during normal animal development. Myc proteins function as transcription factors, being involved in the con-trol of many growth- and proliferation-associated genes and deregulation of Myc is one of the main driving factors of human malignancies.
The first part of this thesis focuses on the identification of directly regulated Myc target genes in Drosophila melanogaster, by combining ChIPseq and RNAseq approaches. The analysis results in a core set of Myc target genes of less than 300 genes which are mainly involved in ribosome biogenesis. Among these genes we identify a novel class of Myc targets, the non-coding small nucleolar RNAs (snoRNAs). In vivo studies show that loss of snoRNAs not only impairs growth during normal development, but that overexpression of several snoRNAs can also enhance tumor development in a neu-ronal tumor model. Together the data show that Myc acts as a master regulator of ribo-some biogenesis and that Myc’s transforming effects in tumor development are at least partially mediated by the snoRNAs.
In the second part of the thesis, the interaction of Myc and the Zf-protein Chinmo is described. Co-immunoprecipitations of the two proteins performed under endogenous and exogenous conditions show that they interact physically and that neither the two Zf-domains nor the BTB/POZ-domain of Chinmo are important for this interaction. Fur-thermore ChIP experiments and Myc dependent luciferase assays show that Chinmo and Myc share common target genes, and that Chinmo is presumably also involved in their regulation. While the exact way of how Myc and Chinmo genetically interact with each other still has to be investigated, we show that their interaction is important in a tumor model. Overexpression of the tumor-suppressors Ras and Chinmo leads to tu-mor formation in Drosophila larvae, which is drastically impaired upon loss of Myc.
The recently discovered human DREAM complex (for DP, RB-like, E2F and MuvB complex) is a chromatin-associated pocket protein complex involved in cell cycle- dependent gene expression. DREAM consists of five core subunits and forms a complex either with the pocket protein p130 and the transcription factor E2F4 to repress gene expression or with the transcription factors B-MYB and FOXM1 to promote gene expression.
Gas2l3 was recently identified by our group as a novel DREAM target gene. Subsequent characterization in human cell lines revealed that GAS2L3 is a microtubule and F-actin cross-linking protein, expressed in G2/M, plays a role in cytokinesis, and is important for chromosomal stability.
The aim of the first part of the study was to analyze how expression of GAS2L3 is regulated by DREAM and to provide a better understanding of the function of GAS2L3 in mitosis and cytokinesis.
ChIP assays revealed that the repressive and the activating form of DREAM bind to the GAS2L3 promoter. RNA interference (RNAi) mediated GAS2L3 depletion demonstrated the requirement of GAS2L3 for proper cleavage furrow ingression in cytokinesis. Immunofluorescence-based localization studies showed a localization of GAS2L3 at the mitotic spindle in mitosis and at the midbody in cytokinesis. Additional experiments demonstrated that the GAS2L3 GAR domain, a putative microtubule- binding domain, is responsible for GAS2L3 localization to the constriction zones in cytokinesis suggesting a function for GAS2L3 in the abscission process.
DREAM is known to promote G2/M gene expression. DREAM target genes include several mitotic kinesins and mitotic microtubule-associated proteins (mitotic MAPs). However, it is not clear to what extent DREAM regulates mitotic kinesins and MAPs, so far. Furthermore, a comprehensive study of mitotic kinesin expression in cancer cell lines is still missing.
Therefore, the second major aim of the thesis was to characterize the regulation of mitotic kinesins and MAPs by DREAM, to investigate the expression of mitotic kinesins in cancer cell line panels and to evaluate them as possible anti-cancer targets.
ChIP assays together with RNAi mediated DREAM subunit depletion experiments demonstrated that DREAM is a master regulator of mitotic kinesins. Furthermore, expression analyses in a panel of breast and lung cancer cell lines revealed that mitotic kinesins are up-regulated in the majority of cancer cell lines in contrast to non-transformed controls. Finally, an inducible lentiviral-based shRNA system was developed to effectively deplete mitotic kinesins. Depletion of selected mitotic kinesins resulted in cytokinesis failures and strong anti-proliferative effects in several human cancer cell lines.
Thus, this system will provide a robust tool for future investigation of mitotic kinesin function in cancer cells.
Staphylococcus aureus is a facultative Gram-positive human pathogen which can cause different severe infections. Staphylococci are phagocytosed by professional and non-professional phagocytes; they are strongly cytotoxic against eukaryotic cells and have been proposed to play a role in immune evasion by spreading within migrating phagocytes. This study investigated the post invasive events upon S. aureus infection. Strains which are able to escape the phagosome were identified and the responsible toxins were determined. Thereby innovative insights into host pathogen interaction were obtained.
A novel class of small amphipathic peptides with strong surfactant-like properties, the phenol soluble modulins, particularly PSMα as well as the leukocidin LukAB, are involved in phagosomal escape of the clinical S. aureus strains LAC, MW2 and 6850 in non-professional and professional phagocytes. Whereas, PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin or phosphatidyl inositol-dependent phospholipase C did not affect phagosomal escape. By blocking the bacterial DNA-dependent RNA polymerase with rifampicin phagosomal escape is determined to start approximately 2.5 hours post infection. Phagosomal escape further was required for intracellular replication of S. aureus. Strains which are not able to escape cannot replicate in the acidic vacuole, whereas, the host cytoplasm offers a rich milieu for bacterial replication. Additionally, phagosomal escape, with intracellular bacterial replication induces the subsequent host cell death. This could be confirmed by an infection assay including S. aureus knockout mutants in psmα or lukAB which were significantly less cytotoxic, compared with those infected with escape-positive wild type strains.
Further, this study showed that phagosomal escape is not only mediated by bacterial toxins. Since, the phagocyte-specific cognate receptors for both escape relevant toxins, FPR2 (PSMα receptor) and CD11b (LukAB receptor) are produced in epithelial and endothelial cells only after infection with S. aureus in a calcium dependent fashion. The knockdown of both receptors using siRNA prevents S. aureus to escape the phagosome. Furthermore, blocking intracellular calcium release with the inositol trisphosphate receptor (IP3R) inhibitor 2-APB prohibits upregulation of fpr2 and cd11b and subsequently phagosomal escape of S. aureus.
To conclude, the current study clarifies that phagosomal escape and host cell death are interplay of both, bacterial toxins and host cell factors.
Staphylococcus aureus ist ein fakultativ Gram-positives Humanpathogen, dass verschiedene schwerwiegende Infektionen verursachen kann. Staphylokokken werden von professionellen und nicht-professionellen Phagozyten (Fresszellen) zu gleich aufgenommen. Desweitern sind sie stark zytotoxisch für eukaryotische Zellen. Außerdem wird vermutet, dass sie sich mittels migrierender Phagozyten dem angeborenen Immunsystem entziehen können. In dieser Studie werden die post-invasiven Ereignisse während einer Staphylokokken Infektion untersucht. Im Detail wurden Stämme identifiziert die aus den Phagosomen entkommen können und die dafür verantwortlichen Toxine. Im Zuge dessen wurden neue Erkenntnisse der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtszellen gewonnen.
Eine neue Klasse von kleinen amphiphatischen Peptiden mit starken grenzflächenaktiven Eigenschaften (Surfactant), die sogenannten Phenol soluble modulins (PSMs) im Besonderen PSMα sowie das Leukozidin LukAB, sind am phagosomalen Ausbruch der klinisch relevanten S. aureus Stämmen LAC, MW2 und 6850 in nicht professionellen und professionellen Phagozyten involviert. Hingegen, sind PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin oder Phosphatidylinositol abhängige Phospholipase C nicht am phagosomalen Ausbruch beteiligt. Durch die Hemmung der bakteriellen DNA-abhängigen RNA Polymerase mit Rifampicin wurde der Zeitpunkt für den Ausbruch auf etwa 2,5 Stunden nach der Infektion eingegrenzt. Der phagosomale Ausbruch ist weiterhin für die intrazelluläre Replikation von S. aureus notwendig. Während Stämme, die nicht ausbrechen können in der angesäuerten Vakuole nicht replizieren können, bietet das Zytoplasma ein reichhaltiges Milieu für die Vermehrung. Zudem wird der Pathogen induzierte Zelltod erst nach dem phagosomalen Ausbruch und mit anschließender Vermehrung ermöglicht. Nachgewiesen wurde dies mittels psmα und lukAB defizienten Mutanten welche signifikant weniger zytotoxisch waren als der Wildtyp Stamm. Diese Studie zeigt darüber hinaus, dass der phagosomale Ausbruch nicht nur durch bakterielle Toxine vermittelt wird. Sondern, dass die Phagozyten-spezifischen Rezeptoren für beide relevanten Toxine, FPR2 (PSMα Rezeptor) und CD11b (LukAB Rezeptor), in Epithel- und Endothelzellen nach Infektion mit S. aureus calciumabhängig produziert werden und für den Ausbruch notwendig sind. Der knockdown beider Rezeptoren mittels siRNA verhindert den Ausbruch. Wird der intrazelluläre Calciumstrom mittels des Inositoltrisphosphat Rezeptor (IP3R) Inhibitor 2-APB blockiert können die Gene fpr2 und cd11b nicht hochreguliert werden und der Ausbruch wird ebenfalls verhindert.
Folglich zeigt diese Studie, dass der phagosomale Ausbruch und Pathogen induzierte Zelltod sowohl durch bakterielle Toxine als auch Wirtsfaktoren vermittelt wird.
In dieser Dissertation wurden die Häufigkeit und das klinische Erscheinungsbild von Kindern mit schwerer RSV-assoziierten akuten Atemwegserkrankung (ARE) auf pädiatrischen Intensivstationen untersucht. Die Daten stammen aus einer prospektiven multizentrischen Studie zu intensivstationär behandelten viralen ARE bei Kindern, die im Studienzeitraum von Oktober 2010 – September 2013 durchgeführt wurde und an der bayernweit 23 von 30 Kliniken (77%) mit pädiatrischen Intensivstationen teilnahmen.
RSV war mit 31% aller Erregernachweise in der Multiplex-PCR und mit 28% aller untersuchten PICU-ARE-Patienten der häufigste virale respiratorische Erreger auf pädiatrischen Intensivstationen. Die Hälfte der Patienten war männlich und das mediane Alter der betroffenen Kinder lag bei 2,5 Monaten mit einem (IQR von 1,5 bis 19,2 Monaten, min. 0,6 Monate alt, max. 193 Monate ~ 16,1 Jahre). Die hohe Bedeutung schwerer RSV-Infektionen im ersten Lebensjahr wurde dadurch belegt, dass 70% aller Patienten Säuglinge waren. Das häufigste Symptom bei Aufnahme auf die Intensivstation war Atemnot (93%). Es folgten an zweiter und dritter Stelle die Symptome Husten (78%) und Trink- und Nahrungsverweigerung (63%). Pathologische röntgenologische Befunde des Thorax wurden bei 85% der Kinder erhoben. In der Schweregradbeurteilung mittels SIC-Score wurden von den behandelnden Ärzten 17% der Kinder bei Aufnahme als lebensbedrohlich erkrankt eingestuft. Die häufigsten Diagnosen bei intensivstationär behandelten Kindern mit RSV-assoziierter ARE waren mit 86% Bronchiolitis, Infektionen der oberen Atemwege (76%) und Pneumonie (58%). Von den erkrankten Kindern hatten 46% mindestens eine Grunderkrankung. Die häufigsten waren Frühgeburtlichkeit (23%), neurologische Vorerkrankungen (17%) und pulmonologische Vorerkrankungen (14%). Die häufigste Behandlungsmaßnahme war die Sauerstoffgabe (88%) für eine mediane Dauer von 4 Tagen (IQR 3-7 Tage). Eine CPAP-Behandlung erhielten 36% (mediane Dauer 3 Tage; IQR 2-5 Tage) und eine mechanische endotracheale Beatmung 14% der Patienten (mediane Dauer 7 Tage; IQR 5-10 Tage). Eine orale oder intravenöse Antibiotikagabe erhielten 80% aller Patienten. Die mediane Verweildauer im Krankenhaus betrug acht Tage (IQR 6 bis 11 Tage), darauf entfielen vier Tage (IQR von 2 bis 7 Tagen) auf die intensivstationäre Betreuung. Von allen Kindern mit RSV-assoziierter ARE konnten 97% das Krankenhaus ohne Krankheitsfolgen verlassen, bei drei (2%) Patienten konnten mögliche Folgeschäden nicht ausgeschlossen werden, und zwei Kinder (1%) mit vorbestehender schwerer Grunderkrankung (eine weibliche Patientin, Alter 1 Jahr mit spinaler Muskelatrophie und progredienter respiratorischer Insuffizienz; sowie ein männlicher Patient, Alter 5 Jahre mit spastischer Tetraparese bei Z.n. Asphyxie und hypoxisch-ischämischer Enzephalopathie) verstarben während des intensivstationären Aufenthalts.
Interessanterweise war die stationäre Aufenthaltsdauer von älteren Kindern (> 3-17 Jahre) signifikant länger (2 Tage im Median) als die jüngerer Kinder (≤ 3 Jahre) (p-Wert=0,044). Dies könnte auf eine höhere Prävalenz von Grunderkrankungen bei den älteren Patienten (96% versus 37%; p-Wert=<0,001) zurückzuführen sein. Hier wurden v.a. deutliche Unterschiede bei neurologischen (57% versus 9% p-Wert=<0,001) und pulmonologischen (39% versus 9%; p-Wert=0,001) Grunderkrankungen beobachtet. Eine respiratorische Partialinsuffizienz war ein häufigeres Symptom bei den älteren Kindern (87% versus 58%; p-Wert=0,009), bei denen die Diagnose Pneumonie in der Tendenz (74% versus 56; p=0,113) und ARDS (22% versus 5%; p-Wert=0,013) signifikant häufiger vorkam. Eine Trink- und Nahrungsverweigerung kam, nicht überraschend, bei den jüngeren Kindern häufiger (68% versus 35%; p-Wert=0,004) vor, ebenso die Diagnosen Bronchitis/Bronchiolitis (92% versus 52%; p-Wert=<0,001) und Infektion der oberen Atemwege (80% versus 57%; p-Wert=0,030). Die Inzidenz schwerer RSV-assoziierter ARE bei Kindern auf Intensivstationen lag für die erste Saison bei 31/100.000/Jahr, für die zweite Saison bei 27/100000/Jahr und für die dritte Saison bei 29/100.000/Jahr. In der prospektiven Studie von Forster et al. mussten 1117/100000 aufgrund einer RSV-Infektion hospitalisiert werden [24], eine Inzidenzabschätzung zu intensivstationär behandelten Kindern mit RSV in Deutschland gibt es in dieser Form noch nicht.
Bei 24% der Kinder mit RSV-assoziierter ARE konnte parallel in der durchgeführten Multiplex-PCR Untersuchung, die insgesamt 19 virale Erreger nachweisen kann, ein weiterer viraler Erreger nachgewiesen werden. Bei RSV waren 34% Mehrfachinfektionen (30% waren Doppelinfektionen, 4% waren Dreifachinfektionen). Das CoV war mit 9% der häufigste zusätzlich nachgewiesene Erreger, darauf folgten RV mit 7% und hBoV mit 4%. Kinder mit viraler Mehrfachinfektion waren im Median 4,4 Monate älter als Kinder mit RSV-Monoinfektion (p-Wert=0,030). Die Symptome Atemnot (97% versus 83%; p-Wert=0,017) und Trink- und Nahrungsverweigerung (73% versus 42%; p-Wert=0,003) kamen bei Kindern mit RSV-Monoinfektion häufiger vor. Bezüglich des Schweregrades der Erkrankung gab es keinen Unterschied zwischen Kindern mit Mono- oder Mehrfachinfektion. Neurologische Vorerkrankungen waren jedoch häufiger bei Kindern mit viralen Mehrfachinfektionen (31% versus 9%; p-Wert=0,005) Prädisponierende Faktoren/chronische Vorerkrankungen kamen bei den viralen Mehrfachinfektionen häufiger vor (61% versus 31%; p-Wert=0,004). Insgesamt waren virale Mehrfachinfektionen mit einem Drittel aller RSV-ARE häufig.
Die vorliegende Dissertation bestätigt die Bedeutung von RSV als häufigen Erreger akuter respiratorischer Infektionen der Winter- und Frühlingsmonate in Deutschland und als häufige Ursache für Hospitalisationen, v.a. im frühen Kindesalter. In dieser Dissertation konnte die besondere Bedeutung von RSV als Ursache für intensivstationär behandlungspflichtige Atemwegserkrankungen im Kindesalter hervorgehoben werden. Es ist bemerkenswert, dass RSV mit fast 30% der häufigste Erreger bei Kindern mit respiratorischen Infektionen auf Intensivstationen war, die Letalität mit einem Prozent jedoch vergleichsweise gering war. Bei fast einem Viertel aller Patienten wurde zusätzlich zu RSV mindestens ein weiterer viraler Erreger nachgewiesen. In weiteren Untersuchungen ist zu klären, ob die parallel nachgewiesenen Erreger gemeinsam pathophysiologisch an der untersuchten schweren Atemwegserkrankung beteiligt sind oder ob sich bei Kleinkindern noch über zuvor abgelaufene virale Infektionserkrankungen Virus-DNA nachweisen lässt, die dann im Rahmen der nächsten Erkrankung weiterhin nachweisbar ist.
Die derzeitig verfügbare passive Immunisierung mit einem monoklonalen Antikörper kommt aufgrund der begrenzten Wirksamkeit und der hohen Kosten nur für eine kleine Zahl an Hochrisikopatienten in Frage. Ein geeigneter, möglichst im frühen Säuglingsalter zu applizierender aktiver Impfstoff gegen RSV oder eine maternale Impfung in der Schwangerschaft könnten theoretisch die RSV-Morbidität insgesamt und insbesondere auch die Zahl schwerer RSV-assoziierter ARE senken.
Starting in the late 1990s ionic liquids (ILs) gained momentum both in academia as well as industry. ILs are defined as organic salts with a melting point below 100 °C. Active pharmaceutical ingredients (APIs) may be transferred into ILs by creating salts with a bulky counterion with a soft electron density. ILs have demonstrated the potential to tune important pharmaceutical features such as the solubility and the dissolution rate, particularly addressing the challenge of poor water soluble drugs (PWSD). Due to the tunability of ILs, modification of physico-chemical properties of APIs may be envisioned without any modifications of the chemical structure.
In the first chapter the potential as well as the limitation of ILs are discussed. The chapter commences with an overview of preparation and characterization of API-ILs. Moreover, examples for pharmaceutical parameters are presented which may be affected by IL formation, including the dissolution rate, kinetic solubility or hygroscopicity as well as biopharmaceutical performance and toxicology. The impact of IL formation on those pharmaceutically relevant features is highlighted, resulting in a blueprint for a novel formulation concept to overcome PWSD challenges without the need for structural changes of the API.
Within the second chapter the IL concept is detailed for one specific API - counterion combination. A poorly water soluble acidic API against migraine attacks was transformed into an IL in an effort to minimize the time to maximum plasma concentration (tmax) and optimize the overall bioavailability. These studies were conducted in parallel to a prodrug of the API for comparison of the IL strategy versus a strategy involving modification of the API’s structure. A significantly longer duration of API supersaturation and a 700 fold faster dissolution rate of the IL in comparison to the free acid were obtained and the underlying mechanism was elucidated. The transepithelial absorption was determined using Caco-2 cell layers. For the IL about 3 times more substance was transported in comparison to the prodrug when substances were applied as suspensions, despite the higher permeability of the prodrug, as increased solubility of the IL exceeded this effect. Cytotoxicity of the counterion was assessed in hepatic, renal and macrophage cell lines, respectively, and IC50 values were in the upper µM / lower mM range. The outcome of the study suggested the IL approach instrumental for tuning biopharmaceutical properties, without structural changes of the API as required for preparation of prodrugs. Thus the toolbox for formulation strategies of poorly water soluble drugs could be extended by an efficient concept.
The third chapter focuses on the effect of different counterions on the physico-chemical properties of an API-IL, in particular to overcome the challenge of poor water solubility. Therefore, the same poorly water soluble acidic API against migraine attacks mentioned above was combined with 36 counterions resulting in ILs and low lattice enthalpy salts (LLES). Depending on the counterions, different dissolution rates, durations of supersaturation and hygroscopicities were obtained and release profiles could be tailored from immediate to sustained release. Besides, in vitro the cytotoxicity of the counterions was assessed in three cell lines. Using molecular descriptors such as the number of hydrophobic atoms, the graph theoretical diameter and the number of positive charges of the counterion, the dissolution rate, supersaturation and hygroscopicity as well as the cytotoxicity of counterions could be adequately modeled, rendering it possible to predict properties of new LLESs.
Within the forth chapter different poorly water soluble APIs were combined with the counterion tetrabutylphosphonium (TBP) studying the impact on the pharmaceutical and physical properties of the APIs. TBP-ILs and low lattice enthalpy salts were prepared of the acidic APIs Diclofenac, Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Sulfadiazine, Sulfamethoxazole and Tolbutamide. NMR and IR spectroscopy, DSC, XRPD, DVS and dissolution rate measurements, release profiles and saturation concentration measurements were used to characterize the free acids and TBP salts as compared to the corresponding sodium salts. The TBP salts as compared to the free acids displayed lower melting points and glass transition temperatures and up to 1000 times higher dissolution rates. The increase in the dissolution rate directly correlated with the salts’ hygroscopicity, an aspect which is critically discussed in terms of pharmaceutical translation challenges. In summary TBP ILs of solid salts were proved instrumental to approach the challenge of poor water solubility. The outcome profiled tailor-made counterions as a powerful formulation strategy to address poor water solubility, hence bioavailability and ultimately therapeutic potential of challenging APIs.
In summary, a plethora of ILs and LLESs were prepared by combination of different acidic APIs and counterions. The IL and LLESs concept was compared to conventional salt and prodrug strategies. By choice of the counterion, biopharmaceutical relevant parameters were deliberately modified and release profiles were tuned ranging from immediate to prolonged release. The impact of distinct structural counterion features controlling the dissolution, supersaturation, hygroscopicity and counterion cytotoxicity were identified, correlations were presented and predictive models were built. ILs and LLESs could be proven to be a powerful concept for the formulation of poorly water soluble acidic APIs.
Ionische Flüssigkeiten (engl. Ionic Liquids = IL) sind organische Salze mit einem Schmelzpunkt von unter 100 °C und bieten einen interessanten Ansatz um die orale Bioverfügbarkeit von schlecht wasserlöslichen Arzneistoffen zu verbessern.
Aufgrund seiner schlechten Wasserlöslichkeit wurde aus dem Wirkstoff BGG492 der Novartis AG eine Ionische Flüssigkeit (IL) mit dem sterisch anspruchsvollen Gegenion Tetrabutylphosphonium hergestellt. Die IL ist ein amorpher, glasartiger Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 57 °C. Die freie Säure (FS), das Kaliumsalz (BGG-K+) und die IL (siehe Abb. 69) wurden in festem Zustand mittels polarisationsmikroskopischen Aufnahmen, Röntgen-Pulverdiffraktometrie, Röntgenkristallstrukturanalysen, Infrarot-Spektroskopie und Festkörper-NMR-Spektroskopie untersucht.
Der ionische Charakter der IL in festem Zustand konnte mittels Bandenverschiebung der deprotonierten Sulfonamidgruppe im IR-Spektrum bestätigt werden. In der Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass sich die Moleküle der FS in Schichten anordneten, in denen jedes Molekül mit vier Nachbarmolekülen über Wasserstoffbrücken verbunden war. Das BGG-K+ kristallisierte als Monohydrat. In dieser Kristallstruktur bildeten die Kaliumkationen in der bc-Ebene mit den BGG-Anionen ober- und unterhalb Schichten. Im Gegensatz zu der FS waren keine intermolekularen Wasserstoffbrücken zu beobachten. Die 15N-Festkörper-NMR-Spektren des BGG-K+ und der IL zeigten die gleiche chemische Verschiebung für den unsubstituierten Stickstoffes N-1‘ der Pyrazolgruppe und belegten somit ebenfalls die ionische Struktur der IL im festen Zustand. Die amorphe Struktur der IL wurde mittels Röntgen-Pulverdiffraktometrie und Polarisationsmikroskop bestätigt und eine flüssigkristalline Phase konnte ausgeschlossen werden.
Die IL zeigte im Vergleich zu der FS eine 700-fach schnellere Auflösungsrate J und eine signifikante Verlängerung der Dauer der Übersättigung in wässriger Lösung. Der sprunghafte Anstieg der Kon-zentration in Lösung („spring“) und die Dauer der Übersättigung („parachute“) wurden mittels photometrischen und potentiometrischen Titrationen untersucht. Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie konnte der Mechanismus der Übersättigung aufgeklärt werden. Das sterisch anspruchsvolle Gegenion Tetrabutylphosphonium verhinderte die Protonierung der deprotonierten Sulfonamidgruppe von BGG. In Lösung kam es zur Bildung von Aggregaten („Cluster“), in die sich das Gegenion teilweise einlagerte. Nach der Protonierung und der Bildung von Kristallisationskeimen präzipitierte die ungeladenen FS und der metastabile Zustand der Übersättigung („parachute“) brach zusammen.
Um den Einfluss der Struktur des Gegenions auf die Auflösungsrate und die Dauer der Übersättigung zu untersuchen, wurden ca. 40 Phosphonium- und Ammonium-Kationen synthetisiert. Die Schmelzpunkte der Phosphonium- und Ammonium-Salze wurden mittels dynamischer Differenzkalorimetrie (DSC) ermittelt. Für das Phosphonium-Salz P3332OH-Bromid konnte eine enantiotrope Umwandlung der Modifikationen mittels temperaturabhängiger XRPD-Messungen bestätigt werden. Die Zelltoxizitäts-Untersuchungen der Phosphonium- und Ammonium-Salze an humanen Leberzellen (HepG2), Nierenzellen (HEK 293T) und murinen Makro-phagenzellen (J774.1) zeigten, dass mit höherer Lipophilie die Zelltoxizität zunahm. Polare Kationen zeigten keine Zytotoxizität (IC50 > 1000 µM). Die Zelltoxizität der Ammonium-Salze war im direkten Vergleich mit den Phosphonium-Salzen etwas geringer.
Die synthetisierten Phosphonium- und Ammonium-Salze, die als Chloride-, Bromide- und Iodide vorlagen, wurden durch Anionenaustausch in Hydroxide umgewandelt. Die Ionischen Flüssigkeiten wurden in einer Säure-Base-Reaktion mit der freien Säure des BGG-Moleküls und den Hydroxiden hergestellt. Der ionische Charakter konnte mittels Bandenverschiebung der deprotonierten Sulfonamidgruppe im IR-Spektrum bestätigt werden.
Die Substanzen waren amorph (XRPD) und die Glasübergangstemperaturen (DSC) bewegten sich für die Mono-Kationen im Bereich zwischen 40 °C – 97 °C, für Dikationen 81 °C - 124 °C und für Trikationen 124 °C - 148 °C. Damit erfüllten einige Substanzen die Definition einer Ionischen Flüssigkeit nicht (Smp. < 100 °C) und wurden daher als Niedrig-Gitter-Enthalpie-Salze (low lattice enthalpy salt = LLES) bezeichnet. Die ILs und LLES zeigten signifikante Unterschiede in der Auflösungsrate J, der Übersättigungszeit und der Wasserdampfsorption.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch die Auswahl des Gegenions wichtige Parameter für die orale Bioverfügbarkeit gesteuert werden können. Durch diesen Ansatz war es möglich, aus dem sehr schlecht wasserlöslichen Arzneistoff BGG492 Ionische Flüssigkeiten bzw. LLES herzustellen, die sich drastisch schneller auflösten und teilweise über mehrere Stunden übersättigte Lösungen bildeten. Insgesamt zeigte sich, dass durch eine Zunahme der Polarität des Gegenions eine größere Auflösungsrate J und eine geringere Zelltoxizität erzielt werden konnten. Jedoch verringerte sich dadurch die Dauer der Übersättigung in Lösung und erhöhte die Hygroskopizität der ILs und LLES.
Immunsuppression und Glucocorticoid-Einnahme wurden bereits als Risikofaktoren für die Entwicklung eines komplizierten Verlaufs der akuten Sigmadivertikulitis erkannt. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist jedoch noch nicht vollständig verstanden. Ziel dieser Arbeit war es den Glucocorticoid-induzierten TNF Rezeptor (GITR) und die Matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9) als potentielles molekulares Bindeglied zwischen Immunsuppression und der Entwicklung einer komplizierten Form der Divertikulitis zu untersuchen.
Hiefür erfolgte die Analyse von GITR und MMP-9 auf Proteinebene (Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Doppelmarkierungen) und mRNA-Ebene (semiquantitative RT-PCR) im Colon sigmoideum von Patienten, welches aufgrund einer Sigmadivertikulitis (kompliziert und unkompliziert) reseziert worden war. Abschließend folgte die Korrelation mit den klinischen Parametern. Die Wertigkeit der GITR-Expression als diagnostischer Test wurde mittels ROC-Analyse untersucht.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigten eine hohe GITR- und MMP-9- Expression im entzündlichen Infiltrat bei komplizierten Sigmadivertikulitiden, während sich bei den unkomplizierten Formen nur eine geringe Expression nachweisen ließ. Die immunhistochemischen Ergebnisse sind auf mRNA-Ebene bestätigt worden. Die Immunfluoreszenz-Doppelfärbung zeigte eine deutliche Korrelation zwischen MMP- 9- und GITR-Expression (p<0,001). Eine hohe GITR-Expression war signifikant mit der Einnahme von Glucocorticoiden assoziiert (p<0,001). Die ROC- Analyse bestätigte die Überlegenheit von GITR als diagnostischer Test gegenüber Labortests (CRP, WBC) und klinischen Parametern (Körpertemperatur) bei der Differenzierung zwischen komplizierter und unkomplizierter Divertikulitis.
Die erhöhte MMP-9-Expression, welche durch GITR induziert wird, könnte die bereits bekannten Veränderungen der Kolonwand bei Patienten mit komplizierter Divertikulitis erklären. Darüber hinaus lassen diese Ergebnisse GITR als mögliches molekulares Bindeglied zwischen Glucocorticoid-Einnahme und komplizierten Verlaufsformen der Sigmadivertikulitis vermuten und unterstützen somit die frühzeitige Indikation zur elektiven Sigmaresektion bei Immunsuppression.
Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Thema Hörspiel und der Fragestellung, wie die Technik diese Kunstform beeinflusst hat. Um dies zu untersuchen, wurden verschiedene Hörspiele aus den unterschiedlichsten Bereichen herangezogen und unter drei wesentlichen Aspekten untersucht: 1.) „Der Hörer und das Hörspiel“: Dieser Bereich umfasst eine Darstellung der Zusammenhänge des Hören und Wahrnehmens eines Hörspiels durch den Hörer und die Beeinflussung der Wiedergabe entsprechender Schallvorgänge im Raum des Hörers durch technische und räumliche Aspekte. 2.) „Primär-formative Prozesse“: Innerhalb dieser Kapitel wurde die Beeinflussung der originären Schallereignisse durch den Vorgang der Aufnahme und die dabei stattfindenden Prozesse untersucht. Die wesentlichen und berücksichtigten, die Schallaufnahme beeinflussenden Parameter waren hierbei das Hörspielstudio „im Ganzen“, die Schallwandlung im technischen Sinne, der Einfluss der Stereofonie auf das Hörspiel sowie verschiedene daraus resultierende Formen der Inszenierungen. 3.) „Sekundär-formative Prozesse“: In diesem Bereich wurden gestaltende Prozesse erfasst und untersucht, die die aufgenommenen Schallereignisse beeinflussen und/oder zu gänzlich neuen Klangkonstrukten formen. Dies reicht vom Schnitt oder der Blende bis hin zu komplexen Modifikationen mit einer Vielzahl von radiofonen Effekten.
Die Analysen der einzelnen Hörspiele fanden dabei nicht nur aus technischer Sicht statt, sondern standen stets in einem engen Zusammenhang mit den dramaturgischen Vorgängen des entsprechenden Werkes. Darüber hinaus wurden aktuelle Produktionsaspekte für ein Hörspiel berücksichtigt, die zugleich in die Diskussion mit entsprechender Literatur gestellt wurden.
Zusammengefasst hat sich gezeigt, dass das Hörspiel eine Kunstform ist, die permanent durch die Technik beeinflusst wurde und wird. Der Zusammenhang zwischen Technik und auditiver Kunstform hat eigene dramaturgische Formen hervorgebracht, die das Hörspiel vor allem als eine eigenständige, von anderen Fachdisziplinen losgelöste Gattung definiert und im Umkehrschluss verschiedenste Fachbereiche für sich beansprucht.
Einleitung: Methylphenidat (MPH) als Medikament der ersten Wahl bei Patienten mit einem Aufmerksamkeitsdefizit- /Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) ist für die Therapie von Kindern aber auch von Erwachsenen weit verbreitet. Weil es immer noch Sicherheitsbedenken gegen dieses Medikament gibt, wurde in der vorliegenden Studie untersucht, ob die Langzeiteinnahme von MPH unschädlich hinsichtlich eines zytogenetischen Effektes ist. Ein weiteres Ziel war die Beurteilung von chronischer psychosozialer Stressbelastung von Patienten im Vergleich zu Kontrollprobanden und zu beurteilen ob die Medikation einen Einfluss auf die Höhe des Stresses hat. Nicht zuletzt war das dritte Ziel der Studie zu untersuchen, ob Stress selbst zu zytogenetischen Schäden führt.
Material und Methoden: Lymphozyten von 72 (42 ADHS- und 28 gesunde Kontrollprobanden) geschlechts- und altersgematchte Probanden im Alter von 18-28 Jahren, wurden aus venösem Blut für den Mikronukleusassay isoliert. Hauptendpunkt der Studie war die Mikrokernanzahl in binukleären Zellen.
Die psychosoziale Stressbelastung der letzten drei Monate wurde mit dem Trier Inventar zum chronischen Stress (TICS) gemessen. Zusätzlich wurden Speichelproben für eine Cortisolmessung gesammelt.
Ergebnisse: Ein Einfluss der MPH-Einnahme auf die Mikrokernfrequenz konnte nicht gefunden. ADHS-Patienten wiesen eine signifikant höhere Stressbelastung im Vergleich zu den Kontrollprobanden auf. Ein signifikanter positiver Einfluss auf das chronische Stresserleben unter MPH-Einnahme konnte bei Einnahme von mehr als 1 Jahr beobachtet werden.
Die Stressbelastung der ADHS-Patienten und Kontrollprobanden zeigte keine Korrelation zu zytogenetischen Endpunkten. Eine kleine Untergruppe, ADHS-Patienten mit Komorbidität Depression, zeigte jedoch signifikante erhöhte Mikrokernfrequenzanzahlen unter stark erhöhtem chronischen Stress.
Aussichten: Aus unserer Sicht kann MPH auch in der Langzeittherapie sicher hinsichtlich eines Krebsrisikos in gewichts- und symptomadaptierter Dosis eingesetzt werden.
Weitere Studien sind nötig um das Krebsrisiko bei chronischer erhöhter Stressbelastung abzuschätzen.
Die Tatsache, dass sich DGKH-GAT in einer vorausgehenden Studie als ein krankheitsübergreifender Risiko-Haplotyp für verschiedene Stimmungserkrankungen herausstellte, legte für uns den Schluss nahe, dass dieser Einfluss auf psychiatrische Symptome haben könnte, die typischerweise mit Stimmungsschwankungen einhergehen. In Anlehnung an das Endophänotypenkonzept vermuteten wir, dass wir über die Symptomebene möglicherweise Parameter definieren könnten, die enger mit DGKH-GAT assoziiert sind als die bipolar-affektive Erkrankung selbst.
Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, den Einfluss von DGKH-GAT auf klinische Symptome in einer bipolaren Stichprobe darzustellen, wobei wir insbesondere eine Assoziation mit der Dimension „Erregung“, in welcher typische manische Symptome zusammengefasst sind, und der Dimension „Depression“, die typische depressive Symptome umfasst, vermuteten. Zur Erfassung der psychiatrischen Symptome verwendeten wir den OPCRIT (McGuffin et al., 1991; Farmer et al., 1992), eine Checkliste von 90 Items, die Psychopathologie und sozio-demographische Hintergrundinformation erfasst. Um die so erhobenen Daten statistisch sinnvoll auswerten zu können, war eine Zusammenfassung der Items in Dimensionen notwendig. In der Vergangenheit waren zahlreiche Faktorenmodelle für den OPCRIT berechnet worden. Wir entschlossen uns, das 9-Faktorenmodell von Maciukiewicz et al. (2012) zu übernehmen. Als Dimensionen wurden somit „Depression“, „atypische Depression“, „Desorganisation“, „soziales Funktionsniveau“, „Erregung“, „Positiv“, „Psychotisch“, „Substanzgebrauch“ und „Negativ“ definiert.
In dieser Arbeit wurde nun für 186 bipolare Patienten die klinische Symptomatik über die gesamte Lebenszeit mittels OPCRIT erfasst. Das Sample setzte sich aus 106 GAT-Trägern und 80 Nicht-Trägern zusammen.
Eine signifikante Assoziation mit dem Vorhandensein von DGKH-GAT konnte lediglich für die Dimension „Substanzgebrauch“ ermittelt werden. Da jedoch zwischen Frauen und Männern ein signifikanter Unterschied für diese Dimension bestand und die Merkmale Geschlecht und Vorhandensein von DGKH-GAT statistisch voneinander abhängig waren (t (108) = 3,7; p = 0,000), wurden die Geschlechter nochmals getrennt voneinander berechnet. Hierbei stellte sich heraus, dass bei den Frauen keine Assoziation von DGKH-GAT mit einer OPCRIT-Dimension mehr nachgewiesen werden, wohingegen die signifikante Assoziation zwischen DGKH-GAT und „Substanzgebrauch“ bei den männlichen Probanden weiterhin bestand (t (56,4) = -3,56; p = 0.01). DGKH-GAT zeigte entgegen unserer Erwartung keine Assoziation mit den Stimmungsdimensionen „Depression“ und „Erregung“. Diese Arbeit legt also nahe, dass DGKH-GAT keinen Einfluss auf die Ausprägung von Stimmungssymptomen hat.
Möglicherweise lässt sich dieses Ergebnis dadurch erklären, dass, wenn man von einem polygenen Vererbungsmuster mit kleinen Effektstärkten eines einzelnen Haplotyps wie DGKH-GAT auf die klinische Ausprägung von psychiatrischen Symptomen ausgeht, unsere Samplegröße von 186 Patienten für den untersuchten genetischen Zusammenhang zu gering war. Damit wären weitere Untersuchungen mit größeren Kollektiven notwendig, um den Einfluss von DGKH-GAT sicher beurteilen zu können. Es erscheint auch denkbar, dass klinische Symptomkomplexe grundsätzlich nicht geeignet sind, um die Auswirkungen einer genetischen Risikovariante zuverlässig abzubilden, da sie zeitlich nicht stabil sind und durch viele Umweltfaktoren beeinflusst werden können. Bisher ist die exakte Rolle, die das von DGKH kodierte Enzym in der Pathophysiologie der bipolar-affektiven Erkrankung spielt, noch nicht vollständig aufgeklärt worden. Da DGKH am lithiumregulierten Signalweg beteiligt ist, könnte man spekulieren, dass es auf einer ähnlichen Ebene wirkt wie Lithium. Das Medikament übt keinen großen Einfluss auf den Phänotyp aus, sondern verhindert das „Kippen“ in eine Krankheitsphase. Möglicherweise wirkt der Risiko-Haplotyp DGKH-GAT entgegengesetzt, indem er die Erkrankung „anstößt“, wohingegen der Verlauf und die Ausprägung der klinischen Symptomatik durch andere Faktoren beeinflusst wird.
In dieser Arbeit werden für die Anwendung in der menschlichen Lunge
optimierte Methoden zur Bestimmung von T1- und T2*-Karten diskutiert:
Dc-Gating ermöglicht die Quantifizierung in freier Atmung, wobei für die
T1-Quantifizierung mittels Inversion Recovery eine Korrektur des dc-Signals
entwickelt wurde. Dies hat den Vorteil, dass Parameterkarten aus mehreren
Messungen anhand ihrer dc-Signale passend überlagert werden können. Da T1
und T2* auf unterschiedliche Art und Weise von der Sauerstoffkonzentration
abhängen, verbessert dies die Möglichkeit, ΔT1- und ΔT2*- Differenzkarten aus
Messungen mit unterschiedlichen O2-Konzentrationen im Atemgas zu erstellen.
Die Parameterquantifizierung ist in erster Linie für die Beobachtung von
Krankheitsverläufen interessant, da T1 und T2* absolute, vergleichbare Zahlen
sind. Da T2* deutlich vom Atemzustand abhängt, ist es auch hierfür sinnvoll,
durch Gating identische Atemzustände abzubilden. Um die unterschiedlichen
Einflüsse des Sauerstoffs auf T1 und T2* besser vergleichbar zu machen, wurde
in dieser Arbeit weiterhin eine kombinierte Messung für beide Parameter
implementiert: Da auch diese in freier Atmung stattfindet, profitieren nicht
nur die Differenzkarten von der Überlagerung der Bilder, sondern auch der
Vergleich der ΔT1- und ΔT2*-Karten untereinander.
Messungen mit einer konventionellen kartesischen Methode an COPD-Patienten
unter Raumluft- und 100% Sauerstoffatmung ergaben bei Verwendung identischer
Atemmasken ein deutlich geringeres ΔT1 als in gesunden Probanden. Dass T1 in
der Lunge nicht nur von der Sauerstoffkonzentration sondern auch von der
Gewebezusammensetzung und insbesondere auch dem Blutvolumenanteil abhängt,
zeigte sich hierbei aber auch an den bei COPD im Mittel sehr viel kürzeren
T1-Zeiten bei Raumluft. Die aufgrund emphysematischer Veränderung noch
zusätzlich reduzierte Protonendichte im Parenchym kranker Lungen macht diese
Messungen allerdings besonders schwierig.
Die oben erwähnten Optimierungen der T1-Quantifizierung zielen daher auch
darauf ab, das Signal aus der Lunge zu maximieren, um Patientenmessungen
einfacher zu machen: Messungen in freier Atmung sind für Patienten nicht nur
einfacher, sondern erlauben effektiv auch längere Messzeiten. Insbesondere
wurde aber durch die Entwicklung einer radialen Methode die Echozeit zur
Messung reduziert, um die kurze T2*-Zeit in der Lunge auszugleichen.
Schließlich wurde durch Implementation einer 2D UTE Sequenz die Messung bei
der kürzesten vom Scanner erlaubten Echozeit ermöglicht.
Die Messungen bei ultrakurzen Echozeiten in Probanden zeigten allerdings
deutlich kürzere T1-Zeiten als die zuvor gefundenen oder in der Literatur
dokumentierten. In weiteren Experimenten wurde das sichtbare T1 zu mehreren
Echozeiten mit Hilfe der zur kombinierten Quantifizierung entwickelten
Methode bestimmt. Dabei ergab sich eine Zunahme des gemessenen T1 mit der
Echozeit. Aus diesem Verhalten sowie den gefundenen kürzesten und längsten T1
lässt sich schließen, dass das intra- und extravaskuläre Lungenwasser, also
Blut bzw. das umgebende Gewebe, mit unterschiedlichen T1- und T2*-Zeiten zum
Signal und damit auch dem effektiven T1 beitragen.
Dass das TE der Messung die Gewichtung dieser Kompartimente bestimmt, hat
dabei mehrere Auswirkungen: Einerseits bedeutet dies, dass beim Vergleich von
T1-Messungen in der Lunge stets auch das TE mitbetrachtet werden muss, bei
dem diese durchgeführt wurden. Andererseits lässt sich die Möglichkeit, die
Messung auf die unterschiedlichen Kompartimente abzustimmen, potentiell
ausnutzen, um zusätzliche diagnostische Informationen zu gewinnen: Da T1 vom
Blutvolumenanteil und der Gewebezusammensetzung abhängt, könnte dieser Effekt
helfen, diese beiden Einflüsse zu differenzieren.
Während die in dieser Arbeit beschriebenen Experimente die TE-Abhängigkeit
des sichtbaren T1 in Probanden aufzeigen, liefern sie allerdings noch keine
genaue Erklärung für die möglichen Ursprünge dieses Effekts. Um diese weiter
zu untersuchen, könnten allerdings gezielte Phantom- und in vivo-Experimente
Aufschluss geben: Ein Aufbau, der die Feldverzerrung durch luftgefüllte
Alveolen in Lösungen mit entsprechenden verschiedenen Suszeptibilitäten
nachbildet, reduziert den Unterschied zwischen den Kompartimenten auf T1 und
χ. Eine in vivo-Messung mit möglichst großer Differenz zwischen Ex- und
Inspiration hingegen könnte den Einfluss der Abstände der Kompartimente vom
Gasraum aufzeigen, da die Alveolarwände in tiefer Inspiration am weitesten
gedehnt und daher am dünnsten sind.
Medulloblastome (MB) gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen des Kindes- und Jugendalters, in der Gruppe der intrakraniell und intraspinal gelegenen Tumoren stellen sie gar die häufigste Entität in dieser Altersgruppe dar. Die Einteilung der nach WHO Grad IV klassifizierten Medulloblastome erfolgt derzeit hauptsächlich in vier Subgruppen entsprechend der jeweils vorherrschenden molekulargenetischen Veränderungen. Aberrationen der Chromosomen 7 und 17 sind dabei die häufigsten molekulargenetischen Veränderungen der als Hochrisiko-MB eingestuften Tumoren der Gruppe 3 und 4.
Das LIM- und SH3-Domänen-Protein „LASP-1“ ist auf Chromosom 17 in der Region q11 – q21.3 codiert und wird im humanen Organismus ubiquitär exprimiert. LASP-1 wurde in vergleichenden mRNA-Analysen als eines der am stärksten hochregulierten Transkripte in MB mit Chromosom 17q – Zugewinn identifiziert. Als ein Aktin – bindendes Gerüstprotein spielt LASP-1 eine wichtige Rolle in der Zytoskelettorganisation humaner Zellen. Die pathophysiologische Bedeutung einer LASP-1-Überexpression wurde bereits unter anderem in Brustkrebs- und Ovarialkrebszellen demonstriert, in denen ein LASP-1-silencing die Migration und Proliferation der Zellen hemmte.
Die Ergebnisse dieser Dissertation unterstreichen bisherige Annahmen, dass eine LASP-1-Überexpression eine wichtige Rolle in der Tumorigenese und Metastasenbildung humaner Tumoren spielt. Mittels Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisation von LASP-1 und F-Aktin in MB bestätigt werden. Aufgefallen ist dabei eine besonders starke Akkumulation der phosphorylierten Variante von LASP-1 in MB-Zellkernen. Funktionelle Untersuchungen zu LASP-1 in MB erbrachten zudem folgende Ergebnisse: ein LASP-1 silencing mittels small-interfering-RNA (siRNA) führte zu einer signifikant verringerten Proliferations- und Migrationsfähigkeit der untersuchten Tumorzellen. Die Adhäsionsfähigkeit der MB-Zellen konnte durch ein LASP-1-silencing hingegen signifikant gesteigert werden – ein erstmaliger direkter Nachweis des möglichen Einflusses von LASP-1 auf die Adhäsionsfähigkeit humaner Tumorzellen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen bisherige Erkenntnisse zur Funktion von LASP-1 in humanen Tumorzellen und übertragen diese auf das humane Medulloblastom. Parallel zu dieser Dissertation durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen (DKFZ, Heidelberg) stellten eine signifikante Korrelation einer hohen LASP-1-Expression in humanen MB und einem Zugewinn auf Chromosom 17q, einer fortgeschrittenen Metastasierung sowie schlechterem progressfreien und schlechterem Gesamtüberleben her. Nicht zuletzt im Kontext individualisierter Therapieansätze, basierend auf jeweiligen molekulargenetischen Veränderungen der Tumoren, könnte LASP-1 somit als ein prognostischer Marker in humanen Medulloblastomen dienen und zum Beispiel eine Therapie-(De)Eskalation stützen.
In der vorliegenden klinischen Studie wurden die Langzeitergebnisse von Patienten nach subtalarer Luxation vorgestellt und mit der aktuellen Literatur verglichen. Hierfür wurden 22 Patienten im Zeitraum September 2008 bis April 2009 klinisch und radiologisch (Computertomographie) nachuntersucht. Die klinische Nachuntersuchung erfolgte mit Hilfe zweier Scores, des Zwipp- Scores sowie des VAS- Scores, wodurch das subjektive Empfinden der Patienten im Bezug auf Schmerz, Wetterfühligkeit und Zufriedenheit sowie objektive Ergebnisse aus den Bereichen Weichteile, Statik, Dynamik sowie Funktion dokumentiert wurden. Zur Erfassung des radiologischen Ergebnisses wurde eine Computertomographie beider Füße mit OSG angefertigt, welche im Bezug auf den Arthrosegrad im Talonavicular- sowie im Talo- Calcanear- Gelenk beurteilt wurden. Zur besseren Beurteilung und Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurden die Patienten entsprechend ihrer Gesamtnoten in vier Gruppen eingeteilt. Hiernach erzielten 18% der Patienten ein sehr gutes, 9% ein gutes und 41% ein befriedigendes Langzeitergebnis nach subtalarer Luxation. 32% der Patienten erreichten weniger als 44 Punkte im Zwipp- Score und wurden somit in die Gruppe 4 (schlechtes Langzeitergebnis) eingeteilt. Eine umgehende, idealerweise geschlossene Reposition nach subtalarer Luxation erscheint günstig für ein gutes Outcome der Patienten, die Luxationsrichtung hat nach isolierten unkomplizierten Luxationen keine Einfluss auf das Gesamtergebnis. Offene Luxationen und höhergradige Weichteilverletzungen finden sich vermehrt nach lateralen Luxationen, hiernach können weniger gute und sehr gute Langzeitergebnisse erzielt werden als nach medialen Luxationen. Nach isolierten subtalaren Luxationen sollte die Dauer der Ruhigstellung 4 Wochen nicht überschreiten, frühzeitige Bewegungsübungen und Teilbelastung wirken sich hierbei positiv auf das Langzeitergebnis aus. Unsere Nachbehandlungsstrategie mit 6 Wochen Unterschenkelgips und Fixateur externe bei kritischen Weichteilverhältnissen erscheint sinnvoll und entspricht den Empfehlungen der Literatur. Als ungünstige Kriterien lassen sich begleitende Frakturen der großen Fußwurzelknochen (Calcaneus/Talus) sowie höhergradige Weichteilschäden nennen. Außerdem scheinen Patienten mit begleitendem Poly- bzw. Schädelhirntrauma ein schlechteres Ergebnis zu erzielen.
Alveolar and cystic echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis and Echinococcus
granulosus respectively, are severe zoonotic diseases with limited treatment
options. The sole curative treatment is the surgical removal of the complete parasite
material. Due to late diagnosis, chemotherapeutic treatment often is the only treatment
option. Treatment is based on benzimidazoles, which merely act parasitostatic
and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs are urgently
needed.
Evolutionarily conserved signalling pathways are known to be involved in hostparasite
cross-communication, parasite development and survival. Moreover, they
represent potential targets for chemotherapeutic drugs. In this context the roles of
the serotonin- and cAMP-signalling pathways in Echinococcus were studied.
Genes encoding serotonin receptors, a serotonin transporter and enzymes involved in
serotonin biosynthesis could be identified in the E. multilocularis and E. granulosus
genomes indicating that these parasites are capable of synthesizing and perceiving
serotonin signals. Also the influence of exogenous serotonin on parasite development
was studied. Serotonin significantly increased metacestode vesicle formation
from primary cells and re-differentiation of protoscoleces. Inhibition of serotonin
transport with citalopram significantly reduced metacestode vesicle formation from
primary cells and caused death of protoscoleces and metacestodes. Furthermore, it
could be shown that serotonin increased phosphorylation of protein kinase A substrates.
Taken together, these results show that serotonin and serotonin transport
are essential for Echinococcus development and survival. Consequently, components
of the serotonin pathway represent potential drug targets.
In this work the cAMP-signalling pathway was researched with focus on G-protein
coupled receptors and adenylate cyclases. 76 G-protein coupled receptors, including
members of all major families were identified in the E. multilocularis genome.
Four genes homologous to adenylate cyclase IX were identified in the E. multilocularis
genome and three in the E. granulosus genome. While glucagon caused
no significant effects, the adenylate cyclase activator forskolin and the adenylate
cyclase inhibitor 2’, 5’ didesoxyadenosine influenced metacestode vesicle formation
from primary cells, re-differentiation of protoscoleces and survival of metacestodes.
It was further shown that forskolin increases phosphorylation of protein kinase A
substrates, indicating that forskolin activates the cAMP-pathway also in cestodes.
These results indicate that the cAMP signalling pathway plays an important role in
Echinococcus development and survival.
To complement this work, the influence of different media and additives on E. granulosus protoscoleces was investigated. Anaerobic conditions and the presence of FBS
prolonged protoscolex survival while different media influenced protoscolex activation
and development.
Taken together, this work provided important insights into developmental processes
in Echinococcus and potential drug targets for echinococcosis chemotherapy.
The goal of the project VascuBone is to develop a tool box for bone regeneration, which on one hand fulfills basic requirements (e.g. biocompatibility, properties of the surface, strength of the biomaterials) and on the other hand is freely combinable with what is needed in the respective patient's situation. The tool box will include a variation of biocompatible biomaterials and cell types, FDA-approved growth factors, material modification technologies, simulation and analytical tools like molecular imaging-based in vivo diagnostics, which can be combined for the specific medical need. This tool box will be used to develop translational approaches for regenerative therapies of different types of bone defects. This project receives funding from the European Union's Seventh Framework Program (VascuBone 2010).
The present study is embedded into this EU project. The intention of this study is to assess the changes of the global gene expression patterns of endothelial progenitor cells (EPCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) after direct cell-cell contact as well as the influence of conditioned medium gained from MSCs on EPCs and vice versa. EPCs play an important role in postnatal vasculogenesis. An intact blood vessel system is crucial for all tissues, including bone. Latest findings in the field of bone fracture healing and repair by the use of tissue engineering constructs seeded with MSCs raised the idea of combining MSCs and EPCs to enhance vascularization and therefore support survival of the newly built bone tissue. RNA samples from both experimental set ups were hybridized on Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 and analyzed by microarray technology. Bioinformatic analysis was applied to the microarray data and verified by RT-PCR.
This study gives detailed information on how EPCs and MSCs communicate with each other and therefore gives insights into the signaling pathways of the musculoskeletal system. These insights will be the base for further functional studies on protein level for the purpose of tissue regeneration. A better understanding of the cell communication of MSCs and EPCs and subsequently the targeting of relevant factors opens a variety of new opportunities, especially in the field of tissue engineering.
The second part of the present work was to develop an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for a target protein from the lists of differentially expressed genes revealed by the microarray analysis. This project was in cooperation with Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany. The development of the ELISA aimed to have an in vitro diagnostic tool to monitor e.g. the quality of cell seeded tissue engineering constructs. The target protein chosen from the lists was klotho. Klotho seemed to be a very promising candidate since it is described in the literature as anti-aging protein. Furthermore, studies with klotho knock-out mice showed that these animals suffered from several age-related diseases e.g. osteoporosis and atherosclerosis. As a co-receptor for FGF23, klotho plays an important role in bone metabolism. The present study will be the first one to show that klotho is up-regulated in EPCs after direct cell-cell contact with MSCs. The development of an assay with a high sensitivity on one hand and the capacity to differentiate between secreted and shedded klotho on the other hand will allow further functional studies of this protein and offers a new opportunity in medical diagnostics especially in the field of metabolic bone disease.
In der nuklearmedizinischen Therapie werden Radiopharmaka meist systemisch verabreicht. Primär werden dafür, wegen der kurzen Reichweite, beta-Strahler eingesetzt. Als Folge davon verteilt sich das Radiopharmakon im Körper, reichert sich in Organen und Zielstrukturen an und bestrahlt somit den Körper intern, im Gegensatz zur externen Bestrahlung bei der Strahlentherapie.
Das Verteilungsmuster der verabreichten Aktivität im Körper wird durch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Radiopharmakons bestimmt. Außerdem sind die Aktivität und die Art der Anreicherung ausschlaggebend für die durch ionisierende Strahlung deponierte Energie im Körper, der Energiedosis.
Gemeinsam haben externe und interne Bestrahlungsverfahren, dass der Patient ionisierender Strahlung ausgesetzt ist, die nicht nur die kranken Zellen zerstört, sondern auch gesunde Zellen schädigen kann. Dies geschieht durch direkte oder indirekte Wechselwirkung der Strahlung mit der DNA, die zur Schädigung der DNA-Struktur führt. Am häufigsten sind dabei Einzelstrangbrüche und Basenschäden. Die Doppelstrangbrüche sind im Vergleich zu Einzelstrangbrüchen und Basenschäden sehr selten aber sehr viel schädlicher für die Zelle, da die Reparatur komplizierter ist. Somit sind diese primär für den Zelltod oder für die Folgen nach fehlerhafter Reparatur verantwortlich.
Eine sehr schnelle Antwort auf strahleninduzierte oder durch andere Stoffe, wie z.B. zytotoxische Substanzen, induzierte Doppelstrangbrüche ist die Phosphorylierung der Histon H2 Variante H2AX, die gamma-H2AX genannt wird. Zusätzlich reichert sich das Protein 53BP1 nach dem Erkennen eines Doppelstrangbruches durch Sensorproteine sofort am Chromatin, das den Doppelstrang umgibt, an. Damit ist 53BP1 ein weiterer Biomarker, der strahleninduzierte Doppelstrangbrüche sehr effektiv nachweisen kann und der auf sehr verlässliche Weise mit gamma-H2AX kolokalisiert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung lassen sich gamma-H2AX und 53BP1 als umschriebene „Foci“, im Zellkern mikroskopisch darstellen und zählen. Unter der Annahme, dass ein Focus einem Doppelstrangbruch entspricht, kann die Anzahl der Foci im Zellkern als quantitativer Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche und damit für die Strahlenexposition und Strahlenwirkung verwendet werden.
Zudem zeigen Studien der Induktion von gamma-H2AX nach externer Bestrahlung von unterschiedlichen Gewebearten Linearität zwischen der Energiedosis und der Zahl der Foci im Zellkern. Weitere Studien beschäftigen sich mit den Auswirkungen externer Bestrahlung auf Patienten, aber nur wenige mit offenen radioaktiven Substanzen. Ziele dieser Arbeit waren daher:
1. Die Generierung einer bisher noch nicht beschriebenen in-vitro Kalibrierkurve nach interner Bestrahlung von Vollblut mit den in der Therapie eingesetzten beta-Strahlern.
2. Die gleichzeitige Bestimmung der physikalischen Dosis sowie der strahleninduzierten Anzahl der Foci in Lymphozyten, gewonnen aus Blutproben von Patienten nach Radiopeptidtherapie mit Lu-177 und Radioiodtherapie mit I-131.
3. Eine umfassende Beschreibung der Induktion und der Abnahme der Foci in den Lymphozyten aus den Blutproben der Patienten unter Einbeziehung der in-vitro Kalibrierung, um den dosis- und zeitabhängigen Verlauf der Anzahl der strahleninduzierten Foci zu bestimmen.
Für die in-vitro Kalibrierung mit I-131 und Lu-177 wurden bei Probanden Blutproben gewonnen und mit unterschiedlichen Aktivitätskonzentrationen ergänzt. Das Ziel war, eine Energiedosis bis 100mGy zu erhalten. Das Ergebnis war, dass sich die Zahl der strahleninduzierten Foci in Abhängigkeit von der Energiedosis gut durch eine lineare Funktion beschreiben lässt, so wie es auch für die externe Bestrahlung bereits gezeigt wurde.
Die Patientenstudien befassten sich mit dem Zusammenhang zwischen der im Blut deponierten Energiedosis und der Anzahl und dem zeitlichen Verlauf der induzierten Doppelstrangbrüche im peripheren Blut von Patienten unter Peptidrezeptor-Radionuklidtherapie mit Lu-177 DOTATATE/-TOC und Patienten unter Radioiodtherapie mit I-131 bei Ablationstherapien nach Operation eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms.
Die durchschnittliche Anzahl induzierter DSB-Foci zeigte in den frühen Zeitpunkten einen linearen dosisabhängigen Anstieg. In den ersten Stunden nach Therapie stimmten die in-vitro Kalibrierung und die Zahl der strahleninduzierten Foci sowohl für Lu-177 als auch für I-131 für die Patientendaten gut überein.
Die späteren Zeitpunkte werden durch eine Abnahme der Dosisrate und der Foci-Anzahl, bedingt durch Reparatur der DNA-Schäden, charakterisiert. Überstiegen die Blutdosiswerte in der ersten Stunde jedoch 20mGy (nur nach I-131-Gabe beobachtet), dann war die Induktion eines schnellen Reparaturprozesses festzustellen.
Diese experimentellen Ergebnissen und Modellierungen beschreiben erstmalig die Dosisabhängigkeit und den zeitlichen Verlauf der in-vitro und in-vivo DNA-Schadensantwort nach Inkorporation von beta-emittierenden Radionukliden.
Veränderungen des zentralen serotonergen Systems können mit diversen psychiatrischen Krankheiten wie z. B. Depressionen, Aufmerksamkeitsdefizit/ Hyperaktivitäts-Störung (ADHS), Phobien oder Panik- und Angststörungen assoziiert werden. Die fortlaufende Untersuchung des Neurotransmitters Serotonin (5-HT) und seine Bedeutung für physiologische und verhaltens- bezogene Prozesse ist daher unerlässlich. Tiermodelle, die auf Ausschaltung elementarer oder assoziierter Gene des serotonergen Systems beruhen, sind infolgedessen eine ausgezeichnete Möglichkeit anatomische, (patho)physiolo- gische und verhaltensbezogene Auswirkungen eines fehlgeleiteten serotoner- gen Systems zu untersuchen und zu analysieren. Aufgrund ihrer großen Be- deutung für Lern- und Gedächtnisprozesse steht die Hirnregion des dorsalen Hippocampus im Fokus dieser Dissertation. Die Analyse umfasste jeweils die gesamte Hirnstruktur des Hippocampus bzw. seine Unterregionen, Gyrus dentatus (DG), Cornu Ammonis (CA)1 und CA3.
Die Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung zellulärer bzw. molekularer Veränderungen von konstitutiven Tryptophanhydroxylase 2 (Tph2) knockout (KO) Mäusen. Durch die Inaktivierung von Tph2 und damit dem geschwindig- keitsbestimmenden Enzym (TPH2) der Serotoninsynthese, wurde im zentralen Nervensystem (ZNS) der KO Mäuse ein Mangel von 5-HT festgestellt. Der dorsale Hippocampus wurde auf zellspezifische Veränderungen nach dem Furchtkonditionierungstest analysiert. Die Reaktion der Neurone in den drei Unterregionen der Hirnstruktur wurde durch Immunofluoreszenzfärbung des „immediate-early“ Genprodukts c-fos bzw. des Calcium-bindenden Proteins Parvalbumin untersucht. Es wurde dabei zum einen die absolute Zellzahl in den Strukturen erfasst und zum anderen die Analyse bezüglich des Volumens vorgenommen. Die Zelldichte von c-Fos wies signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen im gesamten dorsalen Hippocampus und bei genauerer Betrachtung in der Unterregion des DG auf. Die Tph2-/- Mäuse zeigten nach dem Furchtkonditionierungstest eine prägnante Erhöhung der aktivierten Zellen. Es scheint, dass 5-HT eine zu starke Aktivierung des dorsalen Hippocampus verhindert um schlechte kontextbezogene Gedächtnisinhalte nicht zu verfesti- gen. Dabei inhibiert 5-HT Zellen im DG und der CA1 Region die nicht zu den Parvalbumin-immunoreaktiven GABAergen Interneuronen gehören.
Viele Patienten, die an Schizophrenie erkrankt sind, zeigen dauerhafte Einschränkungen in sozial-kommunikativen und sozial-kognitiven Kompetenzen. Dies führt oft zu sozialem Rückzug, erschwert alltägliche zwischenmenschliche Interaktion und mindert die Lebensqualität der Patienten deutlich. Jene Einschränkungen sind bei Patienten mit Negativsymptomatik oder chronischen Zuständen besonders ausgeprägt und könnten einer Minderaktivierung im Spiegelneuronensystem unterliegen. Ziel dieser Studie war es, Korrelate von Defiziten in der sozialen Interaktion bei schizophrenen Patienten mit überwiegender Negativsymptomatik im Gegensatz zu gesunden Kontrollpersonen auf verschiedenen Ebenen darzustellen. Hierfür wurde die Fähigkeit zur sozialen Kognition anhand zweier verschiedener psychologischer Testverfahren erhoben und zudem die Gehirnaktivierung während alltagsähnlicher sozialer Interaktion mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie gemessen.
Es konnte gezeigt werden, dass schizophrene Patienten mit vorherrschender Negativsymptomatik unter größeren Beeinträchtigungen zumindest in Teilaspekten von sozialer Kognition leiden als gesunde Kontrollpersonen. Hierbei steht Negativsymptomatik in Zusammenhang mit einer schlechteren Leistung im „Reading Mind in the Eyes Test“, was als „Undermentalizing“ angesehen werden kann. In Bezug auf die neurophysiologischen Messungen von Gehirnaktivität während alltagsähnlicher sozialer Interaktion konnte in der gesunden Kontrollgruppe eine fronto-temporo-parietale Aktivierung festgestellt werden. Hierbei steht insbesondere die Aktivität im Bereich des linken inferioren Parietallappens in Übereinstimmung mit den Ergebnissen zweier vorangegangener Studien (Egetemeir et al. 2011; Herrmann et al. 2015). In der Gruppe der schizophrenen Patienten dieser Studie jedoch zeigte sich keine während „Joint action“ spezifische Aktivität in temporo-parietalen Gehirnregionen. Ebenso war die Gehirnaktivität in den klassischen Spiegelneuronenarealen bei den Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe vermindert. Stattdessen kam es in der Patientengruppe zu einer erhöhten präfrontalen Gehirnaktivierung. Diese verschiedenartige Aktivierungsstrategie bei „Joint action“ kann als kompensatorische Gehirnaktivität interpretiert werden, die es den Patienten ermöglicht, soziale Interaktion erfolgreich zu bewältigen. Falls etwa die entscheidende Rolle während der Bewältigung der vorliegenden „Joint action“-Aufgabe in der Vermittlung visuell-räumlicher Aufmerksamkeitsprozesse durch den inferioren Parietallappen liegt (Herrmann et al. 2015), ist denkbar, dass diese Fähigkeit durch kompensatorische Vorgänge im präfrontalen Kortex übernommen werden kann. Da die Patienten dieser Studie zumeist seit längerer Zeit oder in chronisch residualem Zustand an Schizophrenie mit Negativsymptomatik litten, liegt es nahe, dass sich die kompensatorischen Strategien im Laufe der Zeit durch das alltägliche Leben ausreichend etablieren konnten. Die verminderte Aktivität in Spiegelneuronenarealen innerhalb der Patientengruppe untermauert das Konzept zur Krankheitsentstehung der Schizophrenie von Mehta und Kollegen, welches besagt, dass Gene und Umweltfaktoren ein möglicherweise angeboren defektes Spiegelneuronensystem beeinflussen, wobei erniedrigte Spiegelneuronenaktivität mit Defiziten in sozial kognitiven Einschränkungen und Negativsymptomatik einhergehe (Mehta et al. 2014a). Diese Zusammenhänge können jedoch im Rahmen dieser Studie lediglich vermutet und nicht objektiviert werden.
Durch die vorliegende Untersuchung konnte festgestellt werden, dass schizophrene Patienten mit Negativsymptomatik andere neuronale Strategien während alltagsähnlicher sozialer Interaktion nutzen als gesunde Personen, was einen weiteren Einblick in die neurobiologischen Grundlagen der Erkrankung erlaubt.
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system.
It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models.
In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected.
Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine
In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development.
Measles, mumps and rubella are viral infectious diseases that may cause severe and devastating complications among affected individuals. The disease burden of all three diseases is high, but could be reduced entirely through successful vaccination strategies. As such, the WHO has established the goal of globally eliminating measles and rubella and concomitantly controlling the frequently co-vaccinated mumps.
In 2010, the WHO European Region member states agreed to strengthen efforts to eliminate measles and rubella from Europe by the end of 2015. As this date draws closer, progress analyses become increasingly relevant. In this systematic literature review, the immunization strategies, vaccination coverages and disease incidences of eleven European nations were assessed and their progress towards disease elimination evaluated.
Successful prevention of the endemic transmission of measles, mumps, or rubella could be achieved in several nations, including Sweden, Croatia, Greece and Spain. Austria, France, Germany, Italy, Poland, Turkey and the United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland, though having improved their overall immunization rates, have not yet been able to reach the elimination goals. In Turkey, Italy and Poland, sharp increases in case numbers during recent years are potentially threatening the successful measles, mumps and rubella control in Europe.
Pockets of susceptible population groups that may contribute to the perpetuation of the diseases have been identified. They include infants and young children, adolescents and young adults, adolescent and adult males, recent immigrants and refugees,and traveling ethnic minority groups. Reasons for the increased risk of infection among these groups are manifold and a result of various historic and current vaccination practices, cultural, political and religious differences, as well as individual believes and concerns. Travel and migration of infected individuals to and between the various European nations also play an essential role in the continual transmission of measles, mumps and rubella in Europe. Only an adequate population-wide immunity can prevent the occurrence of major outbreaks due to viral importation. Efforts should therefore be made to immunize all population members able to receive vaccinations and to offer additional immunization opportunities to those susceptible population subgroups that are difficult to reach through routine vaccination programs.
In countries struggling to meet the WHO elimination goals, alternative immunization practices may be necessary. A uniform, European-wide MMR vaccination schedule based on the successful immunization methods of countries that have eliminated measles, mumps and rubella may be an effective tool for improving the overall population-wide immunity and controlling the three diseases. A model for such a schedule was created and includes strategies for reaching population members regardless of age, gender or migratory background. The implementation of uniform immunization recommendations is challenging, but the advantages in terms of improved vaccination, surveillance and disease control methods may be worth at least considering such a strategy in Europe.
Measles, mumps and rubella elimination may be attainable in the WHO European Region. The current epidemiological situation suggests that the goal is unlikely to be reached by the end of 2015, but through continued international efforts and collaboration, effective disease control could be achieved in the near future. In the meantime, improvements in immunization strategies, vaccination coverages, supplementary campaigns as well as disease notification systems and confirmations should be made on a national and international level, so that an adequate population-wide immunity can be established and the disease elimination progresses effectively monitored within the entire European region.
Cancer is one of the leading causes of death. 90% of all deaths are caused by the effects of metastases. It is of major importance to successfully treat the primary tumor and metastases. Tumors and metastases often differ in their properties and therefore, treatment is not always successful. In contrast, those therapeutic agents can even promote formation and growth of metastases. Hence, it is indispensable to find treatment options for metastatic disease. One promising candidate represents the oncolytic virus therapy with vaccinia viruses.
The aim of this work was to analyze two cell lines regarding their metastatic abilities and to investigate whether oncolytic vaccinia viruses are useful therapy options. The cell lines used were the human cervical cancer cell line C33A implanted into immune-compromised mice and the murine melanoma cell line B16F10, implanted into immune-competent mice.
The initial point of the investigations was the observation of enlarged lumbar und renal lymph nodes in C33A tumor-bearing mice 35 days post implantation of C33A cells subcutaneously into immune-compromised nude mice. Subsequently, the presence of human cells in enlarged lymph nodes was demonstrated by RT-PCR. To facilitate the monitoring of cancer cell spreading, the gene encoding for RFP was inserted into the genome of C33A cells. In cell culture experiments, it was possible to demonstrate that this insertion did not negatively affect the susceptibility of the cells to virus infection, replication and virus-mediated cell lysis. The analysis of the metastatic process in a xenografted mouse model revealed the continuous progression of lumbar (LN) and renal (RN) lymph node metastasis after C33A-RFP tumor cell implantation. The lymph node volume and the amount of RFP-positive LNs and RNs was increasing from week to week in accordance with the gain of the primary tumor volume. Moreover, the metastatic spread of cancer cells in lymph vessels between lumbar and renal lymph nodes was visualized. Additionally, the haematogenous way of cancer cell migration was demonstrated by RFP positive cancer cells in blood vessels. The haematogenous route of spreading was confirmed by detecting micrometastases in lungs of tumor bearing mice.
The next step was to investigate whether the recombinant oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 is a suitable candidate to cure the primary tumor and metastases. Therefore, GLV-1h68 was systemically injected into C33A-RFP tumor bearing mice 21 days after tumor cell implantation. It was demonstrated that the volume of the primary tumor was drastically reduced, and the volume and the amount of RFP positive lumbar and renal lymph nodes were significantly decreasing compared to the untreated control group. Subsequently, this process was analyzed further by investigating the colonization pattern in the C33A-RFP model. It was shown that first the primary tumor was colonized with highest detectable virus levels, followed by LN and RN lymph nodes. Histological analyses revealed the proliferative status of tumor cells in the tumor and lymph nodes, the amount of different immune cell populations and the vascular permeability in primary tumors and lymph nodes having an influence on the colonization pattern of the virus. Whereby, the vascular permeability seems to have a crucial impact on the preferential colonization of tumors compared to lymph node metastases in this tumor model.
C33A turned out to be a useful model to study the formation and therapy of metastases. However, a metastatic model in which the influence of the immune system on tumors and especially on tumor therapy can be analyzed would be preferable. Therefore, the aim of the second part was to establish a syngeneic metastatic mouse model.
Accordingly, the murine melanoma cell line B16F10 was analyzed in immunocompetent mice. First, the highly attenuated GLV 1h68 virus was compared to its parental strain LIVP 1.1.1 concerning infection, replication and cell lysis efficacy in cell culture. LIVP 1.1.1 was more efficient than GLV-1h68 and was subsequently used for following mouse studies. Comparative studies were performed, comparing two different implantation sites of the tumor cells, subcutaneously and footpad, and two different mouse strains, FoxN1 nude and C57BL/6 mice. Implantation into the footpad led to a higher metastatic burden in lymph nodes compared to the subcutaneous implantation site. Finally, the model of choice was the implantation of B16F10 into the footpad of immune-competent C57BL/6 mice. Furthermore, it was inevitable to deliver the virus as efficient as possible to the tumor and metastases. Comparison of two different injection routes, intravenously and intratumorally, revealed, that the optimal injection route was intratumorally. In summary, the murine B16F10 model is a promising model to study the effects of the immune system on vaccinia virus mediated therapy of primary tumors and metastases.
Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach.
This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching.
Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect.
The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature.
Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis.
Early life stress, including exposure to prenatal stress (PS), has been shown to affect the developing brain and induce severe effects on emotional health in later life, concomitant with an increased risk for psychopathology. However, some individuals are more vulnerable to early-life stress, while others adapt successfully, i.e. they are resilient and do not succumb to adversity. The molecular substrates promoting resilience in some individuals and vulnerability in other individuals are as yet poorly investigated. A polymorphism in the serotonin transporter gene (5HTT/SLC6A4) has been suggested to play a modulatory role in mediating the effects of early-life adversity on psychopathology, thereby rendering carriers of the lower-expressing short (s)-allele more vulnerable to developmental adversity, while long (l)-allele carriers are relatively resilient. The molecular mechanisms underlying this gene x environment interaction (GxE) are not well understood, however, epigenetic mechanisms such as DNA methylation and histone modifications have been discussed to contribute as they are at the interface of environment and the genome. Moreover, developmental epigenetic programming has also been postulated to underlie differential vulnerability/resilience independent of genetic variation.
The present work comprises two projects investigating the effects of prenatal maternal restraint stress in 5-HTT deficient mice. In the first study, we examined to which extent previously observed changes in behavior and hippocampal gene expression of female 5-Htt+/- prenatally stressed (PS) offspring were associated with changes in DNA methylation patterns. Additionally, we investigated the expression of genes involved in myelination in hippocampus and amygdala of those animals using RT-qPCR. The genome-wide hippocampal DNA methylation screening was performed using methylated-DNA immunoprecipitation (MeDIP) on Affymetrix GeneChip® Mouse Promoter 1.0R arrays. In order to correlate individual gene-specific DNA methylation, mRNA expression and behavior, we used hippocampal DNA from the same mice as assessed before. 5-Htt genotype, PS and their interaction differentially affected the DNA methylation signature of numerous genes, a part of which were also differentially expressed. More specifically, we identified a differentially methylated region in the Myelin basic protein (Mbp) gene, which was associated with Mbp expression in a 5-Htt-, PS- and 5-Htt x PS-dependent manner. Subsequent fine-mapping linked the methylation status of two specific CpG sites in this region to Mbp expression and anxiety-related behavior. We furthermore found that not only the expression of Mbp but of large gene set associated with myelination was affected by a 5-Htt x PS interaction in a brain-region specific manner. In conclusion, hippocampal DNA methylation patterns and expression profiles of female PS 5-Htt+/- mice suggest that distinct molecular mechanisms, some of which are associated with changes in gene promoter methylation, and processes associated with myelination contribute to the behavioral effects of the 5-Htt genotype, PS exposure, and their interaction.
In the second study, we aimed at investing the molecular substrates underlying resilience to PS. For this purpose, we exposed 5-Htt+/+ dams to the same restraint stress paradigm and investigated the effects of PS on depression- and anxiety-like behavior and corticosterone (CORT) secretion at baseline and after acute restraint stress in female 5-Htt+/+ and 5-Htt+/- offspring. We found that PS affected the offspring’s social behavior in a negative manner. When specifically examining those PS animals, we grouped the PS offspring of each genotype into a social, resilient and an unsocial, vulnerable group. While anxiety-like behavior in the EPM was reduced in unsocial, but not social, PS 5-Htt+/+ animals when compared to controls, this pattern could not be found in animals of the other genotype, indicating that social anxiety and state anxiety in the EPM were independent of each other. We then assessed genome-wide hippocampal gene expression profiles using mRNA sequencing in order to identify pathways and gene ontology (GO) terms enriched due to 5-Htt genotype (G), PS exposure (E) and their interaction (GxE) as well as enriched in social, but not unsocial, PS offspring, and vice versa. Numerous genes were affected by 5-Htt genotype, PS and most of all a GxE-interaction. Enrichment analysis using enrichr identified that the genotype affected mitochondrial respiration, while GxE-interaction-affected processes associated primarily with myelination and chromatin remodeling. We furthermore found that 5-Htt+/- mice showed profound expression changes of numerous genes in a genomic region located 10 mio kb upstream of the 5 Htt locus on the same chromosome. When looking at social vs. unsocial mice, we found that a much higher number of genes was regulated in 5 Htt+/- animals than in 5-Htt+/+ animals, reflecting the impact of GxE-interaction. Double the number of genes was regulated in social PS vs. control mice when compared to unsocial PS vs. control in both genotypes, suggesting that the successful adaption to PS might have required more active processes from the social group than the reaction to PS from the unsocial group. This notion is supported by the up-regulation of mitochondrial respiration in social, but not in unsocial, PS 5-Htt+/- mice when compared to controls, as those animals might have been able to raise energy resources the unsocial group was not. Next to this, processes associated with myelination seemed to be down-regulated in social 5-Htt+/- mice, but not in unsocial animals, when compared to controls. Taken together, PS exposure affected sociability and anxiety-like behavior dependent on the 5-Htt genotype in female offspring. Processes associated with myelination and epigenetic mechanisms involved in chromatin remodeling seemed be affected in a GxE-dependent manner in the hippocampus of these offspring. Our transcriptome data furthermore suggest that mitochondrial respiration and, with this, energy metabolism might be altered in 5-Htt+/- offspring when compared to 5-Htt+/+ offspring. Moreover, myelination and mitochondrial respiration might contribute to resilience towards PS exposure in 5-Htt+/- offspring, possibly by affecting brain connectivity and energy capabilities.
Die Blut-Nerven-Schranke stellt eine Barriere zwischen den Axonen und dem Gewebe, das sie umgibt, dar. Durch verschiedene Mechanismen wird die intraneurale Homöostase aufrecht erhalten, welche für die Funktion der Axone essentiell ist. Auf der einen Seite stellt die Blut-Nerven-Schranke einen Schutzmechanismus für Nerven dar. Auf der anderen Seite erschwert sie die Applikationen von Pharmaka, z.B. Analgetika, sodass bis dato Lokalanästhetika die einzige Substanzklasse darstellen, welche zur gezielten örtlichen, analgetischen Therapie in der breiten Verwendung ist. Das Netzwerk der Tight junctions im Perineurium ist eine Schlüsselkomponente für die Funktion der Blut-Nerven-Schranke. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass durch pharmakologische Interaktion mit den Tight Junctions eine Schrankenöffnung erzielt werden kann. Dieser Effekt wurde durch unsere Arbeitsgruppe nachgewiesen für das von der N-terminalen Schleife des Claudin-1 abgeleitete Peptid C1C2, hypertone Substanzen, wie HTS und den Gewebeplasminogenaktivator tPA. Durch Anwendung solcher Wirkstoffvermittler könnte das Axon für andere Substanzklassen erreichbar werden. Die Fragestellung dieser Arbeit war, ob sich durch die lokale Anwendung dieser Pharmaka am N. ischiadicus von Wistar Ratten toxische Effekte ergeben. Hierzu wurden immunhistochemische Färbungen mit einem Anti-CD68- Antikörper zur Darstellung von endoneuralen Makrophagen als Zeichen einer lokalen Entzündungsreaktion verwendet. Weiterhin wurden die Nerven mit Hilfe histomorphometrischer Analysen auf morphologische Veränderungen hin untersucht. Keine der untersuchten Substanzen bewirkte eine Zunahme von endoneuralen Makrophagen im Vergleich zur scheinbehandelten Kontrollgruppe. Die Positivkontrolle eines N. ischiadicus nach chronischer Konstriktionsläsion (CCI) zeigte hingegen eine massive Vermehrung endoneuraler Makrophagen. Bei der morphometrischen Analyse zeigte sich nur bei der mit tPA behandelten Gruppe eine Abnahme der g-Ratio, welche das Verhältnis von Myelinschicht zu Faserdurchmesser wiederspiegelt. Die anderen Teilaspekte der Untersuchung blieben unauffällig. Aus dieser Arbeit kann geschlossen werden, dass sich mit den verwendeten Untersuchungsmethoden für keine der untersuchten Substanzen eine lokal toxische Wirkung nachweisen lässt. Um die Aussagekraft bezüglich der Anwendungssicherheit weiter zu erhöhen, wären im weiteren Verlauf Versuchsreihen mit Blick auf mögliche Langzeitwirkungen und etwaige systemtoxische Wirkungen von besonderer Bedeutung
Postoperative Morbidität und Überleben nach laserchirurgischer pulmonaler Metastasenresektion
(2015)
Hintergrund und Zielsetzung:
Eine zunehmende Anzahl von Studien belegt, dass Patienten mit pulmonaler Metastasierung extrathorakaler Tumore von einer chirurgischen Sanierung profitieren. Dabei werden bevorzugt nicht anatomische, Gewebe sparende Resektionen der suspekten Herde durchgeführt.
Ziel dieser Arbeit war es, die Eigenschaften der laserchirurgischen Technik bei atypischen Keilresektionen zu analysieren sowie Langzeitergebnisse und Vor- oder Nachteile bezüglich Überleben und Morbidität gegenüber konventionellen Techniken zu untersuchen.
Methoden
Im Zeitraum von Juni 2006 bis Dezember 2010 wurden an der Universitätsklinik Würzburg mit Hilfe eines Martin® Nd:YAG MY40 1.3 Lasers 115 atypische Keilresektionen bei 82 Patienten mit pulmonalen Metastasen durchgeführt. Insgesamt wurden 507 suspekte Rundherde entfernt, im Durchschnitt 4 Herde pro Patient.
Retrospektiv wurden die Morbidität und die Komplikationsraten in diesem Kollektiv untersucht sowie die Überlebenszeitanalyse anhand der Kaplan-Meier-Methode durchgeführt. Der Beobachtungszeitraum betrug 3 bis 7 Jahre.
Ergebnisse
Eine komplette Resektion (Resektionsgrad R0) wurde in 86,7% der Fälle pathologisch bestätigt, bei 9,9% der Patienten zeigte sich ein maligner Lymphknotenbefall.
Die 1-, 3- und 5-Jahres Überlebensraten im Gesamtkollektiv betrugen 78,9%, 62,7% und 46,3%, wobei das Überleben nach kompletter Resektion deutlich besser war als nach R1- oder R2- Resektion (54,3% vs 16,7% nach 5 Jahren). Prognostisch günstig zeigte sich das Vorhandensein einer singulären Metastase im Vergleich zu einem multiplen Befall. Es gab keinen Überlebensvorteil bei Patienten mit 2-3 oder 4-10 Metastasen (31% vs 37% nach 5 Jahren). Die Komplikationsrate war mit 14,6% ähnlich wie bei konventionellen Techniken ohne schwerwiegende Vorfälle. Postoperativ schätzten nachsorgende Fachärzte die Lebensqualität und Lungenfunktion der Patienten zum Großteil als gut bis sehr gut ein.
Zusammenfassung
Die Laserchirurgie zeigt sich als schonende und komplikationsarme, dabei präzise und effektive Technik bei der Entfernung von Lungenmetastasen. Das 5–Jahres–Überleben in Würzburg war im Vergleich zu historischen Kollektiven von Patienten nach atypischer Keilresektion in konventioneller Staplertechnik signifikant höher. Vor allem Patienten mit multiplem oder rezidivierendem Befall profitieren von der Lasertechnik.
Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden.
The Corona® charged aerosol detector (CAD) is an aerosol-based detector first de-scribed by Dixon and Peterson in 2002. It is capable of detecting compounds inde-pendent from their physico-chemical properties presumed the analyte is sufficiently non-volatile. Consequently, the CAD is often applied to the analysis of substances that do not possess a suitable UV chromophore. Major drawbacks are however, the detector signal is non-linear and depending on the content of organic solvent in the mobile phase.
This thesis tried to explore possible applications of the CAD for pharmaceutical analysis. Therefore, several substances from different compound classes were in-vestigated. Newly developed or existing methods were validated. Thus the perfor-mance of the CAD could be examined. Both assay and impurity determination were evaluated for their compliance with ICH Q2(R1) “Validation of Analytical Proce-dures” and the “Technical Guide for the Elaboration of Monographs”.
In the course of the establishment of reference substances at the EDQM, a generic screening method for the identification of organic and inorganic pharmaceutical counterions was needed. An HPLC-CAD method developed by Zhang et al. was therefore investigated for its suitability for pharmacopoeial purpose. Method valida-tion was performed. It was found that 23 ions could be separated and detected. Iden-tification was achieved via retention time of an authentic standard of the corre-sponding ions. Alternatively, peak assignment was performed by determination of the exact mass using TOF-MS. Ions could be quantified as impurities or for stoichi-ometric purpose.
For the impurity control in topiramate, the performance characterstics of the CAD were compared to that of an ELSD. CAD was superior to ELSD in terms of repeata-bility, sensitivity and linearity. However, impurities could be quantified with satisfac-tory accuracy with both detectors. The application of the ELSD was not feasible due to non-reproducible spike peaks eluting after the principle peak in the chromatogram of the test solution. One of the impurities, topiramate impurity A (diacetonide), gave no or a vastly diminished signal in the ELSD and the CAD, respectively. It is evapo-rated during the detection process due to its relatively high vapor pressure. The re-sponse could be enhanced by a factor of nine via post-column addition of acetoni-trile and a lower nebulizer temperature. As the response of topiramate impurity A was still about thousand-fold lower than the response of all other impurities, its quantification was not feasible. Additionally, the HPLC-CAD was successfully vali-dated as an assay procedure for topiramate.
There seems to be a great potential in the application of the CAD to the analysis of excipients as most compounds do not possess a suitable UV chromophore. Here, a simple and rapid HPLC-CAD method for the determination of polidocanol (PD) was developed. The method was successfully validated as a potential assay procedure for the Ph. Eur. as none is described in either of the two PD monographs. The same method was applied to the determination of the PD release from a pharmaceutical polymer matrix.
A method for the determination of the fatty acid (FA) composition of polysorbate 80 (PS80) was developed and validated. Using the CAD and mass spectrometry, we were able to identify two new FAs in 16 batches from four manufacturers. All batch-es complied with pharmacopoeial specification. Furthermore, the overall composi-tion of the different PS80 species (“fingerprinting”) and the peroxide content were determined. In addition to the chemical characterization, functionality related charac-teristics (FRCs) were determined. Correlations between chemical composition and FRCs were found.
The validation data of the above mentioned methods suggests that the CAD repre-sents a viable detection technique for pharmaceutical analysis. The CAD was suffi-ciently sensitive for non-volatile analytes. Impurity control down to concentrations of 0.05 or 0.03%, as demanded by ICH Q3A (R2), is achievable. However, the response of semi-volatile compounds may be drastically diminished. It could be confirmed that the response of the CAD is linear when the range does not exceed two orders of magnitude. Exceptions may be observed depending on the actual method setup. When the measuring range is sufficiently narrow, quantification can be done using single-point calibration which is common practice in pharmaceutical anlysis. Impuri-ties may also be quantified against a single calibration solution. However, correction factors may be needed and the accuracy is considerably lower compared to an as-say method. If a compound is to be quantified over a large concentration range, log-log transformation of the calibration curve is needed and a decreased accuracy has to be accepted.
In dieser Arbeit wurden Einzelmolekültechniken zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und G-Proteinen in der Zellmembran lebender Zellen etabliert und angewendet. GPCR stellen die größte Familie membrangebundener Rezeptoren dar und leiten Signale über heterotrimere G-Proteine in das Zellinnere weiter. Auch wenn jüngst sowohl inaktive, als auch aktive Konformationen von GPCR und G-Proteinen mittels Röntgenstrukturanalyse aufgelöst werden konnten, sind die Dynamiken ihrer Aktivierung und Deaktivierung bisher nur bruchstückhaft bekannt. In der Vergangenheit wurden die Schritte der Signalkaskade, beginnend mit der Bindung des Rezeptorliganden bis hin zur Bildung von sekundären Botenstoffen, erfolgreich mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Techniken aufgeklärt. Diesen experimentell bestimmten Aktivierungszeiten stehen Daten aus Modellierungsstudien gegenüber, die sehr viel schnellere Konformationsänderungen vorhersagen, welche bereits in Studien mittels Kernspinresonanzspektroskopie nachgewiesen werden konnten. Folglich ist anzunehmen, dass die Zeitdomäne, innerhalb der die Aktivierung der GPCR stattfindet, sehr breit gefächert ist.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese mehrere Größenordnungen umfassenden Zeitskalen der GPCR-Aktivierung, welche in der Literatur beschrieben werden, mittels bildgebender Einzelmolekülverfolgung (SPT) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zu untersuchen. Beide Verfahren liefern durch Einzelmolekülspuren oder Korrelationskurven eine Art Fingerabdruck des dynamischen Verhaltens des untersuchten Systems, was jeweils mit Vor- und Nachteilen verbunden ist. Die Stärke der Techniken zeigte sich bei dem vorliegenden Projekt vor allem in ihrer Kombination: Die klassische FCS bietet die Möglichkeit, Dynamiken über einen weiten Zeitraum von Mikrosekunden bis Sekunden auszuwerten, allerdings nur innerhalb eines kleinen, optisch definierten Detektionsvolumens. Die bildgebende Einzelmolekülverfolgung liefert hingegen ein großes Sichtfeld und ermöglicht somit die parallele Analyse vieler Einzelmolekülereignisse über die Zelle verteilt, jedoch auf Kosten der Zeitauflösung.
Durch die Anwendung von SPT und FCS konnte in dieser Arbeit ein Zeitbereich der Rezeptor- (und G-Protein-) Dynamiken von Mikrosekunden bis Sekunden gefunden und diskutiert werden. Um die selektive Anregung der Plasmamembran zu gewährleisten, wurde die Interne Totalreflexionsfluoreszenzanregung verwendet. Diese eignet sich ideal als Grundlage für die spätere Analyse mittels SPT und FCS, welche komplementär nutzbar sind und mit dem gleichen zellulären Assay und unter Verwendung der gleichen Fluoreszenzmarker betrieben werden können.
Die Studie am Beispiel der α2A- und β2-adrenergen Rezeptoren sowie des Gαi1-Proteins demonstrierte das enorme Potential dieser Einzelmolekültechniken für die Untersuchung von GPCR und skizziert die Komplexität deren Dynamik, wie sie auch durch neueste Modellierungsstudien vorhergesagt wird.
Insulin ist ein essentielles Hormon im menschlichen Körper, welches für die Senkung der Blutglukosekonzentration, die Bildung von Energiespeichern und das Zellwachstum verantwortlich ist. Eine mit der Fehlregulation der Insulinproduktion einhergehenden Krankheit ist der Diabetes mellitus. Für diese Arbeit spielt der Typ 2 dieser Erkrankung eine wichtige Rolle. Es entwickelt sich bei Patienten mit diesem Typ des Diabetes mellitus langsam eine Insulinresistenz, die zunächst durch eine kompensatorische Überproduktion von Insulin charakterisiert ist. Dieser Zustand der Hyperinsulinämie kann Jahre bis Jahrzehnte andauern, ehe es zu einem Versagen der ß-Zellen des Pankreas und somit zu einer Hypoinsulinämie kommt. In dieser Arbeit war es Ziel herauszufinden, ob diese lange Zeit herrschende Hyperinsulinämie einen Einfluss auf die menschliche DNA hat. Die Genotoxizität von hohen Insulinkonzentrationen wurde in Hep-G2 Zellen, HT29 Zellen, sowie primären humanen peripheren Lymphozyten mithilfe des Comet Assays und des Mikrokerntests nachgewiesen. Oxidativer Stress bzw. dessen Reduzierung durch Antioxidantien und Inhibitoren wurde in HT29 Zellen mithilfe der DHE-Färbung detektiert. Diese Arbeit belegt dass sich Insulin schädigend auf das menschliche Genom in vitro auswirken kann. Eine besondere Relevanz haben die durchgeführten Experimente mit primären menschlichen Lymphozyten. Denn bei ihnen handelt es sich um Zellen, die im Gegensatz zu der auch genutzten humanen Leberkarzinomzelllinie Hep-G2 und der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 nicht transformiert sind. Eine weitere wesentliche Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass schon pathophysiologisch vorliegende Insulinkonzentrationen in der Lage sind Genomschädigungen in vitro zu induzieren. HT29 Zellen zeigten bei Kurzzeitbehandlung mit nur 1nM Insulin eine signifikante Erhöhung der DNA-Schädigung. Bei Langzeitexposition von 6 Tagen konnten schon 0,5nM signifikante DNA-Schäden hervorrufen. Diese durch Insulin hervorgerufenen Schäden könnten, falls sie so auch in vivo entstehen, bei Versagen von Reparaturmechanismen zur Entstehung von Mutationen und sich daraus entwickelnden Karzinomen beitragen. Aus diesem Grund war ein weiteres Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob bestimmte Antioxidantien oder Inhibitoren in der Lage sind die Insulin-induzierten Genomschädigungen zu verringern. Hierfür wurde Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 und Wortmannin genutzt. Tatsächlich sind diese Substanzen in der Lage die durch Insulin hervorgerufene Schädigung zu reduzieren. Die positiven Ergebnisse dieser Arbeit könnten einen ersten Hinweis auf eine mögliche pharmakologische Intervention bei Hyperinsulinämie mit dem Ziel der Senkung des erhöhten Krebsrisikos geben. Eine wichtige Erkenntnis aus den Ergebnissen meiner Arbeit ist, dass die Reduzierung des oxidativen Stresses eine Reduzierung der Genomschädigung bewirkt. Die genutzten Substanzen Apocynin, Tempol, VAS2870 und Rotenone bewirkten in HT29 Zellen eine signifikante Reduzierung des durch Insulin ausgelösten oxidativen Stresses. Um aber genauere Aussagen über Möglichkeiten der Therapie bei Hyperinsulinämie zu treffen, sollten Folgestudien auch in vivo folgen, welche die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte bestätigen.
Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen
(2015)
Die von der WHO zu den 17 wichtigsten NTDs gezählte Leishmaniose wird durch intrazelluläre Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen. Der Lebenszyklus der Parasiten besteht aus zwei Phasen. Die länglichen und beweglichen Promastigoten kennzeichnen die Phase in der Sandmücke – der Vektor der Leishmaniose. Hingegen ist die Phase im Säugerwirt durch runde unbewegliche Amastigoten charakterisiert. Aufgrund des Mangels an potenten antileishmanialen Therapien wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen L. m. Parasiten und der Hauptwirtszelle, der Makrophage, v. a. in Hinblick auf autophage Prozesse in den infizierten Makrophagen näher untersucht, um demgemäß neue Erkenntnisse zu gewinnen, welche bei der Herstellung zukünftiger anti-leishmanialer Medikamente helfen könnten.
Bei der Autophagie handelt es sich um einen katabolen Prozess, wodurch Zellen bei Nahrungsmangel oder zellulärem Stress ihre Homöostase erhalten können. Durch diesen Prozess können überflüssige oder beschädigte Organellen recycelt werden, um die Funktionen der Zelle aufrechtzuerhalten. Daneben übernimmt Autophagie auch eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von ins Zytosol eindringenden Pathogenen.
Mittels des neu etablierten totalen Autophagiescore konnte festgestellt werden, dass Autophagie in L. m.-infizierten BMDM induziert wird. Die intrazellulären Amastigoten werden durch Autophagie in den BMDM verdaut. Die erhöhte autophage Aktivität konnte zudem durch Western-Blot-Analysen der autophagierelevanten Proteine ATG5, LC3B und UB bestätigt werden. Die molekulargenetischen Untersuchungen von L. m.-infizier-ten BMDM mithilfe von Affymetrix Microarrays führten zu einem Netzwerk aus autophagierelevanten und infektionsspezifischen Genen, welches als LISA bezeichnet worden ist. Hier hat sich ebenfalls eine starke Verknüpfung von autophagierelevanten Genen und den Genen der Glykolyse, einem zweiten katabolen Prozess, gezeigt. Zudem konnten zwei weitere autophagierelevante und infektionsspezifische Gene außerhalb von LISA identifiziert werden, nämlich Bnip3 und Ctse, welche im Anschluss genauer untersucht worden sind. Bei beiden Genen konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass sie in L. m.-infizierten BMDM signifikant erhöht sind. Durch siRNA-Analysen konnte überdies beobachtet werden, dass beide für die erfolgreiche Elimination der Amastigoten essenziell sind.
Somit konnte mit den Proteinen BNIP3 und CTSE zwei potenzielle neue Ansatzpunkte für mögliche zukünftige antileishmaniale Therapien gefunden werden. Auch die in LISA enthaltenen Gene stellen prinzipiell vielversprechende Ziele für künftige Medikamente gegen Leishmaniose dar. Durch all diese Untersuchungen kommt man dem Ziel einer neuen, gezielten und nebenwirkungsärmeren Behandlung der Leishmaniose einen Schritt näher.
Fragestellung: Die Leberdysfunktion im Rahmen einer systemischen Inflammation stellt einen der wichtigsten Faktoren dar, welcher die Letalität erhöht. Sauerstoffradikale (ROS) sind zytotoxisch und wichtige Mediatoren in der Pathophysiologie der entzündlichen Leberschädigung. Dies war bereits Gegenstand vieler Arbeiten. Kohlenstoffmonoxid (CO), ein Produkt der Katalyse von Häm via Hämoxygenase (HO), wirkt zytoprotektiv gegen entzündliche Prozesse. In der vorliegenden Studie untersuchten wir in der Leber die Wirkungsweise von CO auf das Antioxidans Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD) in einem Tiermodell der systemischen Entzündungsreaktion.
Methodik: Nach Einverständnis der Tierschutzkommission wurden männliche Mäuse (C57/BL6) mit Isoflurane narkotisiert und zur Messung des mittleren arteriellen Blutdruck (MAP) instrumentiert. Ein normotensives SIRS wurde mit Hilfe einer beidseitigen Ischämie der Hinterläufe für 60 Minuten und nachfolgender Reperfusion (I/R) für 3 Stunden induziert. Die Hämoxygenaseaktivität wurde mit Haem induziert und mittels Chromium Mesoporphyrin (CrMP) kompetetiv gehemmt. Ein Teil der Tiere inhalierte CO (250 ppm) nach Beginn der Reperfusion oder erhielt Methylenchlorid (MC, i.p.) zur Induktion der endogenen hepatischen CO Produktion. Die Fettsäurenoxidation (Malondialdehyde, MDA) und die Gewebespiegel für Glutathione (GSH) wurden mittels spezifischen Enzymessays bestimmt. ROS-Bildung konnte mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie und dem Farbstoff Dihydrorhodamine (DHR) quantifiziert werden. Das Lebergewebe wurde in sinusoidale und parenchymale Zellfraktionen aufgetrennt. Die Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD) Aktivität und Proteinmenge wurde in der sinusoidalen und parenchymalen Zellfraktion mittels Western Blot analysiert. Die Karbonylierung ist eine inaktivierende oxidative Proteinmodifikation. Das Ausmaß der Karbonylierung von MnSOD in den Zellfraktionen wurde mittels Immuno-Blot (OxyBlot; Chemicon) untersucht. Die statistische Testung erfolgte mittels Kruskal-Wallis Test, wobei p<0,05 signifikant war.
Ergebnisse: I/R Tiere zeigten signifikant mehr DHR-Fluoreszenz, mehr MDA-Bildung und weniger GSH als Sham Tiere (p<0.02). I/R+CrMP Behandlung hatte signifikant am meisten oxidativen Stress im Vergleich zu allen Behandlungsgruppen zur Folge. Die Inhalation von CO oder die Injektion von MC nach I/R reduzierte die DHR-Fluoreszenz, MDA-Bildung und normalisierte die GSH Spiegel im Vergleich zu I/R Tieren. I/R+CrMP+CO Behandlung zeigte die gleichen Ergebnisse wie I/R+CO Behandlung. Die parenchymale Zellfraktion der Leber zeigte keine Veränderung der MnSOD. In der sinusoidalen Zellfraktion fand sich keine Veränderung der MnSOD Proteinmenge. Jedoch reduzierte sich die sinusoidale MnSOD Aktivität signifikant nach I/R (p<0.02), erholte sich aber nach I/R+CO Behandlung wieder auf Sham Niveau. Die Karbonylierung von MnSOD nach I/R war signifikant erhöht in der sinusoidalen Zellfraktion. Nach I/R+CO konnte eine Reduktion der Karbonylierung von MnSOD auf das Sham Niveau nachgewiesen werden.
Interpretation: CO reduziert signifikant den hepatischen oxidativen Stress in der systemischen Inflammation. CO induziert die Aktivität der MnSOD in den sinusoidalen, nicht jedoch in den parenchymalen Zellen der Leber. Es konnte in der systemischen Entzündungsreaktion gezeigt werden, dass CO die antioxidative Wirkung von MnSOD durch eine Hemmung der Karbonylierung in den sinusoidalen Zellen der Leber induziert. Diese Ergebnisse zeigen erstmals, über die Karbonylierung von MnSOD, einen indirekten antioxidativen Effekt von CO. Welche weiteren Enzymsysteme von CO auf diese Weise beeinflusst werden, müssen weitere Untersuchungen zeigen.
Topological insulators belong to a new quantum state of matter that is currently one of
the most recognized research fields in condensed matter physics. Strained bulk HgTe
and HgTe/HgCdTe quantum well structures are currently one of few topological insulator
material systems suitable to be studied in transport experiments. In addition
HgTe quantum wells provide excellent requirements for the conduction of spintronic
experiments. A fundamental requirement for most experiments, however, is to reliably
pattern these heterostructures into advanced nano-devices. Nano-lithography on this
material system proves to be challenging because of inherent temperature limitations,
its high reactivity with various metals and due to its properties as a topological insulator.
The current work gives an insight into why many established semiconductor
lithography processes cannot be easily transferred to HgTe while providing alternative
solutions. The presented developments include novel ohmic contacts, the prevention
of metal sidewalls and redeposition fences in combination with low temperature
(80 °C) lithography and an adapted hardmask lithography process utilizing a sacrificial
layer. In addition we demonstrate high resolution low energy (2.5 kV) electron beam
lithography and present an alternative airbridge gating technique. The feasibility of
nano-structures on HgTe quantum wells is exemplarily verified in two separate transport
experiments. We are first to realize physically etched quantum point contacts
in HgTe/HgCdTe high mobility 2DEGs and to prove their controllability via external
top-gate electrodes. So far quantum point contacts have not been reported in TI
materials. However, these constrictions are part of many proposals to probe the nature
of the helical quantum spin Hall edge channels and are suggested as injector and
detector devices for spin polarized currents. To confirm their functionality we performed
four-terminal measurements of the point contact conductance as a function of
external gate voltage. Our measurements clearly exhibit quantized conductance steps
in 2e2/h, which is a fundamental characteristic of quantum point contacts. Furthermore
we conducted measurements on the formation and control of collimated electron beams, a key feature to realize an all electrical spin-optic device. In a second study
several of the newly developed lithography techniques were implemented to produce
arrays of nano-wires on inverted and non-inverted HgTe quantum well samples. These
devices were used in order to probe and compare the weak antilocalization (WAL) in
these structures as a function of magnetic field and temperature. Our measurements
reveal that the WAL is almost an order of magnitude larger in inverted samples. This
observation is attributed to the Dirac-like dispersion of the energy bands in HgTe quantum
wells. The described lithography has already been successfully implemented and
adapted in several published studies. All processes have been optimized to guarantee
a minimum effect on the heterostructure’s properties and the sample surface, which is
especially important for probing the topological surface states of strained HgTe bulk
layers. Our developments therefore serve as a base for continuous progress to further
establish HgTe as a topological insulator and give access to new experiments.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der häufigsten Erreger schwerer endovaskulärer Infektionen, die häufig mit einer Dissemination des Erregers in andere Organe und lebensbedrohlichen Komplikationen wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Abszessen assoziiert sind. Entscheidender Schritt in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen ist die Schädigung und Überwindung der Endothelbarriere. Für deren Integrität ist die Intaktheit von Zell-Zell-Verbindungen elementar, diese werden unter anderem durch Src-Kinasen reguliert. Es ist bekannt, dass S. aureus Fibronektin-Bindeproteine (FnBPs) maßgeblich für die Adhärenz und Invasion des Erregers in Endothelzellen sind. Die Invasion erfolgt über eine indirekte Bindung an α5β1-Integrine, invasive Eigenschaften finden sich in nahezu allen klinischen Isolaten. In verschiedenen Tiermodellen konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen der Expression von FnBPs und der Dissemination von S. aureus in andere Organe gezeigt werden. Bislang ist jedoch nicht untersucht, welche Auswirkung die S. aureus-Infektion auf die Endothelbarriere hat und welche Mechanismen für die Translokation des Erregers verantwortlich sind.
In dieser Arbeit wurde analysiert, ob die Infektion mit S. aureus- und S. carnosus-Stämmen in vitro zu einer Schädigung der endothelialen Integrität von EA.hy926-Zellen führt. Hierzu wurden Änderungen der transendothelialen Impedanz und der Endothelpermeabeabilität nach Infektion im xCELLigence- bzw. Transwell-System erfasst. Zytotoxische Effekte wurden durch Kristallviolettfärbungen, immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen der Mitochondrien und Nuklei sowie die Erfassung der hypodiploiden Zellkerne mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Zur Entschlüsselung des molekularen Mechanismus wurden Veränderungen der Adherens und Tight Junction-Proteine ZO-1 und VE-Cadherin in der Immunfluoreszenz untersucht. Die Rolle von Src-Kinasen wurde durch pharmakologische Inhibition analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass FnBP-exprimierende S. aureus-Stämme eine Abnahme der transendothelialen Impedanz verursachen und dass es 4 und 24 Stunden nach Infektion zu einer signifikanten Zunahme der Endothelpermeabilität kommt. Zytotoxische Effekte auf die Endothelzellen durch die Infektion traten nach 24 Stunden auf, jedoch nicht nach 4 Stunden. VE-Cadherin und ZO-1 zeigten 4 Stunden nach Infektion eine FnBP-abhängige Konformationsänderung und Reduktion der Signalintensität. Außerdem konnte demonstriert werden, dass die Inhibition von Src-Kinasen den Anstieg der Endothelpermeabilität signifikant reduziert.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal belegt, dass S. aureus FnBPs eine Erhöhung der Endothelpermeabilität bewirken. Während hierfür zu späten Zeitpunkten Apoptose verantwortlich ist, muss nach 4 Stunden ein anderer Mechanismus ursächlich sein. Da es zu einer Abschwächung der ZO-1- und VE-Cadherin-Signalintensität in der Immunfluoreszenz kam, ist anzunehmen, dass Adherens und Tight Junctions durch die Infektion geschädigt werden. Es ist bekannt, dass Src-Kinasen durch die Infektion mit S. aureus aktiviert werden. Außerdem sind sie elementar für die Regulation der Endothelpermeabilität und vermitteln diesen Effekt unter anderem über eine Phosphorylierung von Adherens und Tight Junction-Proteinen. Eine Src-vermittelte Phosphorylierung von Zell-Zell-Verbindungsproteinen wäre daher eine mögliche Erklärung für die beobachteten Veränderungen von ZO-1 und VE-Cadherin. Dieser Mechanismus könnte Wegbereiter für die parazelluläre Passage über die Endothelbarriere sein. Darüber hinaus könnte die erhöhte Endothelpermeabilität den Zugang zur Extrazellulärematrix und zum größten Pool an Fibronektin und Integrinen ermöglichen und so die Invasion und Transzytose begünstigen. Die hier gewonnenen Ergebnisse tragen dazu bei, die komplexe Interaktion zwischen S. aureus und dem Endothel und somit wichtige Schritte in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen besser zu verstehen und neue Zielstrukturen für therapeutische Interventionen zu identifizieren.
In unserem Alltag kommen wir heute ständig mit Systemen der Informations- und Kommunikationstechnik in Kontakt. Diese bestehen häufig aus mehreren interagierenden und kommunizierenden Komponenten, wie zum Beispiel nebenläufige Software zur effizienten Nutzung von Mehrkernprozessoren oder Sensornetzwerke. Systeme, die aus mehreren interagierenden und kommunizierenden Komponenten bestehen sind häufig komplex und dadurch sehr fehleranfällig. Daher ist es wichtig zuverlässige Methoden, die helfen die korrekte Funktionsweise solcher Systeme sicherzustellen, zu besitzen.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden neue Methoden zur Verbesserung der Verifizierbarkeit von asynchronen nebenläufigen Systemen durch Anwendung der symbolischen Modellprüfung mit binären Entscheidungsdiagrammen (BDDs) entwickelt. Ein asynchrones nebenläufiges System besteht aus mehreren Komponenten, von denen zu einem Zeitpunkt jeweils nur eine Komponente Transitionen ausführen kann. Die Modellprüfung ist eine Technik zur formalen Verifikation, bei der die Gültigkeit einer Menge von zu prüfenden Eigenschaften für eine gegebene Systembeschreibung automatisch durch Softwarewerkzeuge, die Modellprüfer genannt werden, entschieden wird. Das Hauptproblem der symbolischen Modellprüfung ist das Problem der Zustandsraumexplosion und es sind weitere Verbesserungen notwendig, um die symbolische Modellprüfung häufiger erfolgreich durchführen zu können.
Bei der BDD-basierten symbolischen Modellprüfung werden Mengen von Systemzuständen und Mengen von Transitionen jeweils durch BDDs repräsentiert. Zentrale Operationen bei ihr sind die Berechnung von Nachfolger- und Vorgängerzuständen von gegebenen Zustandsmengen, welche Bildberechnungen genannt werden. Um die Gültigkeit von Eigenschaften für eine gegebene Systembeschreibung zu überprüfen, werden wiederholt Bildberechnungen durchgeführt. Daher ist ihre effiziente Berechnung entscheidend für eine geringe Laufzeit und einen niedrigen Speicherbedarf der Modellprüfung. In einer Bildberechnung werden ein BDD zur Repräsentation einer Menge von Transitionen und ein BDD für eine Menge von Zuständen kombiniert, um eine Menge von Nachfolger- oder Vorgängerzuständen zu berechnen. Oft ist auch die Größe von BDDs zur Repräsentation der Transitionsrelation von Systemen entscheidend für die erfolgreiche Anwendbarkeit der Modellprüfung.
In der vorliegenden Arbeit werden neue Datenstrukturen zur Repräsentation der Transitionsrelation von asynchronen nebenläufigen Systemen bei der BDD-basierten symbolischen Modellprüfung vorgestellt. Zusätzlich werden neue Algorithmen zur Durchführung von Bildberechnungen präsentiert. Beides kann zu großen Reduktionen der Laufzeit und des Speicherbedarfs führen. Asynchrone nebenläufige Systeme besitzen häufig Symmetrien. Eine Technik zur Reduktion des Problems der Zustandsraumexplosion ist die Symmetriereduktion. In dieser Arbeit wird ebenfalls ein neuer effizienter Algorithmus zur Symmetriereduktion bei der symbolischen Modellprüfung mit BDDs aufgeführt.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression zweier intestinaler Stammzellmarker, LgR5 und DCAMKL-1, im ösophagealen Adenkarzinom mit und ohne Barrett-Ösophagus in Bezug auf die Stammzellhypothese untersucht.
Die Untersuchungen fanden an chirurgischen Resektaten und an ösophagealen Adenokarzinomzellen der Zelllinie OE-33 statt. Die Gewebeproben waren bei Operationen zur primären Entfernung von Ösophaguskarzinomen gewonnen worden und stammten von Patienten, die keine neoadjuvante antineoplastische Therapie erhalten hatten. Wurde auf den Gewebeschnitten neben dem Karzinomgewebe Barrett-Mukosa identifiziert, wurde das Karzinom als „Adenokarzinom mit Barrett-Epithel“ („EAC mit BE“; n = 41) klassifiziert, anderenfalls als „Adenokarzinom ohne Barrett-Epithel“ („EAC ohne BE“; n = 19). Die Identifikation der Barrett-Mukosa fand mikroskopisch und immunhistologisch (Marker: Cdx2) statt.
Zur Expressionsanalyse führten wir immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen LgR5 und DCAMKL-1 durch. Analysen auf Genebene fanden mittels RT-PCR statt. Es wurden Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen mit LgR5 und dem Proliferationsmarker Ki-67 angefertigt. Die Ergebnisse wurden mit dem Tumorstadium und den 5-Jahres-Überlebensraten korreliert.
Eine LgR5-Expression wurde in 35 der 41 (85 %) Adenokarzinome mit Barrett- Epithel und in 16 der 19 (84%) Adenokarzinome ohne Barrett-Epithel gefunden. Der Anteil der LgR5-positiven Zellen lag bei den Adenokarzinomen mit Barrett Epithel bei 15 %, im angrenzenden Barrett-Epithel bei 32 % und bei den Adenokarzinomen ohne Barrett-Epithel bei 13 %. Karzinome mit und ohne Barrett-Epithel wiesen damit eine nicht signifikant unterschiedliche LgR5- Expression auf. Die Expression im Barrett-Epithel war im Vergleich dazu erhöht. Die Ergebnisse der RT-PCR auf mRNA-Ebene bestätigten die im Vergleich zum Adenokarzinomgewebe höhere LgR5-Expression im Barrett-Epithel (p = 0,0159). Für DCAMKL-1 zeigten sich durchweg negative Färbeergebnisse.
Mittels Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen LgR5 und Ki-67 ließen sich drei Zellpopulationen identifizieren: LgR5-positive, nicht proliferierende Zellen (LgR5+ / Ki-67−), LgR5-negative, proliferierende Zellen (LgR5– / Ki-67+) und wenige proliferierende, LgR5-positive Zellen (LgR5+ / Ki-67+). Bei der kleinen Subpopulation LgR5-positiver, proliferierender Zellen könnte es sich um Krebsstammzellen handeln. Die proliferierenden, LgR5- negativen Zellen können eher mit dem Modell der klonalen Selektion erklärt werden. Unsere Ergebnisse scheinen daher gut zu dem aktuellen Verständnis der Pathogenese des ösophagealen Adenokarzinoms zu passen, wobei das Modell der klonalen Selektion mit der Hypothese der Krebsstammzellen kombiniert wird. Eine höhere LgR5-Expression war in der univariaten Analyse mit einem schlechteren Überleben assoziiert. Patienten mit einem hohen Prozentsatz an LgR5-positiven Zellen wiesen eine schlechtere Prognose auf verglichen mit Patienten mit einem niedrigeren Prozentsatz LgR5-positiver Zellen. Dieser Zusammenhang gilt für Zellen sowohl im Karzinomgewebe als auch im Barrett-Epithel.
Wir haben gezeigt, dass der intestinale Stammzellmarker LgR5 – im Gegensatz zu DCAMKL-1 – im ösophagealen Adenokarzinom exprimiert wird. Die Expression scheint unabhängig vom Vorhandensein einer Barrett-Mukosa zu sein. Möglicherweise ist eine höhere Expression mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Unsere Ergebnisse sind mit einem Modell für die Pathogenese des ösophagealen Adenokarzinoms vereinbar, das auf Krebsstammzellen basiert. LgR5 könnte dabei helfen, diese zu identifizieren. Das Aufzeigen neuer Ansatzpunkte für zielgerichtete Therapien könnte dabei helfen, neue wirksame Methoden zur Behandlung des ösophagealen Adenokarzioms zu entwickeln.
Effect of cytokine inhibition on peripheral memory B cells in patients with Rheumatoid arthtritis
(2015)
Objective: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, systemic, inflammatory autoimmune disease. Enhanced B cell activity has been proposed in the pathogenesis of RA along with different pro-inflammatory cytokines such as interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α), critically involved in chronic inflammation. Biological agents targeting these cytokines IL-6 and TNF-α have considerably advanced treatment of autoimmunity. Enhanced B cell activity, particularly memory B cells gained particularly interest in evaluating response during therapies from biologics. Human peripheral memory B cells can be distinguished by the phenotypic expression of CD27 and IgD defining three major B cell subpopulations: CD27+IgD+ pre-switch, CD27+IgD- post-switch and CD27-IgD- double negative (DN) memory B cells. Therefore, we analyzed different memory populations during cytokine inhibition by using tocilizumab (anti-IL-6R, TCZ) and adalimumab (anti-TNF-α, ADA), with focus on DN B cells Suspended. DN B cells lacking the conventional memory marker CD27, but due to their mutational Ig repertoire (IgR) considered in the memory compartment. However, only scare data are available for this DN subpopulation in RA.
Methods: Phenotype analysis of activation markers (CD95 and ki-67) of B cell and their subsets were compared in RA patients (median age ~56 years) and in HD. DN memory B cells were phenotypically analyzed from RA patients during IL-6R or TNF-α inhibition at baseline week 12, week 24 and 1 year. Single B cell PCR approach was used to study Ig- receptors VH genes and isotype specific genes. Nonparametric Wilcoxon matched pair test and Mann-Whitney U test was used for statistical analysis by using GraphPadPrism 5. Univariate logistic regression was used to calculate odd ratios and correlation using Pearson r using SPSS statistics 22.
Results: Surface and intracellular staining of B cells showed a significantly higher percentage of CD95 and ki-67 expressions in RA, which was highest in post-switch memory B cells followed by pre-switch and DN memory B cells. During cytokines (IL-6R & TNF-α) inhibition, both CD95 and ki-67 expression were significantly reduced at week 12 and 24 along with reduction in their clinical parameters like DAS28, CRP, ESR. Furthermore, the phenotypic analysis in 107 RA patients and 49 healthy donors (HD) showed a significantly expanded population of DN B cells in RA which contain a heterogeneous mixture of IgA, IgG and IgM expressing cells with a clear dominance of IgG+ cells. Pre-therapy analysis of rearranged IgR sequences from patients (n=9) revealed that DN B cells carry rearranged heavy chain gene sequences with a diversified mutational pattern consistent with memory B cells. In contrast to tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) inhibition, a significant reduction in mutational frequency of BCR gene rearrangements at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001) was observed by in vivo IL-6R inhibition. These changes were observed for all BCR isotypes IgG, IgA and IgM at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001). IgA-RF, IgA serum level and IgA+ DN B cells decreased significantly (p < 0.05) at week 12 and week 24 during TCZ. Patients with a good European league against rheumatism (EULAR) response to TCZ had less DN B cells at baseline as compared to moderate responders (p = 0.006). Univariate logistic regression analysis revealed that the frequency of DN B cells at baseline is inversely correlated to a subsequent good EULAR response (p = 0.024) with an odds ratio of 1.48 (95% confidence interval as 1.05-2.06).
Conclusion: Both anti-TNF-α and anti-IL-6R could reduce higher B cell activity and improve disease activity tremendously in RA patients. The heterogeneous DN B cell compartment is expanded in RA and dominated by IgG isotype. TCZ can modulate the mutational status of DN Ig isotype receptors over 1 year. Interestingly, the frequency of DN B cells in RA may serve as a baseline predictor of subsequent EULAR response to TCZ.
This dissertation deals with the contract choice of upstream suppliers as well as the consequences on competition and efficiency in a dynamic setting with inter-temporal externalities.
The introduction explains the motivation of the analysis and the comparison of different contract types, as for example standard contracts like simple two-part tariffs and additional specifications as contracts referencing the quantity of the contract-offering firm or the relative purchase level. The features of specific market structures should be considered in the analysis of specific vertical agreements and their policy implications. In particular, the role of dynamic changes regarding demand and cost parameters may have an influence on the results observed.
In the first model, a dominant upstream supplier and a non-strategic rival sell their products to a single downstream firm. The rival supplier faces learning effects which decrease the rival’s costs with respect to its previous sales. Therefore, learning effects represent a dynamic competitive threat to the dominant supplier. In this setup, the dominant supplier can react on inter-temporal externalities by specifying its contract to the downstream firm. The model shows that by offering market-share discounts, instead of simple two-part tariffs or quantity discounts, the dominant supplier maximizes long-run profits, and restricts the efficiency gains of its rival. If demand is linear, the market-share discount lowers consumer surplus and welfare.
The second model analyzes the strategic use of bilateral contracts in a sequential bargaining game. A dominant upstream supplier and its rival sequentially negotiate with a single downstream firm. The contract choice of the dominant supplier as well as the rival supplier’s reaction are investigated. In a single-period sequential contracting game, menus of simple two-part tariffs achieve the industry profit maximizing outcome. In a dynamic setting where the suppliers sequentially negotiate in each period, the dominant supplier uses additional contractual terms that condition on the rival’s quantity. Due to the first-mover advantage of the first supplier, the rival supplier is restricted in its contract choice. The consequences of the dominant supplier’s contract choice depend on bargaining power. In particular, market-share contracts can be efficiency enhancing and welfare-improving whenever the second supplier has a relatively high bargaining position vis-`a-vis the downstream firm. For a relatively low bargaining position of the rival supplier, the result is similar to the one determined in the first model. We show that results depend on the considered negotiating structure.
The third model studies the contract choice of two upstream competitors that simultaneously deal with a common buyer. In a complete information setting where both suppliers get to know whether further negotiations fail or succeed, a singleperiod model solves for the industry-profit maximizing outcome as long as contractual terms define at least a wholesale price and a fixed fee. In contrast, this collusive outcome cannot be achieved in a two-period model with inter-temporal externalities.
We characterize the possible market scenarios, their outcomes and consequences on competition and efficiency. Our results demonstrate that in case a rival supplier is restricted in its contract choice, the contract specification of a dominant supplier can partially exclude the competitor. Whenever equally efficient suppliers can both strategically choose contract specifications, the rivals defend their market shares by adapting appropriate contractual conditions.
The final chapter provides an overview of the main findings and presents some concluding remarks.
Bei der Behandlung solider Tumoren spielen systemisch verabreichte Chemotherapeutika eine wich- tige Rolle. Allerdings akkumulieren diese Therapeutika besser in normalem Gewebe als in Tumoren. Als Ursache für diesen unzureichenden Transport von Medikamenten in den Tumor wurde bisher vor allem die dysfunktionale Tumorvaskulatur diskutiert. Diese befindet sich in einem chaotischen und unreifen Zustand ohne ausreichende Bedeckung der Gefäße mit stabilisierenden Perizyten. Aus dem Zustand der Vaskulatur resultierend erreichen Medikamente den Tumor nur in geringem Ausmaß und werden dort heterogen verteilt. Als Grund für den Zustand der Vaskulatur wur- de ein großer Überschuss an pro-angiogenetischen Faktoren im Tumor ausgemacht. Durch eine anti-angiogenetische Behandlung konnte in präklinischen Modellen für einen gewissen Zeitraum die Tumorvaskulatur „normalisiert“ werden. Dies zeichnete sich vor allem durch Veränderung von zwei wichtigen Parametern für die Medikamenteneinbringung aus: zum Einen kommt es zu einer Reduktion der Gefäßdichte. Zum Anderen zu einer Reifung der Blutgefäße. In einem Teil von Pati- enten scheint dabei der Effekt der Gefäßverbesserung zu überwiegen und es kann eine verbesserte Perfusion detektiert werden. Mutmaßlich führt dies auch zu einer verbesserten Einbringung von Therapeutika in den Tumor und so zu einer erhöhten Effizienz der Therapie. In einem weiteren Teil der Patienten scheint jedoch der Effekt der Gefäßreduktion zu überwiegen und die detektierte Perfusion im Tumor wird durch die Behandlung verringert.
Das in dieser Arbeit verwendete MT6-Fibrosarkom-Modell reagierte auf eine anti-angiogenetische Therapie nicht mit einer sonst in murinen Modellen beobachteten Wachstumsreduktion. Die- se ermöglichte eine so bisher nicht mögliche Untersuchung der sekundären Effekte einer anti- angiogenetischen Therapie wie die Medikamenteneinbringung in den Tumor. Die Vaskulatur in MT6-Tumoren zeigte dabei nach einer anti-angiogenetischen Vorbehandlung, die erwarteten Merk-male einer „normalisierten“ Vaskulatur wie eine Reduktion der Gefäßdichte bei gleichzeitiger Rei- fung der verbleibenden Gefäße. Dies führte jedoch nicht zu einer verbesserten Effizienz einer subsequenten Chemotherapie. Durch Vergleich mit einem weiteren Tumor-Modell, dem 4T1-Modell für ein metastasierendes Mammakarzinom, konnten signifikante Unterschiede im Gefäßbild beider Modelle ausgeschlossen werden. Durch mikroskopische Methoden konnte dabei beobachtet werden, dass die Diffusion von Medikamenten aus den Blutgefäßen des MT6-Modells im Vergleich zum 4T1-Modell verringert war. Weitere Untersuchungen deuten auf eine Differenz in der Qualität der extrazellulären Matrix der verwendeten Tumor-Modelle. Durch mRNA-Expressionsanalysen konnte die Enzymfamilie der Lysyloxidasen als mögliche Ursache für diesen Diffusionsunterschied identi- fiziert werden. Lysyloxidasen katalysieren vor allem die Quervernetzung von Proteinen der Extra- zellulärmatrix. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Quervernetzung von Matrixproteinen durch Lysyloxidasen ursächlich für die Diffusions-Inhibierung kleiner Moleküle wie das Chemo- therapeutikum Doxorubicin sein kann. Durch spezifische Inhibition der Lysyloxidasen mittels des Inhibitors βAPN konnte diese Diffusions-Inhibition sowohl in vitro als auch im MT6-Tumor-Modell nahezu vollständig verhindert werden. Die hohe Aktivität von Lysyloxidasen im MT6-Modell stell- te allerdings kein Alleinstellungsmerkmal dieses Modells dar. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Lysyloxidasen in einer Vielzahl von murinen und humanen Tumorzelllinien überexprimiert wird. Die Inhibition von Lysyloxidasen durch βAPN konnte dabei in allen unter- suchten Modellen die Einbringung von Medikamenten in den Tumor erhöhen und könnte so eine sinnvolle adjuvante Maßnahme zur Verbesserung bestehender Chemotherapien darstellen.
Postoperative Frühkomplikationen haben weitreichende Konsequenzen für die Morbidität und Mortalität des operierten Patienten. Im Klinikalltag treten bei vermehrten Komplikationen und verlängerten Intensivstations- und Krankenhausaufenthaltszeiten organisatorische Probleme in den Vordergrund. Nicht zuletzt führen vermehrte Komplikationen zu steigenden Kosten.
Diese Studie hat 70 Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 67 Jahren betreut. Hiervon erhielten 48 Patienten ein Herzbyassoperation, 16 eine Aortenklappenoperation und 6 Patienten eine Mitralklappenoperation. 42 Patienten wurden mit Herzlungenmaschine operiert. Es erfolgten prä- und postoperative Blutentnahmen zur Untersuchung kardialer Biomarker. Hierbei stand der kardiale Biomarker heart–fatty acid binding protein (H-FABP) im Vordergrund und wurde mittels eines ELISA Verfahrens detektiert.
Die Hypothese war, dass H-FABP als kardiospezifischer Biomarker mit einer frühzeitigen Freisetzungskinetik nach myokardialen Schädigungen als präoperativer Biomarker für postoperative Komplikationen, insbesondere für das Acute Kidney Injury, nach kardiochirurgischen Eingriffen dienen kann. Bisher existierten hierzu keine Daten.
Dies ist die erste Studie die nachweisen konnte, dass das präoperative H-FABP als prädiktiver Faktor für das Acute Kidney Injury, den Serumkreatininkriterien der Acute Kidney Injury Network und der KDIGO entsprechend, gilt. Des Weiteren bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem präoperativen H-FABP und der postoperativen Intensivstations- und Krankenhausaufenthaltsdauer.
This investigation deals with the history of the reception of phenomenological philosophy in cognitive science and how this reception has altered and continues to shape the traditional view of cognition inspired by the computer metaphor of mind. The claim will be espoused that cognitive science is not devoid of a philosophical perspective and cognitivism will be characterized precisely as the philosophy behind much work in cognitive science. In conclusion, the irreducibility of philosophical questioning to cognitive science will be defended and reasons will be given as to why it matters to mount such defense.
Die bipolare Störung ist eine psychische Erkrankung, die sich durch wiederkehrende depressive und (hypo-) manische Phasen auszeichnet. Neben Stimmungsschwankungen leiden viele Patienten unter kognitiven Beeinträchtigungen, die nicht nur während akuter Episoden, sondern auch in der Remission, d.h. in euthymer Stimmungslage persistieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit den klinischen Korrelaten von kognitiven Defiziten und der Effektivität eines kognitiven Trainings bei bipolaren Patienten (BP). In der ersten Teilstudie wurde untersucht, wie sich die kognitive Leistung der Patienten von der akuten Phase bis zur Remission verändert. Dazu wurden 55 akut depressive und (hypo-) manische BP und 55 gesunde Kontrollpersonen wiederholt mit einer neuropsychologischen Testbatterie untersucht. 29 Patienten konnten nach mindestens 3-monatiger Remission erneut getestet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die akut kranken BP domänenübergreifend kognitive Störungen im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufweisen, wobei die depressiven Patienten eher in der Verarbeitungsgeschwindigkeit, der Aufmerksamkeit und dem Gedächtnis beeinträchtigt waren. Die akut manischen Patienten hatten hingegen auffällige Defizite in den exekutiven Funktionen. Die Performanz der BP besserte sich zwar in der Remission, es waren aber weiterhin im Vergleich zu den Kontrollen Defizite in der psychomotorischen Geschwindigkeit, dem Arbeitsgedächtnis und dem verbalen Gedächtnis festzustellen. Es zeigte sich außerdem, dass die Verarbeitungsgeschwindigkeit, die Aufmerksamkeit und das verbale Gedächtnis in Zusammenhang mit subdepressiven Symptomen und Schlafstörungen standen, wohingegen die exekutiven Testmaße nicht mit diesen „State“-Faktoren assoziiert waren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die exekutiven Funktionen als Trait-Merkmale der bipolaren Störung in Frage kommen, wohingegen Aufmerksamkeit und Gedächtnis durch das Vorliegen von Residualsymptomen beeinträchtigt sind.
Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, eine kognitive Defizit- vs. Nondefizit Subgruppe innerhalb der BP zu identifizieren, um herauszufinden welche soziodemographischen oder krankheitsrelevanten Charakteristika mit kognitiven Störungen in Zusammenhang stehen. Dazu wurde die neuropsychologische Testleistung von 79 euthymen BP und 70 gesunden Kontrollen verglichen. Es zeigte sich erwartungsgemäß, dass die BP in der psychomotorischen Geschwindigkeit, der Aufmerksamkeit, dem Arbeitsgedächtnis, dem verbalen Gedächtnis, der Wortflüssigkeit und dem problemlösenden Denken trotz stabiler Remission signifikant schlechtere Leistungen erbrachten als die gesunden Kontrollen. Im Anschluss wurde die bipolare Stichprobe anhand ihrer Testleistung in eine Defizit- und eine Nondefizit Gruppe aufgeteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass 54% der BP in allen Tests eine völlig normgerechte Leistung erbrachten. Die Studie bestätigte demnach, dass nicht alle Patienten kognitive Defizite aufweisen, sondern Subgruppen bestehen, die sich in verschiedenen Variablen voneinander unterscheiden: Die Defizit-Subgruppe berichtete signifikant mehr subdepressive Symptome und es lagen häufiger persistierenden Schlafstörungen und die Diagnose einer komorbiden Erkrankung vor (Angststörung, ADHS und Migräne). Zudem zeigte sich ein Zusammenhang zwischen Polypharmazie und kognitiven Defiziten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass ein Teil der kognitiven Störungen bei BP durch eine nicht vollständige Remission und sekundäre Symptome bedingt sind. Es ergab sich keine Assoziation zwischen kognitiver Leistung und krankheitsrelevanten Variablen, wie z.B. Anzahl der Phasen, Bipolar-Subtyp oder Ersterkrankungsalter. Diese Daten widersprechen zwar nicht der Hypothese, dass kognitive Störungen durch neurodegenerative Prozesse bedingt sind, sie weisen jedoch darauf hin, dass bei der bipolaren Störung häufig Residualsymptome vorliegen, welche im Rahmen von Studie als auch bei der therapeutischen Arbeit stärker als bisher berücksichtigt werden müssen.
In beiden Teilstudien zeigte sich zudem, dass kognitive Störungen mit einem reduzierten psychosozialen Funktionsniveaus in Verbindung stehen. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit bisherigen Untersuchungen, die berichten, dass Patienten mit kognitiven Defiziten soziale und berufliche Einschränkungen aufweisen, die wiederum mit einem schlechteren Krankheitsverlauf assoziiert ist. Aufgrund dessen wurde von einigen Autoren vorgeschlagen, mit Hilfe spezieller Interventionen wie der kognitiven Remediation (KR) die geistigen Funktionen zu rehabilitieren. In der vorliegenden Interventionsstudie wurde deshalb der Frage nachgegangen, ob die neurokognitive Leistungsfähigkeit und das psychosoziale Funktionsniveau der bipolaren Stichprobe durch KR verbessert werden kann. Zudem sollte untersucht werden, inwiefern kognitives Training zu Veränderungen der präfrontalen Hirnaktivität führt. Dafür wurde vor und nach dem Training eine Messung mit der Methode der funktionellen Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) durchgeführt. Das 3-monatige KR-Programm bestand aus einem computerisierten kognitiven Training und der Vermittlung von kognitiven Skills im Rahmen von 12-wöchentlichen Gruppensitzungen. Im Anschluss an das Training wurden die Teilnehmer (26 bipolare und als Vergleichsgruppe 13 unipolare Patienten) im Rahmen einer Post-Messung wiederholt untersucht. Zudem wurde zum Vergleich eine Kontrollgruppe von 10 BP im Abstand von 3 Monaten untersucht, die keine Intervention, sondern die Standardbehandlung erhielt. Aufgrund zahlreicher Drop-Outs konnten am Ende des Erhebungszeitraums die Daten von 16 bipolaren und 10 unipolar depressiven Patienten ausgewertet werden. Die Trainingsteilnehmer erbrachten im Gegensatz zu der Kontrollgruppe signifikante Leistungssteigerungen in den Tests zur Erfassung der psychomotorischen Geschwindigkeit, dem Arbeitsgedächtnisses, dem verbalen Gedächtnis und dem problemlösenden Denken. Zudem zeigte sich nach dem Training eine Verbesserung des psychosozialen Funktionsniveaus und eine Reduktion der subdepressiven Symptomatik. Eine Veränderung der präfrontalen Hirnaktivierung konnte jedoch nicht verifiziert werden. Die Ergebnisse lassen demnach schlussfolgern, dass Patienten mit affektiven Störungen von einem kognitiven Training profitieren, wobei die damit einhergehenden funktionalen Veränderungen der Hirnaktivität in Studien mit größeren Stichproben untersucht werden müssen.
Die periprothetische Infektion nach endoprothetischen Operationen in der Orthopädie ist eine dramatische Komplikation, die nicht nur die Gesundheit des Patienten in hohem Maße kompromitiert und gefährdet, sondern auch in ökonomischer Hinsicht ein enormes Problem darstellt.
Zahlreiche prophylaktische Maßnahmen, wie z.B. aseptische Techniken, präoperative Hautantiseptik und perioperative Antibiotikaprophylaxe tragen zur postoperativen Infektionsreduktion bei. Die Infektionsraten bewegen sich aber weiterhin zwischen 0,3% und 4,97%, je nach Implantatlokalisation. Hinzu kommt das Auftreten multiresistenter Erreger, die eine erfolgreiche Behandlung mit Antibiotika stark erschweren oder sogar unmöglich machen. Weltweit
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zeichnet sich ein drastischer Anstieg von resistenten Erregern ab, die in Zukunft bisher wirksame Antibiotika womöglich gänzlich nutzlos werden lassen könnten.
In Hinsicht auf amerikanische Studien, die den Bedarf an orthopädischer Endoprothetik hochgerechnet haben, ist bis 2030 allein in den USA eine nahezu Versiebenfachung von totaler Knieendoprothetik zu erwarten. Dies würde die Infektionsproblematik enorm verschärfen, wenn bis dahin keine neuen, wirksameren Prophylaxemaßnahmen zum Einsatz kämen.
Es ist dringend notwendig alternative Substanzen zu erforschen, die vor allem bei aseptischen Operationen gute Wirksamkeit und Verträglichkeit vereinen, ohne Resistenzen zu fördern und somit postoperative Infektionen weiter zu senken oder zu verhindern. Studien mit Antiseptika, wie PVP-Iod, konnten bereits positive Ergebnisse liefern, die ein Lichtblick in der vorliegenden Problematik darstellen. Der Mangel an relevanten, hochwertigen Studien auf diesem Themengebiet lassen eine allgemeingültige klinische Empfehlung allerdings nur mit Vorsicht zu. Die intraoperative Wundspülung mit PVP-Iod als 0,35%ige Lösung und anschließendem Nachspülen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung, kann zumindest bei Wirbelsäulenoperationen mit Instrumentierung als sinnvolle Infektionsprophylaxe angesehen werden. Die Resultate dieser Übersichtsarbeit rechtfertigen zudem weitere hochwertige Studien mit PVP-Iod, die nötig sind, um die bisherigen positiven Ergebnisse zu verifizieren und die letztendlich zu einer medizinischen Evidenz für endoprothetische Operationen in der Orthopädie führen könnten. Aber auch alternative Antiseptika sollten weiter erforscht werden, um bei speziellen Problematiken auf möglichst viele Alternativen zurückgreifen zu können.
In dieser Arbeit konnten 69 neue und neuartige Koordinationspolymere sowie Komplexe mit schwefelhaltigen Liganden auf Selten-Erd-Chlorid-Basis synthetisiert und strukturell charak-terisiert werden.
Durch die Umsetzung der Chloride mit dem Liganden Thiazol konnten bei Raumtemperatur, abhängig vom Ionenradius und der eingesetzten Menge Thiazol, sowohl Koordinationspolymere wie 1∞[LnCl3(thz)6]·thz (Ln = La, Ce), dimere Komplexe [Ln2Cl6(thz)8]·3(thz) (Ln = La, Ce, Pr, Nd), [Pr2Cl6(thz)8] sowie monomere Komplexe [LnCl3(thz)4]2·thz (Ln = Sm , Eu , Tb, Ho) erhalten werden. Mittels temperaturabhängiger Pulverdiffraktometrie und in-situ Infra-rotspektroskopie sowie DTA/TG-Messungen konnte exemplarisch an 1∞[LaCl3(thz)6]·thz und [Pr2Cl6(thz)8] gezeigt werden, dass stufenweise thermisch bedingt Thiazolmoleküle aus den Strukturen abgegeben werden bis hin zur Rückbildung des eingesetzten LnCl3. Unter der Vo-raussetzung, dass die flüchtige Komponente Thiazol resorbiert wird, ist daher ein Kreispro-zess denkbar. Ferner konnten zusätzlich wasserhaltige Phasen wie der vierkernige Cluster [Pr4Cl10(OH)2(thz)8(H2O)2] erhalten werden.
Durch die Zugabe eines geeigneten Linkermoleküls in das Reaktionssystem aus trivalenten Lanthanidchloriden und Thiazol konnten unter solvothermalen Bedingungen eine Vielzahl an Koordinationspolymeren und Komplexen erhalten werden. Als Linker oder als end-on Ligan-den eigneten sich sowohl eine Reihe an ditopischer Pyridylliganden 4,4'-Biypridin (bipy), 1,2-Di-(4-pyridyl)ethen (dpe), trans-1-(2-Pyridyl)-2-(4-pyridyl)ethylen (tppe), 1,2-Di-(4-pyridyl)ethan (dpa), sowie die Diazine Pyrazin (pyz) und Pyrimidin (pym) oder auch Azole wie 1,2,4-Triazol (tzH) und Pyrazol (pzH). Mittels Einkristallstrukturanalyse und pulverdiffrakto-metrischer Methoden konnten die dreidimensionalen Gerüstverbindungen 3∞[LnCl3(dpa)2]·thz (Ln = Ce - Sm, Gd - Lu), die Schichtstrukturen 2∞[Ln2Cl6(bipy)3(thz)2]·thz (Ln = La, Ce), 2∞[LnCl3(tzH)2(thz)]·thz (Ln = Pr, Sm - Gd) und die strangartigen Koordinationspolymere 1∞[LnCl3(bipy)(thz)2]·thz (Ln = Pr, Nd), 1∞[LnCl3(bipy)(thz)2]·thz (Ln = Sm, Eu - Er, Yb), 1∞[Ln2Cl6(dpe)2(thz)4]·dpe (Ln = Ce, Nd), 1∞[LnCl3(dpe)(thz)2]· 0.5 (dpe) 0.5 (thz) (Ln = Sm, Gd - Dy, Er, Yb), 1∞[HoCl3(dpe)(thz)2]·thz, 1∞[La2Cl6(dpa)(thz)6], 1∞[Pr2Cl6(pyz) (thz)6], 1∞[Ln2Cl6(tzH)4(thz)2] (Ln = Pr, Sm, Gd) sowie die Komplexe [LnCl3(tppe)2(thz)2] (Ln = Nd, Tb, Ho, Er), [Ln2Cl6(pyz)(thz)6]·2(thz) (Ln = Tb, Er), [Ln2Cl6(pym)2(thz)4] (Ln = Tb , Er), [LnCl3(pzH)3(thz)2] (Ln = Pr, Gd) charakterisiert werden.
Ferner konnten die erhaltenen Verbindungen weitestgehend auf ihre photolumineszenz-spektroskopischen sowie thermischen Eigenschaften hin untersucht werden. Außerdem konn-ten auch durch direkte Schwefelkoordination an die Ln3+-Zentren eindimensionale Koordina-tionspolymere 1∞[PrCl2(amt)(py)3] (amt- = 3-Amino-5-mercapto-1,2,4-triazolat), [HNEt3]1∞[LnCl2(amt)2] (Ln = Ho, Er) und Komplexe [LnCl2(Mbim)(py)3]·py (Ln = Y, Er; Mbim = 2-Mercaptobenzimdiazolat) generiert werden
Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard für molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren ermöglichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer kürzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer größerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und führten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsansätzen in neuen Dimensionen.
In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik Würzburg durchgeführt wurde, wurden in fünf Projekten NGS-Ansätze unterschiedlicher Stufen bzw. Größenordnungen für verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Veröffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut.
In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet.
In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen identifiziert. Um mögliche weitere Mutationsträger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz für das zügige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten die Kausalität der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver Hörstörung.
Ein geeigneter NGS-Ansatz für die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior führte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden führte.
Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels für Muskelkrankheiten. Ein Panel für drei Gene für Gliedergürteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik übernommen. Mit dem zweiten Panel für acht Kandidatengene myofibrillärer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert.
Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang für Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente bestätigten die Kausalität der Mutation im Myotilin-Gen.
In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei Hämophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verdächtige Variante identifiziert werden, die zu verändertem Spleißverhalten führen könnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalität bestätigen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verfügung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexität der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Größe der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden können. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ansätze zur Anreicherung der Zielsequenzen für die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdrängt worden. Von den ursprünglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis“ (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den während dieser Arbeit erhobenen Daten wider.
1) Modern European agricultural landscapes form a patchy mosaic of highly fragmented natural and semi-natural habitat remnants embedded in a matrix of intensively managed agricultural land. In those landscapes many organism frequently cross habitat borders including the crop – non-crop boundary, hereby connecting the biotic interactions of multiple habitat types. Therefore biodiversity and ecosystem functions within habitats are expected to depend on adjacent habitat types and the surrounding landscape matrix. In this thesis the biodiversity of non-crop habitats, and ecosystem services and disservices in crop habitats were studied in the human-dominated agricultural landscape in the district Lower Franconia, Bavaria, Germany. First we examined the effect of adjacent habitat type on species composition, diversity and ecosystem functions in semi-natural calcareous grasslands, a biodiversity-rich habitat of high conservation value (chapter 2 and 3). Second we studied the effect of habitat composition in the landscape on herbivory, biological pest control and yield in oilseed rape fields (chapter 4).
2) We examined the effect of adjacent habitat type on the diversity of carabid beetles in 20 calcareous grasslands using pitfall traps. Half of the grasslands were adjacent to a coniferous forest and half to a cereal crop field. We found different species compositions of carabid beetles depending on adjacent habitat type. In addition calcareous grasslands adjacent to crop fields harboured a higher species richness and activity density but a lower evenness of carabid beetles than calcareous grasslands adjacent to forests. These differences can be explained by the spillover of carabid beetles from the adjacent habitats. After crop harvest carabid beetle activity density in crop fields decreased while in parallel the activity density in the calcareous grasslands adjacent to the crop fields increased, indicating an unidirectional carabid beetle spillover. Our results underline that type and management of adjacent habitats affect community composition and diversity in calcareous grasslands. Therefore nature conservation measures, which focused on the improvement of local habitat quality so far, additionally need to consider adjacent habitat type.
3) In addition to carabid beetle communities we also surveyed predation rates of ground-dwelling predators on the same calcareous grasslands in two study periods (June and late August). As ground-dwelling predators of forests or crop fields can move into adjacent calcareous grasslands we expected different predation rates depending on adjacent habitat type. We exposed in total 32.000 lady bird eggs as prey items on the calcareous grasslands in distances of 5 and 20m from the habitat border. We found higher predation rates on calcareous grasslands adjacent to forests than on calcareous grasslands adjacent to crop fields, but only on cool days. On warm days a very high extent (often 100%) of the exposed prey items were consumed adjacent to both habitat types, which did not allow the detection of possible differences between the adjacent habitat types. Predation rates differed not between the two study periods or the two distances to the habitat edge. The higher predation rates adjacent to forests can be explained by the spillover of ground-dwelling predators from forests into calcareous grasslands. Our results show, that spillover into semi-natural habitats affects ecosystem functioning in addition to species composition and diversity.
4) In chapter 4 of this thesis we examined the effect of spatiotemporal changes in crop cover on pest - natural enemy interactions and crop yields. During two study years we surveyed the abundance of adult and larval pollen beetles, parasitism of pollen beetle larvae by a hymenopteran parasitoid and oilseed rape yields of 36 oilseed rape fields. The surrounding landscape of the fields (1 km radius) differed in the oilseed rape proportion and in the inter-annual change in the oilseed rape proportion since the previous year. We found a dilution effect, i.e. a decreasing abundance with increasing oilseed rape proportions, for pollen beetle larvae and parasitoids in both study years and for adult pollen beetles in one study year. Oilseed rape yields increased with increasing oilseed rape proportions. Inter-annual changes in oilseed rape proportions led to inter-annual crowding and dilution effects for pollen beetles, but had no effect on parasitism or yield. Our results indicate the potential to reduce pest loads and increase yields in intensively managed oilseed rape fields by a coordinated management of the spatiotemporal oilseed rape cover in the landscape.
5) In summary, we showed in this thesis that the biodiversity and functioning of crop and non-crop habitats within agricultural landscapes is affected by the spillover of organisms and thus by the habitat composition in the close surrounding and in the broader landscape context. Spillover affects also ecosystem services and disservices and therefore crop productivity. Thereby the spatial and temporal variation of specific crop types in the landscape can be of particular importance for crop yields. Thus a coordinated landscape wide management can help to optimize both biodiversity conservation and the delivery of ecosystem services and thus crop yields. Future studies integrating landscape effects across several ecosystem functions, multiple taxonomic groups and different crop types are necessary to develop definite landscape management schemes.
Behandlungsergebnisse der konservativen Therapie ausgedehnter knöcherner Brustwandverletzungen
(2015)
Zielsetzung: Der klinische Stellenwert der operativen Stabilisierung komplexer
knöcherner Brustwandverletzungen – insbesondere bei Mehrfachverletzten ‐ ist
weiterhin unklar. Studienergebnisse aus anderen Gesundheitssystemen weisen einen
Vorteil der Rippenosteosynthese gegenüber konservativen Therapieansätzen aus. Die
Übertragung dieser Ergebnisse auf die deutsche Versorgungssituation ist jedoch
problematisch.
Methode: Retrospektive Analyse aller Patienten, die im Zeitraum von 2011 bis 2013 in
einem überregionalen Traumazentrum der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie
mit einem schweren Thoraxtrauma behandelt wurden. Einschlusskriterium in diese
Analyse war der Nachweis einer ein‐ oder beidseitigen Rippenserienfraktur in dem bei
Patientenaufnahme durchgeführten Trauma CT. Die thorakalen Begleitverletzungen und
die Ergebnisse der Therapie wurden erfasst.
Ergebnis: Im Untersuchungszeitraum wurden in dem Studienzentrum 2801
Polytraumata versorgt. Von diesen hatten 251 Patienten eine ein‐ oder beidseitge
Rippenserienfraktur (links=111; rechts=87; beidseits=45). Traumaursachen waren
Stürze (37,9%), PKW‐ (32,9%) und Motorradunfälle (14,4%). Die Verletzungen wurden
bei 243 Patienten konservativ versorgt. 110 Patienten (45,3%) erhielten wegen
thorakaler Begleitverletzungen eine Thoraxdrainage. 119 Patienten wurden beatmet.
Die durchschnittliche Beatmungsdauer, Intensiv‐ und Krankenhausaufenthaltsdauern
waren 118,1 Stunden und 7,4 bzw. 15,4 Tage. Die Krankenhaus‐Mortalität war 13,2%.
Patienten mit isolierten Thoraxtraumata hatten günstigere Behandlungsverläufe. Die
von uns ermittelten Behandlungskennzahlen sind damit zumeist besser als die in
internationalen Therapie‐Studien publizierten Ergebnisse.
Schlussfolgerung: Die Osteosynthese komplexer knöcherner Brustwandverletzungen
stellt eine vielversprechende Behandlungsoption für Traumapatienten dar. Für eine
Bewertung des tatsächlichen zusätzlichen klinischen Nutzens ist jedoch eine genaue
Charakterisierung des behandelten Patientenkollektivs erforderlich.
Based on the work of Eisenberg and Noe [2001], Suzuki [2002], Elsinger [2009] and Fischer [2014], we consider a generalization of Merton's asset valuation approach where n firms are linked by cross-ownership of equities and liabilities. Each firm is assumed to have a single outstanding liability, whereas its assets consist of one system-exogenous asset, as well as system-endogenous assets comprising some fraction of other firms' equity and liability, respectively. Following Fischer [2014], one can obtain no-arbitrage prices of equity and the recovery claims of liabilities as solutions of a fixed point problem, and hence obtain no-arbitrage prices of the `firm value' of each firm, which is the value of the firm's liability plus the firm's equity.
In a first step, we consider the two-firm case where explicit formulae for the no-arbitrage prices of the firm values are available (cf. Suzuki [2002]). Since firm values are derivatives of exogenous asset values, the distribution of firm values at maturity can be determined from the distribution of exogenous asset values. The Merton model and most of its known extensions do not account for the cross-ownership structure of the assets owned by the firm. Therefore the assumption of lognormally distributed exogenous assets leads to lognormally distributed firm values in such models, as the values of the liability and the equity add up to the exogenous asset's value (which has lognormal distribution by assumption). Our work therefore starts from lognormally distributed exogenous assets and reveals how cross-ownership, when correctly accounted for in the valuation process, affects the distribution of the firm value, which is not lognormal anymore. In a simulation study we examine the impact of several parameters (amount of cross-ownership of debt and equity, ratio of liabilities to expected exogenous assets value) on the differences between the distribution of firm values obtained from our model and correspondingly matched lognormal distributions. It becomes clear that the assumption of lognormally distributed firm values may lead to both over- and underestimation of the “true" firm values (within the cross-ownership model) and consequently of bankruptcy risk, too.
In a second step, the bankruptcy risk of one firm within the system is analyzed in more detail in a further simulation study, revealing that the correct incorporation of cross-ownership in the valuation procedure is the more important, the tighter the cross-ownership structure between the two firms. Furthermore, depending on the considered type of cross-ownership (debt or equity), the assumption of lognormally distributed firm values is likely to result in an over- resp. underestimation of the actual probability of default. In a similar vein, we consider the Value-at-Risk (VaR) of a firm in the system, which we calculate as the negative α-quantile of the firm value at maturity minus the firm's risk neutral price in t=0, i.e. we consider the (1-α)100%-VaR of the change in firm value. If we let the cross-ownership fractions (i.e. the fraction that one firm holds of another firm's debt or equity) converge to 1 (which is the supremum of the possible values that cross-ownership fractions can take), we can prove that in a system of two firms, the lognormal model will over- resp. underestimate both univariate and bivariate probabilities of default under cross-ownership of debt only resp. cross-ownership of equity only. Furthermore, we provide a formula that allows us to check for an arbitrary scenario of cross-ownership and any non-negative distribution of exogenous assets whether the approximating lognormal model will over- or underestimate the related probability of default of a firm. In particular, any given non-negative distribution of exogenous asset values (non-degenerate in a certain sense) can be transformed into a new, “extreme" distribution of exogenous assets yielding such a low or high actual probability of default that the approximating lognormal model will over- and underestimate this risk, respectively.
After this analysis of the univariate distribution of firm values under cross-ownership in a system of two firms with bivariately lognormally distributed exogenous asset values, we consider the copula of these firm values as a distribution-free measure of the dependency between these firm values. Without cross-ownership, this copula would be the Gaussian copula. Under cross-ownership, we especially consider the behaviour of the copula of firm values in the lower left and upper right corner of the unit square, and depending on the type of cross-ownership and the considered corner, we either obtain error bounds as to how good the copula of firm values under cross-ownership can be approximated with the Gaussian copula, or we see that the copula of firm values can be written as the copula of two linear combinations of exogenous asset values (note that these linear combinations are not lognormally distributed). These insights serve as a basis for our analysis of the tail dependence coefficient of firm values under cross-ownership. Under cross-ownership of debt only, firm values remain upper tail independent, whereas they become perfectly lower tail dependent if the correlation between exogenous asset values exceeds a certain positive threshold, which does not depend on the exact level of cross-ownership. Under cross-ownership of equity only, the situation is reverse in that firm values always remain lower tail independent, but upper tail independence is preserved if and only if the right tail behaviour of both firms’ values is determined by the right tail behaviour of the firms’ own exogenous asset value instead of the respective other firm’s exogenous asset value.
Next, we return to systems of n≥2 firms and analyze sensitivities of no-arbitrage prices of equity and the recovery claims of liabilities with respect to the model parameters. In the literature, such sensitivities are provided with respect to exogenous asset values by Gouriéroux et al. [2012], and we extend the existing results by considering how these no-arbitrage prices depend on the cross-ownership fractions and the level of liabilities. For the former, we can show that all prices are non-decreasing in any cross-ownership fraction in the model, and by use of a version of the Implicit Function Theorem we can also determine exact derivatives. For the latter, we show that the recovery value of debt and the equity value of a firm are non-decreasing and non-increasing in the firm's nominal level of liabilities, respectively, but the firm value is in general not monotone in the firm's level of liabilities. Furthermore, no-arbitrage prices of equity and the recovery claims of liabilities of a firm are in general non-monotone in the nominal level of liabilities of other firms in the system. If we confine ourselves to one type of cross-ownership (i.e. debt or equity), we can derive more precise relationships. All the results can be transferred to risk-neutral prices before maturity.
Finally, following Gouriéroux et al. [2012] and as a kind of extension to the above sensitivity results, we consider how immediate changes in exogenous asset values of one or more firms at maturity affect the financial health of a system of n initially solvent firms. We start with some theoretical considerations on what we call the contagion effect, namely the change in the endogenous asset value of a firm caused by shocks on the exogenous assets of firms within the system. For the two-firm case, an explicit formula is available, making clear that in general (and in particular under cross-ownership of equity only), the effect of contagion can be positive as well as negative, i.e. it can both, mitigate and exacerbate the change in the exogenous asset value of a firm. On the other hand, we cannot generally say that a tighter cross-ownership structure leads to bigger absolute contagion effects. Under cross-ownership of debt only, firms cannot profit from positive shocks beyond the direct effect on exogenous assets, as the contagion effect is always non-positive. Next, we are concerned with spillover effects of negative shocks on a subset of firms to other firms in the system (experiencing non-negative shocks themselves), driving them into default due to large losses in their endogenous asset values. Extending the results of Glasserman and Young [2015], we provide a necessary condition for the shock to cause such an event. This also yields an upper bound for the probability of such an event. We further investigate how the stability of a system of firms exposed to multiple shocks depends on the model parameters in a simulation study. In doing so, we consider three network types (incomplete, core-periphery and ring network) with simultaneous shocks on some of the firms and wiping out a certain percentage of their exogenous assets. Then we analyze for all three types of cross-ownership (debt only, equity only, both debt and equity) how the shock intensity, the shock size, and network parameters as the number of links in the network and the proportion of a firm's debt or equity held within the system of firms influences several output parameters, comprising the total number of defaults and the relative loss in the sum of firm values, among others. Comparing our results to the studies of Nier et al. [2007], Gai and Kapadia [2010] and Elliott et al. [2014], we can only partly confirm their results with respect to the number of defaults. We conclude our work with a theoretical comparison of the complete network (where each firm holds a part of any other firm) and the ring network with respect to the number of defaults caused by a shock on a single firm, as it is done by Allen and Gale [2000]. In line with the literature, we find that under cross-ownership of debt only, complete networks are “robust yet fragile" [Gai and Kapadia, 2010] in that moderate shocks can be completely withstood or drive the firm directly hit by the shock in default, but as soon as the shock exceeds a certain size, all firms are simultaneously in default. In contrast to that, firms default one by one in the ring network, with the first “contagious default" (i.e. a default of a firm not directly hit by the shock) already occurs for smaller shock sizes than under the complete network.
Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen.
In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung.
In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen.
Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle.
Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden.
Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen.
Magnetic resonance imaging is derogated by the presence of metal implants and image quality is impaired. Artifacts are categorized according to their sources, the differences in susceptibility between metal and tissue and the modulation of the magnetic radiofrequency (RF) transmit field. Generally, these artifacts are intensified at higher field strength. The purpose of this work is to analyze the efficiency of current methods used for metal artifact reduction at 3T and to investigate improvements. The impact of high-bandwidth RF pulses on susceptibility-induced artifacts is tested. In addition, the benefit of a two-channel transmit system with respect to shading close to total hip replacements and other elongated metal structures in parallel to the magnetic field is analyzed.
Local transmit/receive coils feature a higher peak B1 amplitude than conventional body coils and thus enable high-bandwidth RF pulses. Susceptibility-induced through-plane distortion relates reciprocally to the RF bandwidth, which is evaluated in vitro for a total knee arthroplasty. Clinically relevant sequences (TSE and SEMAC) with conventional and high RF pulse bandwidths and different contrasts are tested on eight patients with different types of knee implants. Distortion is rated by two radiologists. An additional analysis assesses the capability of a local spine transmit coil. Furthermore, B1 effects close to elongated metal structures are described by an analytical model comprising a water cylinder and a metal rod, which is verified numerically and experimentally. The dependence of the optimal polarization of the transmit B1 field, creating minimum shading, on the position of the metal is analyzed. In addition, the optimal polarization is determined for two patients; its benefit compared to circular polarization is assessed.
Phantom experiments confirm the relation of the RF bandwidth and the through-plane distortion, which can be reduced by up to 79% by exploitation of a commercial local transmit/receive knee coil at 3T. On average, artifacts are rated “hardly visible” for patients with joint arthroplasties, when high-bandwidth RF pulses and SEMAC are used, and for patients with titanium fixtures, when high-bandwidth RF pulses are used in combination with TSE. The benefits of the local spine transmit coil are less compared to the knee coil, but enable a bandwidth 3.9 times as high as the body coil. The modulation of B1 due to metal is approximated well by the model presented and the position of the metal has strong influence on this effect. The optimal polarization can mitigate shading substantially.
In conclusion, through-plane distortion and related artifacts can be reduced significantly by the application of high-bandwidth RF pulses by local transmit coils at 3T. Parallel transmission offers an option to substantially reduce shading close to long metal structures aligned with the magnetic field. Effective techniques dedicated for metal implant imaging at 3T are introduced in this work.
Structural and Biochemical Characterization of the GABA(A) Receptor Interacting Protein Muskelin
(2015)
In a study from 2011, the protein muskelin was described as a central coordinator of the retrograde transport of GABA(A) receptors in neurons. As muskelin governs the transport along actin filaments as well as microtubules, it might be the first representative of a novel class of regulators, which coordinate cargo transport across the borders of these two independent systems of transport paths and their associated motorproteins. To establish a basis for understanding the mode of operation of muskelin, the aim of this thesis was an in-depth biochemical and structural characterization of muskelin and its interaction with the GABA(A) receptor.
One focus of the work was the analysis of the oligomerization of muskelin. As could be demonstrated, the oligomerization is based on two independent interactions mediated by different domains of the protein: a known interaction of the N-terminal discoidin domain with the C-terminal portion, termed head-to-tail interaction, and a dimerization of the LisH motif in muskelin that was so far neglected in the literature. For the detailed studies of both binding events, the solution of a crystal structure of a fragment of muskelin, comprising the Discoidin domain and the LisH motif, was an important basis. The fragment crystallized as a dimer, with dimerization being mediated solely by the LisH motif. Biochemical analysis corroborated that the LisH motif in muskelin serves as a dimerization element, and, moreover, showed that the C-terminal domain of the protein substantially stabilizes this dimerization. In addition, the crystal structure revealed the molecular composition of the surface of the head in the head-to-tail interaction, namely the discoidin domain. This information enabled to map the amino acids contributing to binding, which showed that the binding site of the head-to-tail interaction coincides with the generic ligand binding site of the discoidin domain.
As part of the analyses, residues that are critical for LisH-dimerization and the head-to-tail binding, respectively, were identified, whose mutation specifically interfered with each of the interactions separately. These mutations allowed to investigate the interplay of these interactions during oligomerization. It could be shown that recombinant muskelin assembles into a tetramer to which both interactions, the LisH-dimerization and the head-to-tail binding, contribute independently. When one of the two interactions was disturbed, only a dimer mediated via the respective other interaction could be formed; when both interactions were disturbed, the protein was present as monomer. Furthermore, Frank Heisler in the group of Matthias Kneussel was able to show the drastic impact of an impaired LisH-dimerization on muskelin in cells using these mutations. Disturbing the LisH-dimerization led to a complete redistribution of the originally cytoplasmic muskelin to the nucleus which was accompanied by a severe impairment of its function during GABA(A) receptor transport. Following up on these results in an analysis of muskelin variants, for which alterations of the subcellular localization had been published earlier, the crucial influence of LisH-dimerization to the subcellular localization and thereby the role of muskelin in the cell was confirmed.
The biochemical studies of the interaction of muskelin and the alpha1 subunit of the GABA(A) receptor demonstrated a direct binding with an affinity in the low micromolar range, which is mediated primarily by the kelch repeat domain in muskelin. For the binding site on the GABA(A) receptor, it was confirmed that the thirteen most C-terminal residues of the intracellular domain are critical for the binding of muskelin. In accordance with the strong conservation of these residues among the alpha subunits of the GABA(A) receptor, it could be shown that an interaction with muskelin in vitro is also possible for the alpha2 and alpha5 subunits. Based on the comparison of the binding sites between the homologous subunits, tentative conclusions can be drawn about the details of the binding, which may serve as a starting point for follow-up studies.
This thesis thereby makes valuable contributions to the understanding of muskelin, in particular the significance of its oligomerization. It furthermore provides an experimental framework for future studies that address related topics, such as the characterization of other muskelin interaction partners, or the questions raised in this work.
Brain-computer interfaces (BCIs) could provide a muscle-independent communication channel to persons with severe paralysis by translating brain activity into device commands. As a means of communication, in particular BCIs based on event-related potentials (ERPs) as control signal have been researched. Most of these BCIs rely on visual stimulation and have been investigated with healthy participants in controlled laboratory environments. In proof-of-principle studies targeted end users gained control over BCI systems; however, these systems are not yet established as an assistive technology for persons who would most benefit from them. The main aim of this thesis is to advance the usability of ERP-BCIs for target users. To this end, five studies with BCIs have been conducted that enabled users to communicate by focusing their attention on external stimuli.
Two studies were conducted in order to demonstrate the advantages and to further improve the practical application of visual BCIs. In the first study, mental workload was experimentally manipulated during prolonged BCI operation. The study showed the robustness of the visual ERP-BCI since users maintained a satisfactory level of control despite constant distraction in the form of background noise. Moreover, neurophysiological markers that could potentially serve as indicators of high mental workload or fatigue were revealed. This is a first step towards future applications in which the BCI could adapt to the mental state of the user (e.g. pauses if high mental workload is detected to prevent false selections). In the second study, a head-mounted display (HMD), which assures that stimuli are presented in the field of view of the user, was evaluated. High accuracies and information transfer rates, similar to a conventional display, were achieved by healthy participants during a spelling task. Furthermore, a person in the locked-in state (LIS) gained control over the BCI using the HMD. The HMD might be particularly suited for initial communication attempts with persons in the LIS in situations, where mounting a conventional monitor is difficult or not feasible.
Visual ERP-BCIs could prove valuable for persons with residual control over eye muscles and sufficient vision. However, since a substantial number of target users have limited control over eye movements and/or visual impairments, BCIs based on non-visual modalities are required. Therefore, a main aspect of this thesis was to improve an auditory paradigm that should enable motor impaired users to spell by focusing attention on different tones. The two conducted studies revealed that healthy participants were able to achieve high spelling performance with the BCI already in the first session and stress the importance of the choice of the stimulus material. The employed natural tones resulted in an increase in performance compared to a previous study that used artificial tones as stimuli. Furthermore, three out of five users with a varying degree of motor impairments could gain control over the system within the five conducted sessions. Their performance increased significantly from the first to the fifth session - an effect not previously observed for visual ERP-BCIs. Hence, training is particularly important when testing auditory multiclass BCIs with potential users.
A prerequisite for user satisfaction is that the BCI technology matches user requirements. In this context, it is important to compare BCIs with already established assistive technology. Thus, the fifth study of this dissertation evaluated gaze dependent methods (EOG, eye tracking) as possible control signals for assistive technology and a binary auditory BCI with a person in the locked-in state. The study participant gained control over all tested systems and rated the ease of use of the BCI as the highest among the tested alternatives, but also rated it as the most tiring due to the high amount of attention that was needed for a simple selection. Further efforts are necessary to simplify operation of the BCI.
The involvement of end users in all steps of the design and development process of BCIs will increase the likelihood that they can eventually be used as assistive technology in daily life. The work presented in this thesis is a substantial contribution towards the goal of re-enabling communication to users who cannot rely on motor activity to convey their thoughts.
The honeybee Apis mellifera is a social insect well known for its complex behavior and the ability to learn tasks associated with central place foraging, such as visual navigation or to learn and remember odor-reward associations. Although its brain is smaller than 1mm² with only 8.2 x 105 neurons compared to ~ 20 x 109 in humans, bees still show amazing social, cognitive and learning skills. They express an age – related division of labor with nurse bees staying inside the hive and performing tasks like caring for the brood or cleaning, and foragers who collect food and water outside the hive. This challenges foragers with new responsibilities like sophisticated navigation skills to find and remember food sources, drastic changes in the sensory environment and to communicate new information to other bees. Associated with this plasticity of the behavior, the brain and especially the mushroom bodies (MBs) - sensory integration and association centers involved in learning and memory formation – undergo massive structural and functional neuronal alterations. Related to this background my thesis on one hand focuses on neuronal plasticity and underlying molecular mechanisms in the MBs that accompany the nurse – forager transition.
In the first part I investigated an endogenous and an internal factor that may contribute to the nurse - forager phenotype plasticity and the correlating changes in neuronal network in the MBs: sensory exposure (light) and juvenile hormone (JH). Young bees were precociously exposed to light and subsequently synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the MBs or respectively hemolymph juvenile hormone (JH) levels were quantified. The results show that light input indeed triggered a significant decrease in MG density, and mass spectrometry JH detection revealed an increase in JH titer. Interestingly light stimulation in young bees (presumably nurse bees) triggered changes in MG density and JH levels comparable to natural foragers. This indicates that both sensory stimuli as well as the endocrine system may play a part in preparing bees for the behavioral transition to foraging.
Considering a connection between the JH levels and synaptic remodeling I used gene knockdown to disturb JH pathways and artificially increase the JH level. Even though the knockdown was successful, the results show that MG densities remained unchanged, showing no direct effect of JH on synaptic restructuring.
To find a potential mediator of structural synaptic plasticity I focused on the calcium-calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in the second part of my thesis. CaMKII is a protein known to be involved in neuronal and behavioral plasticity and also plays an important part in structural plasticity reorganizing synapses. Therefore it is an interesting candidate for molecular mechanisms underlying MG reorganization in the MBs in the honeybee. Corresponding to the high abundance of CaMKII in the learning center in vertebrates (hippocampus), CaMKII was shown to be enriched in the MBs of the honeybee. Here I first investigated the function of CaMKII in learning and memory formation as from vertebrate work CaMKII is known to be associated with the strengthening of synaptic connections inducing long term potentiation and memory formation. The experimental approach included manipulating CaMKII function using 2 different inhibitors and a specific siRNA to create a CaMKII knockdown phenotype. Afterwards bees were subjected to classical olfactory conditioning which is known to induce stable long-term memory. All bees showed normal learning curves and an intact memory acquisition, short-term and mid-term memory (1 hour retention). However, in all cases long-term memory formation was significantly disrupted (24 and 72 hour retention). These results suggests the necessity of functional CaMKII in the MBs for the induction of both early and late phases of long-term memory in honeybees. The neuronal and molecular bases underlying long-term memory and the resulting plasticity in behavior is key to understanding higher brain function and phenotype plasticity. In this context CaMKII may be an important mediator inducing structural synaptic and neuronal changes in the MB synaptic network.
Protected areas are the central strategy for preserving biodiversity in the face of overexploitation and global change. To ensure their long-term survival, however, these areas may not be regarded as last havens of wilderness, but as complex social-ecological systems. Modern approaches of protected area (PA) management support this view by balancing conservation and development issues in a sustainable way and adapted to the local context. However, success of these strategies in achieving their aims so far remains limited.
This study therefore aimed at analysing processes and outcomes of PA co-management approaches implemented in a large transfrontier conservation area in West Africa. The W-Arly-Pendjari (WAP) complex spans over more than 30.000 square km in Benin, Burkina Faso and Niger and is composed of approximately 20 subunits. Due to national legal and administrative variety as well as a high diversity of local (project) implementation approaches, the general setting resembled a quasi-experimental design facilitating comparative studies.
A mix of quantitative (e.g. survey of 549 households) and qualitative (e.g. expert interviews, literature review) methods was used to evaluate the institutional and organisational differences of PA management approaches implemented in the different parts of WAP belonging to Benin and Burkina Faso. I included an analysis of contextual factors (e.g. land-cover-change) and ecological data, but concentrated on the role of local resource users within the co-management arrangements and the effectiveness of governance regimes to deliver positive socio-economic outputs. Exploring the question whether promotion of development in PA surroundings indeed stipulates conservation success (and vice versa) remained challenging: the lack of sound ecological data, a general mismatch of spatial scale in existing data sets, as well as the high complexity of realities on the ground made me refrain from using simplified proxy indicators and (statistical) modelling approaches.
I found that the Sudano-Sahelian context is a very difficult one for the implementation of effective participation approaches in the short-term. Political, demographic, socio-economic as well as ecological factors generated a very dynamic situation characterized by limited financial and natural resources as well as weak institutional and organisational settings.
Arenas of interaction were often marked rather by a high degree of distrust and competition than by cooperation among actors. Amid all rhetoric, participation in most cases was hence limited to the transfer of (sparse) information, regulated resource access and financial funds. Options for participation of local resource users in decision-making arenas were generally scarce. Underlying processes were dominated by opacity and often low accountability of actors on all levels. Negative, but also positive affection of local residents by PA existence and management hence was high.
Governance regimes of the complex performed very differently with regard to their ability of effectively empowering local village participatory bodies (vpb), generating and distributing benefits to individuals and village communities as well as providing mechanisms of conflict resolution. People around Pendjari enjoyed a relative wealth of high value benefits, while negative impacts caused by human-wildlife conflicts were widespread around the complex. Autochthonous farmers usually were better integrated in incentive schemes than were newcomers or herders.
While there was functional separation of actors’ roles in all parts of WAP, these roles differed significantly between blocks. Existence and functioning of village participatory bodies ameliorated the situation for local resource users fundamentally, as they acted as cut-points between different networks (governmental hierarchies, private concessionaires and local resource users). Vpbs in the Pendjari region proved to be most advanced in their capacity to push resource users’ claims in action arenas on the micro-level. Via their union, these associations also managed to impact arenas on the meso- and the macro scale.
Project interventions often had catalyst functions to empower local resource users and their vbps. However, they also contributed to social imbalance and intra-organisational competition.
My results represent a snapshot of an ongoing process to establish effective co-governance regimes in the WAP-area. Though I identified a large scope of shortcomings, there were also very promising initiatives underway. This work is therefore meant to foster future research and further positive development by giving guidance scholars and decision-makers form the local to the global level alike.
In unserer Studie kamen die neuen Verfahren qualitative und semiquantitative Elastographie zum Einsatz. Es sollte gezeigt werden, ob sie als Ergänzung zu den herkömmlichen sonographischen Verfahren die Diagnosestellung von Erkrankungen am Hals bei Kindern und Jugendlichen verbessern können.
Bei der Untersuchung mittels semiquantitativer Elastographie konnten wir in unserer Studie beim Vergleich Schilddrüsen-Normalbefund und Hashimoto-Thyreoiditis einen signifikanten Unterschied der Scherwellengeschwindigkeiten nachweisen. Es zeigte sich, dass Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis signifikant höhere Scherwellengeschwindigkeiten aufweisen als Patienten mit Normalbefund. Für die anderen untersuchten Schilddrüsenerkrankungen, Struma diffusa und Struma nodosa und für die Erkrankungen der Lymphknoten, benigne Veränderung/Entzündung, maligne Veränderung und Abszess, ließ sich kein signifikanter Unterschied feststellen.
Die Sensitivität und Spezifität konnte durch Einsatz des neuen Verfahrens der qualitativen Elastographie nicht gesteigert werden. Während sich bei der Schilddrüsendiagnostik geringere Werte für Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren zeigten, unterschieden sich die Werte bei der Lymphknotenuntersuchung Reader-abhängig.
Bei der Schilddrüsenuntersuchung lag die Bildqualität der konventionellen Sonographie über der der qualitativen Elastographie. Dagegen wurde bei der Lymphknotenuntersuchung die Bildqualität der Elastographiebilder höher bewertet als jene der herkömmlichen Verfahren.
Insgesamt konnte in unserer Studie gezeigt werden, dass Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditits signifikant höhere Scherwellengeschwindigkeiten im Schilddrüsengewebe aufweisen, als bei Normalbefund. In der Diagnostik von Schilddrüsen- und Lymphknotenerkrankungen konnte bezüglich des neuen Verfahrens der qualitativen Elastographie eine Überlegenheit gegenüber der konventionellen Sonographie nicht nachgewiesen werden.
Um die Ergebnisse unserer Studie abschließend bewerten zu können, wäre eine Validierung anhand einer größeren Patientengruppe nötig.
Over the last decade, the field of topological insulators has become one of the most vivid areas in solid state physics. This novel class of materials is characterized by an insulating bulk gap, which, in two-dimensional, time-reversal symmetric systems, is closed by helical edge states. The latter make topological insulators promising candidates for applications in high fidelity spintronics and topological quantum computing. This thesis contributes to bringing these fascinating concepts to life by analyzing transport through heterostructures formed by two-dimensional topological insulators in contact with metals or superconductors. To this end, analytical and numerical calculations are employed. Especially, a generalized wave matching approach is used to describe the edge and bulk states in finite size tunneling junctions on the same footing.
The numerical study of non-superconducting systems focuses on two-terminal metal/topological
insulator/metal junctions. Unexpectedly, the conductance signals originating from the bulk and
the edge contributions are not additive. While for a long junction, the transport is determined
purely by edge states, for a short junction, the conductance signal is built from both bulk and
edge states in a ratio, which depends on the width of the sample. Further, short junctions show
a non-monotonic conductance as a function of the sample length, which distinguishes the topologically non-trivial regime from the trivial one. Surprisingly, the non-monotonic conductance of the topological insulator can be traced to the formation of an effectively propagating solution, which is robust against scalar disorder.
The analysis of the competition of edge and bulk contributions in nanostructures is extended to transport through topological insulator/superconductor/topological insulator tunneling junctions. If the dimensions of the superconductor are small enough, its evanescent bulk modes
can couple edge states at opposite sample borders, generating significant and tunable crossed
Andreev reflection. In experiments, the latter process is normally disguised by simultaneous
electron transmission. However, the helical edge states enforce a spatial separation of both competing processes for each Kramers’ partner, allowing to propose an all-electrical measurement
of crossed Andreev reflection.
Further, an analytical study of the hybrid system of helical edge states and conventional superconductors in finite magnetic fields leads to the novel superconducting quantum spin Hall effect. It is characterized by edge states. Both the helicity and the protection against scalar disorder of these edge states are unaffected by an in-plane magnetic field. At the same time its superconducting gap and its magnetotransport signals can be tuned in weak magnetic fields, because the combination of helical edge states and superconductivity results in a giant g-factor. This is manifested in a non-monotonic excess current and peak splitting of the dI/dV characteristics as a function of the magnetic field. In consequence, the superconducting quantum spin Hall effect is an effective generator and detector for spin currents.
The research presented here deepens the understanding of the competition of bulk and edge
transport in heterostructures based on topological insulators. Moreover it proposes feasible experiments to all-electrically measure crossed Andreev reflection and to test the spin polarization of helical edge states.
Natürliche Killer T-Zellen stellen ein verbindendes Element zwischen angeborener und adaptiver Immunität dar und sind durch die Expression von T- und NK-Zell-Markern, sowie eines invarianten T-Zell-Rezeptors charakterisiert. Damit erkennen sie Lipide, welche vorwiegend durch dendritische Zellen mittels des MHC-I-ähnlichen Moleküls CD1d präsentiert werden. Die protektive Rolle von iNKT-Zellen bei Autoimmun- und malignen Erkrankungen ist nachgewiesen, ebenso ihre wichtige Aufgabe bei der Abwehr bakterieller, viraler und parasitärer Pathogene. Inwiefern iNKT-Zellen mit Pilzen und im speziellen Aspergillus fumigatus (A. f.) interagieren ist jedoch unzureichend beschrieben.
iNKT-Zellen gesunder Spender wurden ex vivo selektiv kultiviert und mit A. f. Konidien und Keimschläuchen kokultiviert. Microarray-Analyse, bzw. Multiplex-ELISA fanden Anwendung, um eine durch A. f. induzierte differentielle Genexpression bzw. Zytokinsekretion bei iNKT-Zellen zu detektieren. Zusätzlich wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen, ob A. f. die Produktion des TH1-Zytokins IFN-γ beeinflusst. Schließlich wurde der fungizide Effekt von iNKT-Zellen auf A. f. via XTT-Assay quantifiziert.
iNKT-Zellen zeigten einen ausgeprägten fungiziden Effekt auf A. f. Keimschläuche, welcher mit einem hohen Anteil IFN-γ+ iNKT-Zellen vergesellschaftet war. Hingegen zeigte sich kein Stimulus-spezifisches Zytokinsekretionsmuster. Besonders Keimschläuche induzierten eine differentielle Genexpression bei iNKT-Zellen. Diese war gekennzeichnet durch eine Hochregulierung von Genen des anaeroben Glukosemetabolismus. Als Zeichen einer möglicherweise lokalen Hypoxie waren VEGFA hoch-, bzw. CCL15 in ihrer Transkription herunterreguliert. Vor dem Hintergrund einer unbefriedigend hohen Mortalität der durch A. f. verursachten invasiven Aspergillose können diese ersten Ergebnisse der Interaktion des Schimmelpilzes mit iNKT-Zellen Grundlage für weitere Untersuchungen sein, um deren Wechselwirkung besser zu verstehen und möglicherweise zur Verbesserung der Therapie der Aspergillose beizutragen.
Hintergrund: In den letzten Jahren werden in der virologischen Routinediagnostik herkömmliche Methoden, wie der Immunfluoreszenztest (IFT), zunehmend durch neue molekulare Detektionsmethoden ersetzt. Auf der Suche nach einem für das Kinderklinik-Kollektiv geeigneten alternativen Screeningtest war im Vorfeld das Resplex Panel im Vergleich zum aktuellen Standard (IFT) getestet worden. Die Ergebnisse für ADV und RSV waren dabei deutlich diskrepant.
Studiendesign: Zur weiteren Abklärung der diskrepanten Ergebnisse zwischen IFT und Resplex wurden respiratorische Proben aus dem Zeitraum Mai 2004 bis Februar 2008 von Patienten aus Würzburger Kinderkliniken verwendet. Dies umfasste 71 Proben, die im IFT positiv für Adenovirus-Antigen vorgetestet waren, und 68 Proben, die im IFT positiv für RSV-Antigen vorgetestet waren. Für alle Proben lagen Resplex-Ergebnisse vor. Mittels Sequenzierung aus Restmaterial wurden Adenovirus-Typen und RSV-Subtypen bestimmt. IFT-, Resplex- und Typisierungs-Ergebnisse wurden verglichen. Zusätzlich erfolgte eine epidemiologische Auswertung.
Ergebnisse: Das Resplex Panel zeigt sich im vorliegenden pädiatrischen Kollektiv zur Detektion von ADV und RSV aufgrund unterschiedlicher Ursachen als ungeeignet: Für ADV ist sein auf zwei Spezies (ADV B und E) beschränktes Spektrum unzureichend, wodurch es die im Kollektiv häufige ADV C-Spezies (43%) nicht erfasst. Für RSV bedürfen die Primer bzw. Sonden einer Überarbeitung, da das Resplex Panel, verglichen mit dem IFT, wesentlich weniger Proben (41%) als RSV-positiv erkennt.
Bezüglich der Prävalenz der Typen wurde eine für ADV typische Verteilung in Kinderkollektiven (54% ADV 3, 26% ADV 2, 12% ADV 1) nachgewiesen. Betroffen waren vor allem Kinder im Alter von sechs Monaten bis fünf Jahren. Kinder mit ADV C-Infektionen waren signifikant jünger als Kinder mit ADV B-Infektionen. Für RSV zeigte sich in der respiratorischen Saison 2006/2007 und in den Wintermonaten 1 – 2/2008 eine Dominanz von RSV Subtyp B. Betroffen waren vor allem Kinder im ersten Lebensjahr.
Resumé: Die vorliegende Studie bestätigt die unzureichende Detektion von ADV und RSV durch das Resplex Panel, wobei bezüglich ADV ein unzureichendes Spektrum, für RSV unzureichend optimierte Primer und Sonden vermutlich ursächlich sind. Die epidemiologischen Daten stehen mit denen aus anderen Studien an ähnlichen Kollektiven in Einklang.
Ziele:
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die dentalen Auswirkungen einer chirurgisch unterstützten Gaumennahterweiterung unter Anwendung einer skelettal verankerten Apparatur (TPD) im Vergleich zur Anwendung einer dental verankerten Apparatur (GNE) mit Hilfe eines dreidimensionalen Modellscanners zu analysieren.
Patienten und Methode:
28 erwachsene Patienten (Durchschnittsalter: 27,4 ± 9,1 Jahre) wurden mit einer chirurgisch unterstützten transversalen Erweiterung des Oberkiefers therapiert. Die Erweiterung erfolgte bei 16 Patienten mit einem skelettal verankerten transpalatinalen Distraktor (TPD-Gruppe) und bei 12 Patienten mit einer dental abgestützten GNE-Apparatur (Hyrax-Gruppe). Innerhalb beider Patientengruppen wurde eine subtotale Le-Fort-I-Osteotomie mit Schwächung der Sutura pterygomaxillaris durchgeführt. Bei allen Patienten wurden sowohl vor Einsetzten der Apparaturen als auch nach erfolgter Erweiterung des Oberkiefers Situationsmodelle erstellt. Nach Generierung virtueller Modelle mittels des optischen Sensors R 700 (3Shape A/S, Kopenhagen, Dänemark), wurde eine dreidimensionale Analyse mit Hilfe der OrthoAnalyzer Software (3Shape A/S, Kopenhagen, Dänemark) zur Berechnung der Zahnstellungsänderungen durchgeführt.
Ergebnisse:
Bei der SARME findet unabhängig von der verwendeten Appartur eine signifikante Erweiterung des Oberkiefers statt. Beim Einsatz einer skelettal verankerten Apparatur tritt eine geringere Bukkalkippung der Seitenzähne auf als beim Einsatz einer dental verankerten Apparatur. Intrusionen bzw. Extrusionen finden nur in klinisch irrelevantem Maß statt.
Schlussfolgerung:
Die Therapie der hypoplastischen Maxilla durch eine SARME bei adulten Patienten ist sowohl mittels Hyrax-Apparatur als auch mittels TPD möglich. Das Behandlerteam aus Kieferorthopäden und Kieferchirurgen kann durch das Wissen über die unterschiedliche Reaktion beider Apparaturen bereits in der prätherapeutischen Phase die Bewegungsmuster der Kiefersegmente planen:
• Bei Anwendung einer Hyrax-Apparatur ist mit einer annähernd parallelen Erweiterung des Zahnbogens mit Zuwachs in der Prämolarenregion zu rechnen.
• Bei Anwendung eines TPD ist eher mit einer V-förmigen erweiterung des Zahnbogens mit größtem Zuwachs im anterioren Bereich zu rechnen.
Durch die Option der variablen Positionierung der Dehnschraube weiter anterior oder posterior der Prämolarenregion bei Einsatz des TPDs und dem daraus veränderten Modus der Erweiterung resultiert eine Erweiterung des kieferorthopädischen und kieferchirurgischen Spektrums.
Habitat fragmentation and destruction due to anthropogenic land use are the major causes of the increasing extinction risk of many species and have a detrimental impact on animal populations in numerous ways. The long-term survival and stability of spatially structured populations in fragmented landscapes largely depends on the colonisation of habitat patches and the exchange of individuals and genes between patches. The degree of inter-patch dispersal, in turn, depends on the dispersal ability of a species (i.e. the combination of physiological and morphological factors that facilitate dispersal) and the landscape structure (i.e. the nature of the landscape matrix or the spatial configuration of habitat patches). As fragmentation of landscapes is increasing and the number of species is continuously declining, a thorough understanding of the causes and consequences of dispersal is essential for managing natural populations and developing effective conservation strategies.
In the context of animal dispersal, movement behaviour is intensively investigated with capture-mark-recapture studies. For the analysis of such experiments, the influence of marking technique, handling and translocation of marked animals on movement pattern is of crucial importance since it may mask the effects of the main research question. Chapter 2 of this thesis presents a capture-mark-recapture study investigating the effect of translocation on the movement behaviour of the blue-winged grasshopper Oedipoda caerulescens. Transferring individuals of this grasshopper species to suitable but unfamilliar sites has a significant influence on their movement behaviour. Translocated individuals moved longer distances, showed smaller daily turning angles, and thus their movements were more directed than those of resident individuals. The effect of translocation was most pronounced on the first day of the experiment, but may persist for longer. On average, daily moved distances of translocated individuals were about 50 % longer than that of resident individuals because they have been transferred to an unfamiliar habitat patch. Depending on experiment duration, this leads to considerable differences in net displacement between translocated and resident individuals. In summary, the results presented in chapter 2 clearly point out that translocation effects should not be disregarded in future studies on arthropod movement, respectively dispersal. Studies not controlling for possible translocation effects may result in false predictions of dispersal behaviour, habitat detection capability or habitat preferences.
Beside direct field observations via capture-mark-recapture methods, genetic markers can be used to investigate animal dispersal. Chapter 3 presents data on the genetic structure of populations of Metrioptera bicolor, a wing-dimorphic bush cricket, in a spatially structured landscape with patches of suitable habitat distributed within a diverse matrix of different habitat types. Using microsatellite markers, the effects of geographic distance and different matrix types on the genetic differentiation among 24 local populations was assessed. The results of this study clearly indicate that for M. bicolor the isolation of local populations severely depends on the type of surrounding matrix. The presence of forest and a river running through the study area was positively correlated with the extent of genetic differentiation between populations. This indicates that both matrix types severely impede gene flow and the exchange of individuals between local populations of this bush cricket. In addition, for a subsample of populations which were separated only by arable land or settlements, a significant positive correlation between pairwise genetic and geographic distances exists. For the complete data set, this correlation could not be found. This is most probably due to the adverse effect of forest and river on gene flow which dominates the effect of geographic distance in the limited set of patches investigated in this study. The analyses in chapter 3 clearly emphasize the differential resistance of different habitat types on dispersal and the importance of a more detailed view on matrix ‘quality’ in metapopulation studies. Studies that focus on the specific dispersal resistance of different matrix types may provide much more detailed information on the dispersal capacity of species than a mere analysis of isolation by distance. Such information is needed to improve landscape oriented models for species conservation.
In addition to direct effects on realised dispersal (see chapter 3), landscape structure on its own is known to act as an evolutionary selection agent because it determines the costs and benefits of dispersal. Both morphological and behavioural traits of individuals and the degree to which a certain genotype responds to environmental variation have heritable components, and are therefore expected to be able to respond to selection pressures. Chapter 4 analyses the influence of patch size, patch connectivity (isolation of populations) and sand dynamics (stability of habitat) on thorax- and wing length as proxies for dispersal ability of O. caerulescens in coastal grey dunes. This study revealed clear and sex-specific effects of landscape dynamics and patch configuration on dispersal-related morphology. Males of this grasshopper species were smaller and had shorter wings if patches were larger and less connected. In addition, both sexes were larger in habitat patches with high sand dynamics compared to those in patches with lower dynamics. The investments in wing length were only larger in connected populations when sand dynamics were low, indicating that both landscape and patch-related environmental factors are of importance. These results are congruent with theoretical predictions on the evolution of dispersal in metapopulations. They add to the evidence that dispersal-related morphology varies and is selected upon in recently structured populations even at small spatial scales.
Dispersal involves different individual fitness costs like increased predation risk, energy expenditure, costs of developing dispersal-related traits, failure to find new suitable habitat as well as reproductive costs. Therefore, the decision to disperse should not be random but depend on the developmental stage or the physiological condition of an individual just as on actual environmental conditions (context-dependent dispersal, e.g. sex- and wing morph-biased dispersal). Biased dispersal is often investigated by comparing the morphology, physiology and behaviour of females and males or sedentary and dispersive individuals. Studies of biased dispersal in terms of capture-mark-recapture experiments, investigating real dispersal and not routine movements, and genetic proofs of biased dispersal are still rare for certain taxa, especially for orthopterans. However, information on biased dispersal is of great importance as for example, undetected biased dispersal may lead to false conclusions from genetic data. In chapter 5 of this thesis, a combined approach of morphological and genetic analyses was used to investigate biased dispersal of M. bicolor. The presented results not only show that macropterous individuals are predestined for dispersal due to their morphology, the genetic data also indicate that macropters are more dispersive than micropters. Furthermore, even within the group of macropterous individuals, males are supposed to be more dispersive than females. To get an idea of the flight ability of M. bicolor, the morphological data were compared with that of Locusta migratoria and Schistocerca gregaria, which are proved to be very good flyers. Based on the morphological data presented here, one can assume a good flight ability for macropters of M. bicolor, although flying individuals of this species are seldom observed in natural populations.
Time and Spatially Resolved Photoluminescence Spectroscopy of Hot Excitons in Gallium Arsenide
(2015)
The present thesis investigates the impact of hot exciton effects on the low-temperature time and spatially resolved photoluminescence (PL) response of free excitons in high-purity gallium arsenide (GaAs). The work at hand extends available studies of hot carrier effects, which in bulk GaAs have up to now focused on hot electron populations. In crucial distinction from previous work, we extensively study the free exciton second LO-phonon replica. The benefit of this approach is twofold. First, the two LO phonon-assisted radiative recombination allows to circumvent the inherent interpretation ambiguities of the previously investigated free exciton zero-phonon line. Second, the recombination line shape of the second LO-phonon replica provides direct experimental access to the exciton temperature, thereby enabling the quantitative assessment of hot exciton effects.
In the first part of the thesis, we address the influence of transient cooling on the time evolution of an initially hot photocarrier ensemble. To this end, we investigate time-resolved photoluminescence (TRPL) signals detected on the free exciton second LO-phonon replica. Settling a long-standing question, we show by comparison with TRPL transients of the free exciton zero-phonon line that the slow free exciton photoluminescence rise following pulsed optical excitation is dominated by the slow buildup of a free exciton population and not by the relaxation of large K-vector excitons to the Brillouin zone center. To establish a quantitative picture of the delayed photoluminescence onset, we determine the cooling dynamics of the initially hot photocarrier cloud from a time-resolved line shape analysis of the second LO-phonon replica. We demonstrate that the Saha equation, which fundamentally describes the thermodynamic population balance between free excitons and the uncorrelated electron-hole plasma, directly translates the experimentally derived cooling curves into the time-dependent conversion of unbound electron-hole pairs into free excitons.
In the second part of the thesis, we establish the impact of hot exciton effects on low-temperature spatially resolved photoluminescence (SRPL) studies. Such experiments are widely used to investigate charge carrier and free exciton diffusion in semiconductors and semiconductor nanostructures. By SRPL spectroscopy of the second LO-phonon replica, we show that above-band gap focused laser excitation inevitably causes local heating in the carrier system, which crucially affects the diffusive expansion of a locally excited exciton packet. Undistorted free exciton diffusion profiles, which are correctly described by the commonly used formulation of the photocarrier diffusion equation, are only observed in the absence of spatial temperature gradients. At low sample temperatures, the reliable determination of free exciton diffusion coefficients from both continuous-wave and time-resolved SRPL spectroscopy requires strictly resonant optical excitation.
Using resonant laser excitation, we observe the dimensional crossover of free exciton diffusion in etched wire structures of a thin, effectively two-dimensional GaAs epilayer. When the lateral wire width falls below the diffusion length, the sample geometry becomes effectively one-dimensional. The exciton diffusion profile along the wire stripe is then consistently reproduced by the steady-state solution to the one-dimensional diffusion equation.
Finally, we demonstrate the formation of macroscopic free and bound exciton photoluminescence rings in bulk GaAs around a focused laser excitation spot. Both ring formation effects are due to pump-induced local heating in the exciton system. For a quantitative assessment of the mechanism underlying the free exciton ring formation, we directly determine the exciton temperature gradient from a spatially resolved line shape analysis of the free exciton second LO-phonon replica. We demonstrate that a pump-induced hot spot locally modifies the thermodynamic population balance between free excitons and unbound electron-hole pairs described by the Saha equation, which naturally explains the emergence of macroscopic free exciton ring structures.
In summary, we demonstrate that quantitative consideration of hot exciton effects provides a coherent picture both of the time-domain free exciton luminescence kinetics and of the distinct spatially resolved photoluminescence patterns developing under the influence of spatial photocarrier diffusion.
Auswirkungen palliativmedizinischer Interventionen auf den Lebenssinn, gemessen mit dem SMiLE
(2015)
Seit dem Ende des 19.Jahrhunderts hat sich die Lebenserwartung, hauptsächlich in der westlichen Welt, rasant verbessert (Weiland et al 2006). Moderne Behandlungstechniken und neu entwickelte Wirkstoffe haben es ermöglicht, die Überlebensdauer unheilbar Kranker, die ihren Leiden früher rasch erlegen wären, deutlich zu erhöhen (Stolberg 2011) .Allerdings leiden Palliativpatienten nach wie vor sehr oft unter der starken psychologischen Belastung ihrer Situation (Seeger 2011), darum soll, wo die Lebensquantität nicht weiter beinflussbar ist, wenigstens die Lebensqualität optimiert werden (Wasner 2002). Dieser Fokus auf Lebensqualität ist auch in der WHO-Definition von Palliativmedizin, hier in der Übersetzung der deutschen Gesellschaft für Palliativmedizin, zu finden:
„Palliativmedizin/Palliative Care ist ein Ansatz zur Verbesserung der Lebensqualität von Patienten und ihren Familien, die mit Problemen konfrontiert sind, welche mit einer lebensbedrohlichen Erkrankung einhergehen. Dies geschieht durch Vorbeugen und Lindern von Leiden durch frühzeitige Erkennung, sorgfältige Einschätzung und Behandlung von Schmerzen sowie anderen Problemen körperlicher, psychosozialer und spiritueller Art.“
Im Unterschied zu den anderen medizinischen Disziplinen liegt der Fokus der Palliativmedizin nicht auf Heilung oder Lebenszeitverlängerung, weshalb bei der Beurteilung des Patientennutzens palliativmedizinischer Interventionen der Behandlungserfolg aus Patientensicht anstatt mittels klassischer klinischer Parameter evaluiert werden muss. Hierfür hat sich in entsprechenden Studien die Erhebung patientenbezogener Endpunkte (PRO = Patient Reported Outcomes) etabliert, welche den individuellen Gesundheitszustand eines Patienten aus dessen Sicht erfassen. Da der Begriff „Gesundheitszustand“ hier als gesamtumfassender Terminus zu verstehen ist, und neben dem physischen Wohl auch psychische und soziale Komponenten beinhaltet, wird als Endpunkt in palliativmedizinischen Untersuchungen häufig Lebensqualität gewählt (Stiel et al. 2012).
Zur Untersuchung von Lebensqualität bei Palliativpatienten wurden folge dem schon eine breite Anzahl an Studien durchgeführt. Hierbei ist die physische Komponente, respektive die Linderung körperlicher Symptome, durch das Verwenden von Symptomchecklisten vergleichsweise einfach zu erfassen. Der Einfluss psychosozialer und spiritueller Bereiche der Lebensqualität muss durch kompliziertere, individuelle Konstrukte wie den Lebenssinn erfasst werden. Verschiedene Studien mit Krebspatienten konnten bereits zeigen, dass Lebenssinn trotz ungünstiger gesundheitlicher Umstände stark ausgeprägt sein kann (Fegg et al. 2008a). Lebenssinn kann aber auch eine starke Ressource für die Fertigkeit kritische Lebenssituationen zu bewältigen darstellen. So kann ein sinnerfülltes Leben bei Tumorpatienten Depressionen und sogar dem Wunsch nach einem beschleunigten Tod präventiv entgegenwirken (Chochinov 2002, Chochinov et al. 2005c). Umgekehrt konnten Morita und Kollegen (2004) zeigen, dass ein subjektiv geringes Maß an Sinn positiv mit dem Wunsch nach aktiver Sterbehilfe korreliert.
Das Konstrukt Lebenssinn erhielt also in den letzten Jahren in der Forschung immer mehr Aufmerksamkeit, bis jetzt beschränkt sich die Sinnforschung im palliativen Bereich jedoch auf Befragungen zu einem Zeitpunkt. Von Interesse ist jedoch auch die dynamische Entwicklung der Sinnerfahrung im letzen Lebensabschnitt. Der Fokus dieser Studie liegt aus diesem Grunde auf den Veränderungen des Lebenssinns von Palliativpatienten im Verlauf des stationären Aufenthaltes auf einer Palliativstation. Dies wurde hier mit Hilfe des validierten Fragebogens SMiLE untersucht.