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„Black esophagus“ oder „akute Ösophagusnekrose“ (AÖN) ist eine seltene Erkrankung, die sich makroskopisch durch eine zirkumferente Schwarzverfärbung der Ösophagusmukosa mit abruptem Ende am gastroösophagealen Übergang auszeichnet. Die genaue Pathogenese ist unbekannt; es werden multifaktorielle Einflüsse wie z. B. Säurereflux, Ischämie und verringerte Schutzmechanismen der Mukosa als mögliche Ursachen diskutiert.
Vorgestellt werden 2 Obduktionsfälle, die typische Befunde einer AÖN aufwiesen. Zusätzlich hatten Fall 1 eine Candida-Infektion und Fall 2 eine Appendizitis, sodass eine infektiöse Genese in beiden Fällen eine Rolle gespielt haben könnte.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Vorkommen neu erworbener N-Glykosylierungsmotive in t(14;18)-positiven und -negativen FL der lokalisierten (FL I/II) und fortgeschrittenen Stadien (FL III/IV), sowie zum Zeitpunkt der Primärdiagnose und des Rezidivs untersucht. Dabei wurde der jeweilige Haupttumorklon mit Hilfe von „Next Generation Sequencing“ und unter Verwendung des „LymphoTrack® Assays“ in einer Serie von 68 kryoasservierten FL identifiziert 36 t(14;18)-negative und 32 t(14;18)-positive FL. Die Frequenz neu erworbener N-Glykosylierungsmotive unterschied sich signifikant zwischen t(14;18)-positiven und -negativen PD/R-FL III/IV, während man zwischen t(14;18)-positiven und -negativen PD/R-FL I/II keinen Unterschied beobachten konnte. Des Weiteren zeigten t(14;18)-negative PD/R-FL I-IV im Vergleich zu t(14;18)-positiven PD/R-FL I-IV signifikant häufiger einen Zugewinn neuer N-Glykosylierungsmotive in der FR3 Region des BCL2 Gens, sowie eine vermehrte Nutzung des IGHV4-34 Keimbahngens. Interessanterweise beschränkte sich die Nutzung des IGHV4-34 Gens auf PD-FL und konnte in R-FL nicht nachgewiesen werden. Da sowohl das Vorkommen neu erworbener N-Glykosylierungsmotive in FR3 als auch die Nutzung von IGHV4-34 im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen beschrieben wurden, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Subgruppe der t(14;18)-negativen FL im pathologischen Prozess der Onkogenese mehr auf die Stimulation durch (Auto)-Antigene als durch die Stimulation des B-Zell Rezeptors mit Lektinen (DC-SIGN) angewiesen sein könnte.
NFATc3 in der akuten GvHD
(2023)
Bei Leukämien, Lymphomen und dem Multiplen Myelom stellt die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HCT) oft die letzte kurative Therapieoption dar. Spender-T-Zellen (v.a. CD8+-T-Zellen), die im Transplantat enthalten sind, erkennen nach Chemo-/Strahlentherapie verbliebene Reste des entarteten Empfängergewebes, eradizieren dieses und verhindern somit ein Tumorrezidiv (Graft-versus-Leukämie Reaktion/GvL). Häufig attackieren Spender-T-Zellen (v.a. CD4+-Th1-Zellen) aber auch nicht-malignes Gewebe (z.B. Haut, Leber und Darm), was bis zum Tod des Patienten führen kann (Graft-versus-Host Disease/GvHD). Calcineurin-Inhibitoren wie Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus, die oft schon prophylaktisch verabreicht werden, verhindern über eine unselektive Inhibition aller Mitglieder der NFAT-Transkriptionsfaktorfamilie (Nuclear factor of activated T-cells) die Aktivierung der Spender-T-Zellen. Es folgt eine klinische Besserung der GvHD-Symptomatik, während jedoch der GvL-Effekt ebenfalls supprimiert wird. Bisherige Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe am Mausmodell hatten gezeigt, dass die selektive Inhibition eines NFAT-Familienmitgliedes (NFATc1 oder NFATc2) in den Donor-T-Zellen zu einer signifikanten Besserung der aGvHD bei jedoch erhaltener GvL führt. Es wurde nun der Einfluss des dritten, in Lymphozyten exprimierten NFAT-Mitglieds NFATc3 im Kontext der aGvHD untersucht.
Zur Basisanalyse der neu kreierten Nfatc3fl/fl.Cd4cre- und Nfatc1fl/fl.Nfatc3fl/fl.Cd4cre-Mauslinien erfolgten durchflusszytometrische und Western-Blot-Analysen. Anschließend wurden In-vivo-Untersuchungen unter Verwendung eines etablierten major-mismatch-aGvHD-Modells (H-2b→H-2d) durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass durch eine NFATc3- (+/- NFATc1-) Defizienz direkt ex vivo die CD4+/CD8+-Ratio durch Abnahme der CD4+- hin zu den CD8+-T-Zellen verschoben wird. Auch zeigte sich in den entsprechenden Genotypen eine Abnahme der naiven- und dafür vice versa eine Zunahme der Effektor-T-Zellen. In den wiederholt durchgeführten aGvHD-Versuchen zeigte sich in vivo als Korrelat der (ebenfalls erneut nachgewiesenen) Abnahme des CD4+/CD8+-Quotienten in den Zielorganen eine geringere Expansion der NFAT-defizienten als der wildtypischen T-Zellen. Leider spiegelte sich dies nicht in dem clinical score zur Quantifizierung der aGvHD-Symptomatik wider. Auch das Körpergewicht der Versuchsgruppe nahm rapide ab. Ursächlich hierfür ist – als Korrelat zur direkt ex vivo nachgewiesenen Aktivierungsneigung – ein vermehrter Th1-Shift der NFATc3 (+/-NFATc1-) defizienten T-Zellen.
Eine Inhibierung von NFATc3 – im Gegensatz zu NFATc1 und NFATc2 – ist demzufolge kein sinnvoller Ansatzpunkt für eine mögliche, zielgerichtetere aGvHD-Therapie. Der positive Effekt der reduzierten Proliferationsneigung der NFATc3-defizienten Lymphozyten wird durch deren vermehrte Aktivierungsneigung mit erhöhter Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen zunichte gemacht.
In der modernen Tumortherapie sind Checkpoint-Inhibitoren ein fester Bestandteil. Die Oberflächenproteine PD-L1 und PD-1 stellen die Angriffspunkte dieser spezifischen Therapie dar. Die Datenlage hinsichtlich PD-L1 in HNSCC ist sehr heterogen. Diese Arbeit beschäftigte sich daher mit der Expression von PD-L1 und PD-1 in einem
Kollektiv von 118 Plattenepithelkarzinomen in Larynx und Hypopharynx und einer prognostischen Aussagekraft hinsichtlich mehrerer histopathologischer und epidemiologischer Faktoren. Außerdem wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen der Expression von PD-L1, PD-1 und CD5 als T-Zell-Marker in besagtem Kollektiv untersucht. Die IHC-Färbungen wurden lichtmikroskopisch an tissue micro arrays untersucht. Für
die Auswertung von PD-L1 wurde der bereits etablierte Cologne-Score verwendet, welcher zum einen zunächst erweitert und anschließend zwecks einer fundierten statistischen Auswertung ergänzend modifiziert wurde. Für CD5 und PD-1 wurden eigene Cut-Off-Werte generiert.
48 % der Fälle waren PD-L1+, die Spannweite im Literaturvergleich schwankt zwischen 30 – 90 %. PD-1+ waren insgesamt 31% der Fälle, auch hier zeigen sich deutliche Abweichungen zu den vorliegenden Publikationen. Hinsichtlich der prognostischen Aussagekraft konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem T-Stadium und der PD-L1-Expression aufgezeigt werden. Ob dies Einfluss auf mögliche
Behandlungsstrategien hat, bleibt Gegenstand weiterer Forschung. Auch im Literaturvergleich finden sich wiederholt signifikante prognostische Zusammenhänge, jedoch beziehen sich diese auf differente Faktoren. Ursächlich dafür sind aller Wahrscheinlichkeit nach Diskrepanzen in der PD-L1-Expression sowie deren Schwankungen durch äußere Einflüsse und nicht standardisierte Testverfahren. Es zeigten sich weiterhin Korrelationen zwischen den Markern, welche sich abschließend nicht alle gänzlich herleiten lassen.
Zusammenfassend könnten einheitliche Testverfahren die Datenlage zu PD-L1 und PD-1 homogenisieren, auch mögliche Vortherapien sollten dementsprechend berücksichtigt werden. Allerdings erscheint die prognostische Aussagekraft von PD-L1 und auch von PD-1 insgesamt aufgrund der inkonstanten Expression hochgradig eingeschränkt, sodass
sich in Zukunft vermehrt auf andere Marker konzentriert werden sollte.
Über die Rolle der Neuroinflammation bei Entstehung und Progression der Demenz vom Alzheimer-Typ
(2022)
Die vorliegende Studie bringt neue Erkenntnisse bezüglich der Rolle und Ver-teilung der Mikroglia und der eingewanderten Monozyten im Verlauf der Alz-heimer Erkrankung in postmortem Gehirnen. Im Gegensatz zu Studien an Tiermodellen konnten wir in unserer Kohorte eine nur sehr geringe Beteili-gung myeloischer Monozyten an der AD Pathologie beobachten, so dass man annehmen kann, dass bei Menschen die Immunantwort des Gehirns haupt-sächlich von den hirneigenen Mikrogliazellen getragen wird. Dies wurde an humanem postmortem Hirngewebe bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht unter-sucht.
Zudem konnte gezeigt werden, dass die vulnerablen, früh von Tangles und Plaques betroffenen Hirnregionen auch eine frühe Mikrogliareaktion aufwei-sen und insbesondere von proinflammatorischen Zellen besiedelt werden und dass die Reaktion in manchen Regionen im Verlauf zunimmt, während in an-deren eine Abflachung oder sogar Abnahme beobachtet wird.
Zur Entscheidungshilfe in der Therapiefindung des Mammakarzinoms haben sich bezüglich der Indikation zur Chemotherapie neben den klinischen und histopathologischen Kriterien in den letzten Jahren vorrangig Multigentests etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurden Zusammenhänge zwischen dem Oncotyp DX® und 18 immunhistochemischen Markern aus der Tumorbiologie für 78 Fälle hormonrezeptorpositiver, Her2/neu negativer Mammafrühkarzinome mit niedrigem Lymphknotenstatus untersucht. Es erfolgten immunhistochemische Färbungen an Microtissue-Arrays der Tumorproben. Für die Marker AMACR, Cyclin D1, p53, MDM2 und PDL1 ergab sich eine klare statistisch signifikante Korrelation zum Recurrence-Score®des Oncotyp DX® und mit Einschränkungen auch für CDK4. Die Marker p27, Bcl2 und Glut 1 erreichten ein etwas niedrigeres Signifikanzniveau in der statistischen Analyse. Der immunhistochemische Routinemarker Ki67% zeigte eine hochsignifikante Korrelation mit dem Recurrence-Score®. Hierdurch ergeben sich neue Perspektiven zur Risikostratifizierung des Mammakarzinoms, wie beispielsweise die konsekutive Entwicklung eines immunhistochemischen Scores mit prädiktivem Wert für den Recurrence-Score® mit klinischer Anwendung als Prätest oder als eigenständiges Stratifizierungstool bei Brustkrebs.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2 in NK-Zellen und die Rolle der Faktoren NFATc1-4 und NFAT5 in Keratinozyten analysiert. Die Familie der Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) Transkriptionsfaktoren besteht aus fünf Mitgliedern, welche entscheidend die Gentranskription bei Immunantworten beeinflussen. Nach Antigenaktivierung wird in Lymphozyten die Expression des Nfatc1-Gens stark induziert. Die Akkumulation der dabei gebildeten kurzen Isoform NFATc1/αA ist für die Zytokinproduktion als Effektorfunktion sowie für die Proliferation und das Überleben aktivierter Zellen verantwortlich. Das kurze NFATc1-Protein unterscheidet sich nicht nur strukturell, sondern auch funktionell von fast allen anderen NFAT-Proteinen. Um neue Erkenntnisse über die Funktion der Isoform NFATc1/αA in Lymphozyten zu gewinnen, wurden KT12 NK-Zellen mit NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2- exprimierenden Vektoren transfiziert, geklont, stimuliert und anschließend auf ihre jeweilige Apoptoserate und die Zytokinsynthese bzw. -expression hin untersucht. Die gewählten KT12-Hybridoma-Zellen erwiesen sich allerdings in ihrer intendierten Funktion als Testzellen für die Über-Expression von NFATc-Proteinen in NK-Zellen als ungeeignet.
Fehlregulationen von NFAT-Signalwegen werden mit einer fehlerhaften Entwicklung des Immunsystems, mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und mit Krebs in Verbindung gebracht. Um die Rolle von NFAT-Faktoren in Keratinozyten besser zu verstehen, wurden HaCaT-Zellen und primäre humane Keratinozyten mit Differenzierungssignalen bzw. UVB-Licht stimuliert. Änderungen der Transkription von NFAT-Faktoren, Keratinozyten-spezifischen Proteinen und Chemokinen wurden mittels qRT-PCR-Assays detektiert und analysiert. Insgesamt konnte die Beteiligung von NFAT-Faktoren am Differenzierungsprozess und an der UV-Antwort von Keratinozyten gezeigt werden. Es zeigte sich tendenziell eine stärkere Induktion der kurzen NFATc1-Isoform im Vergleich zu langen NFATc1-Isoformen, was die Frage nach einer besonderen Funktion der kurzen NFATc1-Isoform in Keratinozyten aufwirft. Generell ließen sich besonders hohe Expressionslevel des Transkriptionsfaktors NFAT5 - verglichen mit anderen NFAT-Faktoren - messen. Für die Entwicklung von Therapien, welche die Ursachen und Folgen einer dysregulierten Hautbarrierenbildung behandeln, könnten sich weitere Studien zu einzelnen NFAT-Faktoren bzw. NFATc1-Isoformen als zielführend erweisen.
Intrakranielle Blutungen sind im Säuglingsalter seltene, aber lebensbedrohende Ereignisse. Neben Gefäßmissbildungen, Stoffwechseldefekten sowie Störungen der Blutgerinnung kommen v. a. nichtakzidentielle Traumata, Schütteltrauma in Betracht. Die klinische Diagnostik umfasst hinsichtlich der Blutungsgenese neben Sonographie und MRT als apparatives Verfahren auch eine Fundoskopie sowie laborchemische Analysen, insbesondere der Gerinnungsparameter. Für die Blutgerinnung ist das fettlösliche Vitamin K essenziell: Frühe, klassische und späte Vitamin-K-Mangel-Blutungen werden dabei unterschieden. Um ein gehäuftes Wiederauftreten von Vitamin-K-Mangel-Blutungen bei Neugeborenen und jungen Säuglingen zu verhindern, bedarf es einer hinreichenden Aufklärung der Eltern. Eine Verweigerung der Prophylaxe scheint Folge einer weltanschaulich begründeten Ablehnung der Schulmedizin und ein zunehmendes Phänomen in wohlhabenden Industrieländern zu sein.
Hirntumoren werden nach histologischen und molekulargenetischen Gesichtspunkten unterteilt. Neben dem Krankheitsverlauf unterscheiden sich LGA auch genetisch von GBM. Wie die mRNA der Proteine ATF5, KiSS1, RPS27, BRMS1 und TTK in LGA exprimiert ist bzw. sich im Verlauf verändert, war in dieser Form noch nicht in einem Patientenpanel untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war es, die mRNA-Expressionsraten zu bestimmen sowie Korrelationen und Kointegrationen mit klinischen Daten zu analysieren. Außerdem wurden Besonderheiten der Verteilung innerhalb des Patientenpanels beschrieben. Quantitative-PCR-Analysen wurden durchgeführt. Die Expressionswerte wurden auf die Expression des Haushaltsgens GAPDH normalisiert. Die resultierenden ∆CTm - bzw. ∆∆CT-Werte sowie die klinischen Patientendaten waren Basis für Kointegrations-, Korrelations-, Expressions-, Ähnlichkeits- und Verlaufsanalysen. KiSS1 schien generell kaum oder nicht in der Vielzahl der Tumoren exprimiert zu sein, Aussagen zur klinischen Korrelation erwiesen sich als schwierig. Für RPS27 konnten tendenziell niedrigere Werte in den Verlaufstumoren im Vergleich zu den LGA gefunden werden. Auch für BRMS1 war in der Mehrzahl der Fälle die mRNA der Vorläufertumoren in Relation zu den Rezidiven stärker exprimiert. ATF5 korrelierte nach Kendall RE und PFS (-0,324; p=0,077) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA, für TTK nach Kendall OS und RE (-0,444; p=0,097) im Gesamtpanel und nach Pearson auch RE und PFS (-0,43; p=0,096) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA.
Innerhalb der Gruppe der kutanen T-Zell-Lymphome ist die CD4+ klein-/mittelgroßzellige T-Zell-Lymphoproliferation (SMTCL) eine seltene und bisher als provisorisch erfasste Entität.
Um genauere Kenntnisse zu Klinik und Verlauf, Histologie und Immunphänotyp zu gewinnen, untersuchten wir in dieser Fallserie an 95 Fällen entsprechende Charakteristika. Dabei konnten alle der bisher provisorisch definierten Eigenschaften der SMTCL bestätigt werden. Lediglich die 5-Jahre-Überlebensrate zeigte sich mit 100% weitaus höher als die in der WHO-/EORTC-Klassifikation angegebenen 60–80%. Diese Bestätigung der provisorisch definierten Eigenschaften an einem größeren Kollektiv kann dazu beitragen, dass die SMTCL in die nächste Version der WHO-Klassifikation – durch ausreichende Daten gestützt – als definitive Entität aufgenommen werden kann.
Insgesamt konnten in dieser Studie einige Faktoren, die mit einem weniger indolenten Krankheitsverlauf assoziiert sind, identifiziert werden. So zeigten klinisch ein initial bestehender generalisierter Hautbefall sowie eine extrafaziale Lokalisation der Läsion einen weniger indolenten Verlauf an. Auch Patienten, bei denen ein Verlust von CD2, CD3 oder CD5 bei den Tumorzellen festgestellt wurde, wiesen einen für die CD4+ SMTCL ungewöhnlichen und weniger indolenten Krankheitsverlauf mit häufigeren Rezidiven und seltenerem Erreichen einer kompletten Remission auf. Histopathologisch schien eine oberflächlichere Infiltrattiefe des Präparates sowie das Vorhandensein eines fokalen Epidermotropismus einen negativen prognostischen Wert zu besitzen.
Bezüglich des Gesamtüberlebens hatten allerdings auch Patienten mit einem der identifizierten negativen prognostischen Faktoren eine exzellente Prognose. Bei Vorliegen eines dieser negativen Faktoren sollte jedoch eine engmaschigere klinische Überwachung erfolgen.
In der vorliegenden Arbeit wurden einerseits zelltypspezifische Untersuchungen der mitochondrialen DNA zur Bestimmung der Deletionslast, als Marker für oxidativen Stress, andererseits neuroinflammations-assoziierte Genexpressions-Analysen am humanen post mortem Hirngewebe von Patienten mit unterschiedlichen Stadien der Alzheimer Erkrankung durchgeführt. Als Grundlage hierzu diente das noch nicht gänzlich aufgeschlüsselte Konzept der selektiven Vulnerabilität unterschiedlicher Hirnregionen. Dabei zeigte sich, dass der Hippocampus, eine auf lichtmikroskopischer Ebene sehr früh befallene Region, auch molekularbiologisch deutliche Unterschiede gegenüber resistenten Regionen wie z.B. dem Kleinhirn aufweist.
Bei der postoperativen Therapieplanung des Mammakarzinoms treten immer wieder Entscheidungsgrenzfälle auf, bei denen keine sicheren Argumente für oder gegen eine adjuvante Chemotherapie gefunden werden können. Bei 50 Hormonrezeptor-positiven, Her2/neu-negativen Mammakarzinomen ohne oder mit nur geringer nodaler Metastasierung (max. pT1a) wurde zusätzlich zu den konventionellen klinisch-pathologischen Risikofaktoren der OncotypeDX®-Multigentest veranlasst. In der Tumorkonferenz wurde bereits vor Eingang des Testergebnisses ein Votum für oder gegen eine Chemotherapie auf Basis konventioneller Parameter protokolliert; die definitive Therapieempfehlung erfolgte nach Vorliegen des Multigentest-Ergebnisses.
32 Mammakarzinome (64 %) zeigten einen niedrigen, 26 (32 %) einen mittleren und 3 (6 %) einen hohen Recurrence-Score (RS). In vielen Fällen konnte das OncotypeDX®-Ergebnis eine auf der Basis konventioneller Parameter getroffene Therapieentscheidung stützen. In fünf Fällen wurde eine zunächst favorisierte Entscheidung für eine adjuvante Therapie revidiert. In drei Fällen wurde eine zunächst nicht geplante Chemotherapie empfohlen. Allerdings führte in einigen Fällen auch eine niedrige oder intermediäre Risikokonstellation in der OncotypeDX®-Testung nicht dazu, von einer adjuvanten Chemotherapie abzuraten.
Insgesamt spricht das Ergebnis nicht dafür, einen Multigentest als Standardmethode einzusetzen. Vielmehr sollten zunächst die konventionellen, insbesondere die histopathologischen und immunhistochemischen Parameter mit großer Sorgfalt erhoben und analysiert werden. Im Zweifelsfall und nach Kosten-Nutzen-Abwägung kann ein Multigentest jedoch ein weiteres hilfreiches Argument für oder gegen eine bestimmte Therapieempfehlung liefern.
Das follikuläre Lymphom (FL) wird nach der aktuellen Klassifikation der WHO (World Health Organization Classification of Lymphoid Tumours) anhand der Zahl der Zentroblasten in drei Grade und der Grad 3 weiter in 3A und 3B eingeteilt. Bis heute ist die Rolle der FL3B aufgrund der morphologischen und genetischen Unterschiede zu den anderen FL umstritten, es wird eine eigene Entität und Pathogenese des FL3B diskutiert. Durch das Verbundprojekt „Molekulare Mechanismen in malignen Lymphomen“ (MMML) Daten zu FISH-, Genexpressionsanalysen und immunhistochemischen Färbungen bearbeitet werden.
Diesen Daten zufolge sind FL3B in ihrer Genexpression nicht von FL3A trennbar. Es konnte jedoch eine Abgrenzung der FL1/2 zu den FL3A/B durch die erhöhte Expression von 13 Genen in den FL3A/B gefunden werden, von denen Homolog, double strand break repair nuclease (MRE11A), Topoisomerase II alpha (TOP2A) und Thioredoxin (TXN) schon zuvor im Rahmen von FL und NHL diskutiert wurden.
Follikuläre Lymphome (FL) zählen zu den Non-Hodgkin-Lymphomen und stellen die
größte Untergruppe der B-Zell-Lymphome dar. Bedingt durch ihren meist indolenten
Verlauf werden sie oft erst in einem fortgeschrittenen klinischen Stadium III/IV
diagnostiziert und stellen dann eine systemische Erkrankung dar.
Gelegentlich wird in der histopathologischen Untersuchung eines befallenen
Lymphknotens eine nur partielle Infiltration beobachtet, die häufig auch in den
angeschlossenen Stagingmaßnahmen mit einer nur lokalen Tumorausbreitung (klinisches
Stadium I/II) assoziiert ist. Ein solches lokal begrenztes Stadium kann gemäß der
Standard-Behandlungsprotokolle mit einer alleinigen Strahlentherapie ausreichend
kontrolliert werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum einen, eine mögliche Assoziation einer nur
partiellen Lymphknoteninfiltration beim FL mit einem lokal begrenzten klinischen Stadium
zu untersuchen. Zum anderen sollte die Inzidenz einer nur partiellen Lymphknoten-
Infiltration beim FL bestimmt werden.
Der Vergleich der Studienkohorte mit einer nur partiellen Lymphknoteninfiltration, definiert
als zumindest ein vollständig erhaltener Lymphfollikel, mit der Kontrollkohorte zeigte
einen hochsignifikanten Unterschied: In der Studienkohorte befanden sich 38 von 40 Fälle
(95%) in einem lokalen Stadium, wohingegen die Kontrollkohorte mit vollständiger
Lymphknoteninfiltration nur bei 10 von 49 Patienten (20%) ein lokales Krankheitsstadium
(p<0.001) aufwies.
Um die erhaltenen Ergebnisse zu validieren, wurden alle FL Grad 1-3A aus dem
exemplarischen Jahr 2001 untersucht. Hier zeigte sich in 34 Fällen (11 %) eine nur
partielle Infiltration. In allen 18 Fällen mit mindestens einem vollständig erhaltenen
reaktiven Keimzentrum lag in Übereinstimmung mit der initialen Studienkohorte ein lokales
Krankheitsstadium I/II vor (p<0.001).
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eindrücklich, dass follikuläre Lymphome mit einem nur
partiellen Befall der Lymphknoten häufig mit einem (noch) lokalen klinischen Stadium
assoziiert sind. In diesen Fällen käme eine alleinige Bestrahlung als Therapieoption in
Betracht.
Das Mantelzelllymphom (MCL) gehört zu den aggressiven, mit bislang zur Verfügung
stehenden Therapien nicht heilbaren, Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL). Das MCL
weist eine schlechte Prognose auf. Charakteristisch für das MCL ist die t(11,14)-
Translokation, die das Cyclin D1- Gen betrifft. Darüber hinaus finden sich zahlreiche
weitere genetische Alterationen mit Häufung bestimmter Zugewinne und Verluste von
genetischem Material. Einer der am häufigsten chromosomal zugewonnene Abschnitte
in MCL ist der kurze Arm von Chromosom 7 (7p). In Fällen mit dieser genetischen
Veränderung fand sich das IMP3/IGF2BP3-Gen (Insulin-like growth factor 2 mRNAbinding
protein 3) unter den am stärksten differentiell exprimierten Genen.
In dieser Arbeit konnte in einer immunhistochemischen Analyse eine stark variable
IMP3-Protein-Expression in einer Serie von insgesamt 172 primären MCL gezeigt
werden. Darüber hinaus fand sich in diesem Kollektiv eine signifikante Korrelation der
IMP3-Expression mit der Proliferationsfraktion (Ki67-Immunhistochemie) sowie auch
eine Assoziation mit einer blastoiden Morphologie. Es konnte jedoch letztlich keine
statistisch signifikante Assoziation der IMP-3-Protein-Expression mit einem
chromosomalen Zugewinn von 7p, dem Genort von IMP3, nachgewiesen werden, so
dass hier offenbar auch noch andere Mechanismen für die Regulation eine wichtige
Rolle spielen. In einer darüber hinaus untersuchten Vergleichsgruppe von 20 Fällen von
Lymphknoten mit Infiltraten durch ein small lymphocytic Lymphoma (SLL) zeigte sich
insgesamt nur eine geringe IMP3-Expression.
Der Befund einer vermehrten IMP3-Protein-Expression in einer Teilgruppe von MCL
mit erhöhter Tumorzellproliferation unterstützt die Idee, dass eine Aktivierung des IGFSignalweges
in MCL möglicherweise die Proliferation und biologische Aggressivität
begünstigt. Daher könnte eine therapeutische Manipulation dieses Signalweges
vermutlich eine zukünftige therapeutische Option für das MCL darstellen.
Das Harnblasenkarzinom ist eine der häufigsten malignen Tumorarten weltweit, so dass ständig Fortschritte bei der Behandlung gesucht werden. Obwohl sich in den letzten Jahren die Therapie betroffener Patienten immer wieder verfeinert hat, ist die Prognose der Erkrankung im fortgeschrittenen Stadium schlecht. Das Ziel ist es, durch neue Detektionsmethoden und Therapieansätze die Prognose zu verbessern. CTA und andere spezielle biologische Marker bieten deshalb schon seit Längerem einen hochinteressanten Ansatzpunkt, da sie fast selektiv in Tumorgewebe exprimiert werden. Diese weiterhin als Zielantigene für Immuntherapien zu untersuchen kann zukünftig eine wichtige Säule der Krebstherapie darstellen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Expressionsmuster der CTA MAGE A3 und NY-ESO 1 sowie von STEAP-1 im Harnblasenkarzinom und ihre Korrelation mit pT-Stadium und
Grading immunhistochemisch zu untersuchen. Dafür standen Karzinompräparate von insgesamt 93 Patienten der urologischen Klinik der Universität Regensburg aus dem Zeitraum 1994 bis 2009 für eine retroperspektive Analyse zur Verfügung. Die Präparate stammten von 76 männlichen und 17 weiblichen Patienten, der Median lag bei 68 Jahren. In 79,6 % der untersuchten Schnitte konnte wenigstens ein genanntes Antigen nachgewiesen werden.
Dabei war als Kernergebnis NY-ESO 1 mit 90,3 % Expression in den untersuchten Präparaten am häufigsten vorhanden, im Gegensatz zu anderen Arbeiten.
Bezüglich des Zusammenhangs zwischen Expression und T-Stadium konnte kein statistisch signifikantes Ergebnis erhoben werden. Es wurde allerdings gezeigt, dass starke Expression von NY-ESO 1 mit schlecht differenzierten Tumoren assoziiert war.
Dies darf als eines der Kernergebnisse dieser Arbeit zählen.
Bei MAGE A3 zeigte sich auf das Grading bezogen ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen schlechterem Grading und Expression.
Hinsichtlich der Prognose konnte bei MAGE A3 ein statistisch signifikantes Ergebnis bezüglich starker Färbereaktion und kürzerem progressionsfreien Überleben gezeigt werden.
Auch dies stellen Kernergebnisse dieser Arbeit dar.
Insgesamt stellten sich die untersuchten Marker, besonders MAGE A3, als verstärkt zu untersuchende Prognosefaktoren beim Harnblasenkarzinom dar. Weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet scheinen sinnvoll.
Das kolorektale Karzinom stellt die dritthäufigste Tumorerkrankung weltweit dar. Die Risikofaktoren sind vielseitig und werden in exogene und endogene Faktoren eingeteilt. Eine wichtige Präventionsmaßnahme von Kolonkarzinom ist die komplette endoskopische Koloskopie, die ab dem 55. Lebensjahr empfohlen wird. Der Goldstandard zur Behandlung von Kolonkarzinom ist nach wie vor die chirurgische Tumorresektion mit mikroskopisch nachgewiesener Tumorfreiheit. Eine chirurgische Sanierung der Fernmetastasen, welche am häufigsten in der Leber vorkommen, ist bei betroffenen Patienten anzustreben. Eine adjuvante Chemotherapie wird je nach UICC-Stadium des Tumors durchgeführt. Im Gegensatz zur Behandlung einiger maligner Tumorerkrankungen ist der Einsatz von Antikörpern noch kein fester Bestandteil der Therapie von Kolonkarzinomen.
In dieser Arbeit wurde Untersuchungsmaterial von 41 Patienten mit Kolonkarzinom, die am Universitätsklinikum Würzburg in den Jahren 1997 bis 2012 behandelt wurden, analysiert. Dabei wurden Paraffinschnitte vom Primärtumor, regionalen Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen der einzelnen Patienten mit 2 verschiedenen monoklonalen IgM-Antikörpern, PAT-SM6 und PAT-LM1, gefärbt und mikroskopisch untersucht. Der Antikörper PAT-SM6 wurde aus einem an einem Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert und bindet an eine Isotyp-Form des 'Glucose-Regulated' Protein (GRP)-78PAT-SM6. Als Zielstruktur des PAT-LM1 Antikörpers wurde eine tumorspezifische Form von NONO (Non-POU domain-containing octamer-binding protein) identifiziert (NONOPAT-LM1). Für beide Rezeptor-Isoformen wurde nachgewiesen, dass sie nur auf malignen epithelialen Zellen, nicht aber auf gesunden Zellen exprimiert werden. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PAT-SM6 die Tumorzellen der Lebermetastasen stärker anfärbte als Zellen des Primärtumors. Für die PAT-LM1 Antikörperfärbung wurde ein ähnliches Resultat erzielt. In Bezug auf das Lebensalter der Patienten wiesen die Tumorzellen von älteren Patienten (ab dem 65. Lebensjahr) eine stärkere Antikörperbindung durch PAT-SM6 und PAT-LM1 auf. Interessant war auch die Feststellung, dass die Tumorzellen der Lebermetastasen von verstorbenen Patienten durch PAT-LM1 stärker gefärbt waren als die von zum Untersuchungszeitpunkt noch lebenden Patienten. Die Bindungsunterschiede zwischen PAT-SM6 und PAT-LM1 könnten neue diagnostische und therapeutische Möglichkeiten bei Kolonkarzinomen bieten und somit zukünftig eine individuelle Tumortherapie ermöglichen.
Marginalzonen-Lymphome (MZL) gehören zur Gruppe der indolenten Non-Hodgkin-Lymphome der B-Zell-Reihe, zu denen nach der aktuellen WHO-Klassifikation auch die primär kutane Marginalzonen-Lymphome (PCMZL) zählen. Eine klonale Leicht- und Schwerkettenexpression kann immunhistochemisch speziell in MZL mit sekretorischer/plasmozytoider Differenzierung (unabhängig von ihrer Primärlokalisation) nachgewiesen werden. In Voruntersuchungen war aufgefallen, dass von primär kutanen MZL ungewöhnlich häufig IgG bzw. IgG4 exprimiert wird, während extrakutane MZL auch nach Literaturangaben eine präferentielle IgM-Expression aufweisen. In der hier vorgelegten Arbeit wurde die Prävalenz einer IgG4-Expression an einer großen Kohorte von sekretorisch/plasmazellulär differenzierten MZL untersucht. Hierzu wurde die Immunglobulinschwerkettenexpression an 169 MZL unterschiedlicher Primärlokalisationen immunhistochemisch analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass PCMZL überzufällig häufig IgG exprimieren (78 %, 35/49), wobei der Anteil IgG4-positiver PCMZL mit 54 % (19 von 35) sogar über dem der anderen drei IgG-Subklassen lag (46 %, 16/35). Unter den 120 anderen, nicht kutanen MZL war lediglich ein okuläres MZL positiv für die Schwerkette IgG4.
Ferner wurde an dem in dieser Arbeit näher charakterisierten Kollektiv der PCMZL molekularbiologische Untersuchungen zur Frage einer MyD88 (L265P)-Mutation durchgeführt, die letztendlich in keinem der diesbezüglich auswertbaren 45 PCMZL nachgewiesen werden konnte.
Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ besitzt sehr vielgestaltige Funktionen und ist an Wachstums-und Differenzierungsvorgängen verschiedener Gewebe beteiligt. So fördert es in T-Lymphozyten über Transaktivierung des Il4-Promotors und Repression der TH1-Zytokine IL-2 und IFN-γ die Bildung eines TH2-Phänotyps [Berberich-Siebelt et al. 2000]. Durch Herabregulation von c-Myc bewirkt es einen Zellzyklusarrest in G1 und vermehrte Differenzierung der Zellen auch über eine reziproke Steigerung von Differenzierungsfaktoren wie Mad4 [Berberich-Siebelt et al. 2006]. In einer den G1-Arrest nachweisenden Zellzyklusanalyse von mit C/EBPβ transduzierten EL-4 Zellen zeigte sich daneben ein kleiner Sub-G1-Peak, der auf eine apoptotische Zellpopulation hinweist [Berberich-Siebelt et al. 2006]. Aufgabe dieser Arbeit war es, den möglichen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von C/EBPβ und Auslösung von Apoptose in EL-4 Zellen hinsichtlich seiner Spezifität und dabei favorisierter Signalwege zu untersuchen.
Gegenstand der Untersuchungen waren mit dem C/EBPβ-ERTM-Konstrukt alleine und in Kombination mit dominant-negativen Mutanten der Caspase-3 und der Caspase-9 transduzierte EL-4 Kulturzellen. Durch Einbringen der Caspasemutanten sollte eine kompetitive Hemmung der entsprechenden endogenen Caspasen bewirkt werden. Methodisch erfolgten Apoptosenachweise mittels durchflusszytometrischer Analysen von mit Annexin V-PE und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) gefärbten EL-4 Zellen sowie die Detektion von gespaltener PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase), einem Substrat der Caspase-3 im Western Blot. Des Weiteren erfolgten mittels Ribonuklease-Protektionsanalysen Untersuchungen der RNA-Expression von Zytokinen, Caspasen und von Mitgliedern der Myc- und der Bcl-2-Proteinfamilien, um das Verhalten der Zellen unter Hemmung von Apoptosewegen bzw. Caspasen bei Aktivierung von C/EBPβ näher betrachten zu können.
In Annexin V-PE- und 7-AAD-Färbungen sowie durch Nachweis der spezifischen Spaltung von PARP konnte gezeigt werden, dass C/EBPβ Zelluntergang und Apoptose fördert. Diese war durch den Pancaspaseinhibitor Z-VAD fmk hemmbar, was, wie auch die PARP-Spaltung, auf einen caspaseabhängigen Signalweg hinweist. Hemmung der Caspase-3 durch Transduktion der Zellen mit einer Caspase-3-Mutante besaß kaum Einfluss auf die durch C/EBPβ veränderte Zytokinexpression und die Repression von c-Myc, doch erschien eine vermehrte Hochregulation des Differenzierungsfaktors Mad4, der endogenen Caspase3- und der Caspase11-RNA. Die Steigerung von Caspase-3 unter Aktivierung von C/EBPβ fand sich auch auf Proteinebene. Allerdings konnte eine Hemmung der Caspase-3 bei den untersuchten EL-4 Zellen die durch C/EBPβ vermittelte Apoptose nicht verhindern, was auf andere Apoptosewege oder kompensatorischer Effekte verwies. Durch Beeinflussung des intrinsischen Signalweges mit Hemmung der Caspase-9 zeigten sich ebenfalls kaum Auswirkungen auf die Zytokinexpression der untersuchten Zellen. Hier fanden sich Hochregulationen sowohl der pro- als auch antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Funktionell konnte auch eine Hemmung von Caspase-9 die Zellen nicht vor der Apoptose durch Aktivierung von C/EBPβ bewahren.
So konnte hier gezeigt werden, dass Aktivierung von C/EBPβ in den untersuchten EL-4 Zellen Apoptose fördern kann, dies über eine Aktivierung der Caspasekaskade zu geschehen scheint und mit einer Steigerung endogener Caspase-3-Expression einhergeht. Aus den Untersuchungen dieser Arbeit konnte eine Favorisierung eines bestimmten Apoptosesignalweges nicht abgeleitet werden, da eine Hemmung des intrinsischen Weges die Zellen nicht vor dem Zelltod schützen konnte. Insgesamt lässt sich aber, obwohl nicht alle Details geklärt werden konnten, festhalten, dass C/EBPβLAP in T-Zellen neben Proliferationshemmung und Differenzierungsinduktion auch für Caspase vermittelten Zelltod verantwortlich ist.
Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit, welche durch Infiltration autoreaktiver Immunzellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) gekennzeichnet ist. Hierbei gelten insbesondere Th1- und Th17-Zellen als wichtige Mediatoren der ZNS-Entzündungsreaktion. Beide T-Helfer-Zellarten können durch regulatorische T-Zellen (Tregs) in ihrer Funktion supprimiert werden. NFAT(Nuclear Factors of Activated T cells)-Transkriptionsfaktoren werden nach TCR-Antigen-Stimulation induziert und regeln – als pleiotrope Transkriptionsfaktoren – viele funktionelle Prozesse in T-Zellen. Um die Rolle dieser Faktoren bei der Immunpathogenese von MS zu analysieren, wurden unterschiedliche NFAT-defiziente Mausstämme auf den Krankheitsverlauf des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der einzelne Verlust von NFATc1 und NFATc2 in CD4+ T-Zellen als auch das Fehlen einer spezifischen C-terminalen Proteinmodifikation von NFATc1, die SUMOylierung, sich abmildernd auswirkten. Der verminderte klinische Ausgang der EAE beruhte allerdings je nach knock-out auf unterschiedlichen Mechanismen. Im Fall des T-Zell-spezifischen Verlustes von NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ Mäuse), erwies sich die EAE aufgrund einer stark eingeschränkten Aktivierung und Effektorzellentwicklung von CD4+ T-Zellen als vermindert. Dies konnte durch eine reduzierte Produktion an pathogenen Effektorzytokinen, wie IFNγ, IL-17A, GM-CSF sowie IL-22 und weniger an IL-17A+ IFNγ+ Doppelproduzenten im ZNS gezeigt werden. Der Verlust von NFATc2 resultierte in einer starken Th2-Antwort im ZNS von Nfatc2-/- EAE-Mäusen einhergehend mit protektiven IL-4- und IL-10-Produzenten. Interessanterweise konnten auch mehr nicht-pathogene Th17-Zellen nachgewiesen werden. Nfatc1/CΔSUMO CD4+ T-Zellen sezernierten sowohl nach in vitro als auch nach in vivo Stimulation erhöhte Mengen von IL-2. In vitro Kulturen von Th1- und Th17-Zellen wiesen neben dieser erhöhten IL-2-Sekretion eine verminderte Produktion von IFNγ und IL-17A auf. In Übereinstimmung mit diesen in vitro Befunden zeigte sich auch in der EAE ein reduziertes Krankheitsbild mit weniger Th1- und Th17-Zellen, dafür aber eine IL-2-geförderte Erhöhung der Treg-Population. Anhand der Erkenntnis, dass NFAT-Faktoren die (Auto)-Immunreaktion entscheidend beeinflussen, könnte die Inhibition einzelner NFAT-Faktoren ein neues Ziel für eine MS-Therapie darstellen.
Zur Identifizierung geeigneter Routinemarker für die Prognose von Ependymompatienten führten wir immunhistochemische Untersuchungen und statistische Auswertungen an Ependymomen und Daten von 32 Erwachsenen und 23 pädiatrischen Patienten durch. Davon wurden bei drei Tumoren auch Rezidive untersucht, so dass insgesamt 59 Ependymome in die Untersuchung eingeschlossen wurden. Im Einzelnen handelte es sich um 11 myxopapilläre Ependymome, 6 Subependymome, 19 Ependymome und 23 anaplastische Ependymome. Die größten Fallgruppen bildeten pädiatrische Patienten unter drei Jahren und Erwachsene zwischen 50 und 70 Jahren. Bei Kindern war mit 45,8% die infratentorielle, bei Erwachsenen mit 65% die spinale Tumorlokalisation am häufigsten. Die untersuchten spinalen Ependymome entsprachen zu gleichen Teilen myxopapillären Ependymomen WHO Grad I und Ependymomen WHO Grad II. In supratentorieller Lage fanden sich mit 67% überwiegend anaplastische Ependymome WHO Grad III. Auch bei den infratentoriell gelegenen Ependymomen waren mit 63% die Mehrzahl anaplastische Ependymome, daneben fanden sich 29,6% Ependymome WHO Grad II. Beim Vergleich des von uns definierten und bestimmten Ki67-Scores als Zeichen für die Ependymomproliferation und der immunhistochemischen Positivität für HCK fiel nach Anwendung des Chi-Quadrat-Tests mit p=0,067 ein deutlicher Trend zu schwächerer punktförmiger Positivität bei höherem Ki67-Score auf. Dieser Trend setzte sich in der Erwachsenengruppe separat fort, während er in der Kindergruppe allein nicht nachweisbar war. In der Erwachsenengruppe war mit 28% ein deutlicher Anteil myxopapillärer Ependymome vorhanden, welche bei den Kindern nur 8% ausmachten.Möglicherweise spielt die veränderte HCK-Expression in der Subgruppe der myxopapillären Ependymome eine Rolle. Unsere Untersuchungen zeigten außerdem mit p=0,057 einen deutlichen Trend zu längerem Überleben bei immunohistochemischer DBC1-Negativität. Die Multivarianzanalyse mittels Cox-Regression wies eine Positivität für DBC1 als unabhängigen Risikofaktor für eine kürzere Überlebenszeit nach. Des Weiteren konnte eine mit p=0,013 signifikante Korrelation zwischen immunhistochemischer Positivität für DBC1 und höherem Ki67-Score gezeigt werden. Auch mit höherem WHO-Grad korrelierte die DBC1-Positivität mit p=0,009. Besonders infratentoriell gelegene Ependymome zeigten DBC1-Reaktivität. Hier treten bekannterweise häufiger anaplastische Ependymome mit höherem Proliferationsindex auf. Unsere Ergebnisse legen somit die Eignung des Markers DBC1 als immunhistochemische Routineuntersuchung für die Beurteilung der vom Resektionsstatus unabhängigen Prognose und Überlebenszeit von Ependymompatienten nahe.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Expressionshäufigkeiten von MAGE-A-Antigenen, E -Cadherin, Laminin-5-gamma-2, MMP2 und MMP9 in Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich untersuchen. Hierbei findet der Vergleich zwischen Primärtumoren und korrespondierenden Lymphknotenmetastasen besondere Beachtung. Um die Hypothese zu verifizieren, dass die o.g. Parameter einen signifikanten Einfluss auf die Progression und Metastasierung haben, wird der Zusammenhang zwischen den in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnissen und diversen klinischen Parametern mittels Korrelationsanalyse untersucht.
In Lymphozyten wird nach Antigenaktivierung die Expression des Nfatc1-Gens durch Aktivierung des P1-Promoters stark induziert. Dagegen ist die, durch den Promoter P2 vermittelte Expression ebenso wie die der anderen NFAT Faktoren c2 und c3 konstitutiv. Die Akkumulation der dabei gebildeten Isoform NFATc1/αA ist sowohl für Effektorfunktionen wie die Zytokinproduktion sowie die Proliferation und das Überleben der aktivierten Zellen wichtig (Chuvpilo et al., 2002). Um die Expression des Nfatc1-Gens auf Einzelzellebene messen zu können, wurden BAC (bacterial artificial chromosom) transgene Mauslinien generiert, die einen 210kb großen Bereich des Nfatc1-Gens der Maus enthalten. In diesen Lokus wurde ein eGFP-Reportergen innerhalb des allen Isoformen gemeinsamen, dritten Exons integriert. In dieser Arbeit wird durch semiquantitative RT-PCR-Experimente von Gesamt-Milzzellen und TLymphozyten gezeigt, dass in den B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen die Expression der eGFP-cDNA analog zum endogenen Nfatc1-Lokus der Kontrolle der beiden Promotoren P1 und P2 unterliegt. In Western Blot Experimenten wird in diesen Zellen mittels eines NFATc1α-spezifischen Antikörpers eine induzierbare und CsA-sensitive α-GFP-Isoform - vergleichbar mit der endogenen NFATc1α-Isoform - nachgewiesen. Gleichzeitig zeigen NFATc1-Antikörper das konstitutiv exprimierte GFPβ-Protein. Die Korrelation der Expression von NFATc1 und GFP auf mRNA- und Proteinebene machen in B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen das GFP-Protein somit zu einem sensitiven und spezifischen Marker der NFATc1-Aktivität. In FACS-Analysen gibt der Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität bei Stimulation von Gesamt- Milzzellen bzw. T-Lymphozyten um bis auf das Dreifache die Induktion von NFATc1 wider. Unter dem Einfluss von CsA verbleibt die GFPFluoreszenzintensität auf dem Niveau unstimulierter Zellen. Die GFPFluoreszenz korreliert darüber hinaus bei Primärstimulation mit der Expression des IL-2-Gens, dessen Promotor mit 5 NFAT-Bindestellen den Prototyp eines NFATc1-Targets darstellt (Serfling et al., 1989). Die Analyse der Koexpression von NFATc1 und GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt in allen stimulierten, GFP-positiven CD4+-Lymphozyten die nukleäre Lokalisation von 75 NFATc1, vor allem von NFATc1α. Die Analyse des GFP-Phänotyps in alloreaktiven T-Zellen zeigt bei Abstoßungsreaktionen in vitro („Mixed Lymphocyte Reactions“) eine selektive Zunahme der Fluoreszenz dieser Zellen um bis auf das Vierfache, was die Rolle von NFATc1 für die Effektorfunktion aktivierter T-Lymphozyten verdeutlicht. GFP und das endogene NFATc1 werden bei Stimulation konventioneller T-Zellen (Tcons, CD4+CD25-FoxP3-) stark exprimiert, während natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs, CD4+CD25+FoxP3+) konstant geringe NFATc1- und GFP-Konzentrationen zeigen. In induzierten regulatorischen T-Lymphozyten (iTregs) supprimiert TGF- β konzentrationsabhängig die GFP-Fluoreszenz bis auf das Niveau unstimulierter Lymphozyten. Während in nTregs die Suppression des Nfatc1- Gens im wesentlichen durch FoxP3 erfolgt (Torgerson et al., 2009), scheint dies in iTregs vor allem über den TGF-β Signalweg vermittelt zu werden. Die Analyse der GFP-Expression in den verschiedenen Stadien der TZellentwicklung zeigt weiterhin deutliche Unterschiede in der Aktivität des Nfatc1-Gens. Dies wird durch die starke Aktivität des BAC-Genlokus in CD4- CD8- DN Thymozyten, welche eine sechsfach höhere GFP-Expression aufweisen als CD4+CD8+ DP Zellen, deutlich.
Die Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Strukturen ist eine grundlegende Herausforderung der spezifischen Immunantwort. Pathologische Veränderungen dieser Abgrenzung können zu schwerwiegenden Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Diabetes Mellitus, Rheumatischer Arthritis oder Multipler Sklerose führen. Um unerwünschte (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern, existieren verschiedene Formen von peripheren Toleranzmechanismen, die durch viele Transkriptionsfaktoren wie z. B. ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells) und Foxp3 (forkhead box protein p3) kontrolliert werden. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) sind spezialisierte immun-suppressive Lymphozyten, welche die Aktivierung anderer Immunzellen unterdrücken können. Einer der möglichen Mechanismen ist der Transfer zyklischen Adenosin-Monophosphats (cAMP) von Tregs in konventionelle T- und B-Lymphozyten. Die erhöhte intrazelluläre Konzentration an cAMP führt in Effektorzellen zur Induktion und Kerntranslokation von ICER. Der transkriptionelle Repressor ICER supprimiert die Expression vieler NFAT-regulierter Gene und hemmt darüber hinaus die Induktion der NFATc1/αA-Isoform selbst. Diese Isoform wird speziell in pro-inflammatorischen Effektorzellen hochreguliert und ist maßgeblich an deren spezifischem transkriptionellen Programm beteiligt. Foxp3 ist ein zentraler Faktor für die Bildung und Funktion sowohl Thymus-generierter nTregs als auch peripher (TGFβ-) induzierter iTregs. Die Kontrolle des Foxp3-Gens wird in iTregs – überraschenderweise aber nicht in nTregs – durch NFAT-Faktoren reguliert. Allerdings hemmt Foxp3 durch eine negative Rückkopplung wiederum die Induktion und Aktivität von NFATc1/αA. Dies stellt somit ein weiteres Regulativ dar, wobei Foxp3 nicht nur die Plastizität, sondern auch die Funktion von immun-suppressiven T-Zellen steuert. Zusätzlich regulieren die verschiedenen NFAT-Faktoren auch die Antigen präsentierenden dendritischen Zellen (DCs). Während NFATc1 und NFATc2 die Differenzierung und Proliferation von DCs beeinflussen, reguliert NFATc3 deren Zytokinexpression und steuert indirekt auch die nachfolgende T-Zell-Immunantwort. Die Kontrolle der Genregulation in Immunzellen durch die Transkriptionsfaktoren ICER, NFAT und Foxp3 erfüllt somit spezifische Funktionen der Immunität, reguliert aber gleichzeitig wichtige Aspekte der peripheren Toleranz, um schädliche (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern.
Der menschliche Organismus ist zeitlebens von malignen Neoplasien bedroht, die durch lokales oder metastasiertes Wachstum lebensnotwendige Funktionen des Körpers beeinträchtigen können. Als wichtigstes Werkzeug zur Abwehr dieser Neoplasien wurde in den letzten Jahrzehnten die natürliche Immunität aufgedeckt. Besonders die Antikörper der innaten Immunität spielen eine entscheidende Rolle. BARB-4 ist ein humaner, tumorspezifischer Antikörper und Teil dieser natürlichen Immunität. Er wurde mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem Patienten mit Siegelringkarzinom des Magens isoliert, und ist einer der wenigen Vertreter innater humaner IgG Antikörper. Diese Arbeit gibt einen ersten Überblick über die Bindungsspezifität und die funktionellen Eigenschaften des BARB-4-Antikörpers. In den immunhistochemischen Färbungen konnte die Tumorspezifität des Antikörpers nachgewiesen werden. Bei dem zugehörigen Antigen handelt es sich um eine Variante des TAF15, einem Protein der FET-Familie, die intrazelluläre Aufgaben bei Transkriptionsvorgängen haben, bei denen zudem aber auch eine Beteiligung an Adhäsions- und Migrationsvorgängen vermutet wird. Diese Variante ist bei malignen Zellen an der Oberfläche lokalisiert, was die Ergebnisse der Durchflußzytometrie belegen. Durch konfokale Mikroskopie mit Fluoreszenz-markiertem BARB-4 konnte diese Oberflächenbindung an Tumorzellen bestätigt werden. Im weiteren zeitlichen Verlauf konzentrierte sich der Antikörper im Zellinneren. Die Präsenz des Antikörpers führte bei Versuchen mit Tumorzellen zu einer bemerkenswerten Hemmung der Adhäsions- und Migrationsfähigkeit der Zellen. Beide stellen Schlüsseleigenschaften für die Metastasierung von Tumorzellen dar. Diese Eigenschaften könnten BARB-4 für einen möglichen, therapeutischen Einsatz zur Prävention von Tumormetastasen qualifizieren.
Zervikale Lymphknoten stellen einen typischen Manifestationsort des klassischen Hodgkin-Lymphoms dar. Eine primäre extranodale Manifestation dieses Tumors wird in der Mehrheit der wissenschaftlichen Berichte als selten angesehen. Diese Dissertation hatte zum Ziel, möglichst viele Fälle mit dem speziellen Krankheitsbild eines klassischen Hodgkin-Lymphoms mit primär extranodaler Manifestation im Kopf-Hals-Bereich zu analysieren. Anhand der ermittelten Ergebnisse sollten Antworten auf bislang offene Fragestellungen gegeben werden. In der ersten Datenerhebungsphase wurde eine umfangreiche Analyse der bislang zu dieser Thematik veröffentlichten deutsch- und englischsprachigen Fachliteratur durchgeführt. Aus den Jahren 1924 bis 2010 konnten 103 einzeln aufgelistete Patienten ermittelt werden. Diese geeigneten Fallberichte wurden mit allen verfügbaren Einzelheiten zu histologischen, epidemiologischen und klinischen Befunden tabellarisch dokumentiert. In der zweiten Phase der Datenerhebung wurde am Lymphknotenreferenzzentrum des pathologischen Institutes der Julius-Maximilians-Universität Würzburg ein eigenes Patientenkollektiv ermittelt. Von 1999 bis zum Jahr 2008 konnten 21 Patienten analysiert werden. Auch dieses Kollektiv wurde auf histologische, epidemiologische und klinische Parameter untersucht. Die herausgearbeiteten Ergebnisse der 124 Patienten wurden in allen Einzelheiten diskutiert und die eingangs aufgestellten Fragestellungen abschließend beantwortet.
Knochensialoprotein (BSP) ist ein Protein der extrazellulären Matrix im Knochen und mineralisierten Geweben, wird aber auch von verschiedenen Tumorzellen exprimiert (Bellahcene et al., 1994, 1997, 1998). Dies ist assoziiert mit einer schlechten Prognose und einem erhöhten Risiko für eine spätere Entwicklung von Knochenmetastasen. Diel et al. (1999) konnte zeigen, dass ein erhöhter Serum-BSP-Wert bei Patientinnen mit Mammakarzinom zu einem gehäuften Auftreten von Knochenmetastasen im Laufe der Erkrankung führt. BSP scheint ein Marker für die Entstehung von Knochenmetastasen zu sein. In der Literatur ist ein Antikörper beschrieben, der ein Epitop des BSP erkennt, welches im BSP aus Tumorzellen nicht glykosyliert ist, im BSP aus mineralisiertem Gewebe allerdings schon (Armbruster et al., 2009). Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass Knochenmetastasen verhindert werden können bei gleichzeitiger Gabe von Tumorzellen und Antikörpern gegen BSP beziehungsweise, dass bei vorhandenen Knochenmetastasen eine Behandlung der Tiere mit einem Anti-BSP-Antikörper die Metastasen zurückbildet (Bäuerle et al., 2005, 2006). In der aktuellen Arbeit wird die Expression von BSP an menschlichem Gewebe von Knochenmetastasen mit unterschiedlichen Primärtumoren mittels Immunhistochemie untersucht. Insgesamt wurden 35 Fälle von Knochenmetastasen mit Primärtumor eines Mammakarzinoms untersucht, wobei 22,9% eine BSP Expression aufweisen, davon 5,7% eine starke. Knochenmetastasen mit dem Primärtumor Prostatakarzinom sind mit 8 Fällen repräsentiert, wobei 75% positiv für BSP sind, davon 25% stark positiv. Die einzelnen Fälle zeigen eine starke BSP Expression im Stroma und eine schwache BSP Expression der Tumorzellen. Diese Ergebnisse des Antikörpers gegen normal glykosyliertes BSP wurden verglichen mit dem Antikörper gegen nicht glykosyliertes BSP. Der Nachweis von BSP in Tumorzellen zeigt dasselbe Ergebnis, BSP im Stroma wird durch den Antikörper gegen nicht- glykosyliertes BSP intensiver dargestellt. Daraus lässt sich folgern, dass der Antikörper gegen nicht- glykosyliertes BSP nicht spezifisch für die Isoform des BSP aus Tumorzellen ist, sondern gleichermaßen in der Routinediagnostik von BSP eingesetzt werden kann. Die Untersuchung könnte sogar darauf hinweisen, dass dieser Antikörper die nicht- glykosylierte Isoform im Stroma erkennt und damit bei Untersuchung des Stromas die bessere Alternative darstellt.
Die vorliegende Arbeit entstand durch die Notwendigkeit, den Histopathologiekurs der Zahnmedizinstudierenden an der Universität Würzburg u.a. wegen verbrauchter Präparate neu zu konzipieren. Nach der Anschaffung eines Präparatescanners lag es nahe, zeitgemäße multimediale Lernmethoden und virtuelle Mikroskopie in den Studierendenkurs einzuführen. Nun gibt es ein Online-Projekt, in welchem kursbegleitend virtuell mikroskopiert werden kann. Ein solches Projekt existierte vorher, speziell den Bedürfnissen der Würzburger Zahnmedizin-Studierenden angepasst, nicht und stellt daher eine Innovation dar. Im Falle des Würzburger Histopathologiekurses wurden erst vorhandene Online-Projekte anderer Universitäten miteinander verglichen und besonders positive Aspekte herausgearbeitet. Diese sollten in das eigene Projekt übernommen werden. Unter Berücksichtigung studentischer Wünsche wurden daraufhin neu zusammengestellte Präparate eingescannt und auf eine Onlineplattform gestellt. In der retrospektiven Evaluation hielten die Studierenden das Angebot einer virtuellen Mikroskopiermöglichkeit für eine ausgezeichnete und ausbaufähige Lernergänzung und sind bereit, diese kursbegleitend zu nutzen. Die virtuelle Mikroskopie stellt das ideale Werkzeug für multimediale Lernangebote in der medizinischen Hochschulausbildung im Fach Pathologie dar.
Viele humane Sarkome sind durch spezifische chromosomale Translokationen oder typische genetische Amplifikationen definiert, welche in der Differentialdiagnostik insbesondere in Fällen, bei denen klinische Daten, Morphologie und Immunhistochemie alleine nicht ausreichend wegweisend sind. Die Formalin-fixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE-) Gewebe von 15 Ewing-Sarkomen, 4 Klarzellsarkomen, 9 Synovialsarkomen, 4 alveolären und 7 embryonalen Rhabdomyosarkomen und 25 Liposarkomen verschiedenen Subtyps wurden mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) untersucht um ein Sarkom-spezifisches FISH-Sondenset zur Detektion spezifischer chromosomaler Aberrationen in der Routinediagnostik zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass die FISH in diesem Aufgabenfeld im Vergleich zur PCR ebenfalls eine hoch effiziente zytogenetische Methode mit hoher Spezifität und hohen positiven Vorhersagewerten mit dem Vorteil der unproblematischen Anwendung an FFPE-Geweben ist. Zur Detektion des Isochromosom 12p , i(12p), als Beispiel für komplexere chromosmale Aberrationen, wurden 7 FFPE-Gewebe aus Keimzelltumoren mit 12p- und 12q-detektierenden FISH-Sonden hybridisiert. Die Detektion des i(12p) konnte im Rahmen dieser Arbeit mittels FISH nicht erreicht werden. Zusammenfassend ist die FISH eine hoch effiziente zytogenetische Methode zur Detektion spezifischer chromosomaler Aberrationen in FFPE-Geweben aus humanen Sarkomen mit hoher Eignung zur Anwendung in der Routinediagnostik.
Ziel dieser Arbeit war es, die telepathologische Zusammenarbeit mit einem Krankenhaus eines medizinisch unterentwickelten Landes zu überprüfen und zu bewerten. Für die Untersuchungen wurden die Daten von 545 Patienten aus Peramiho/Tansania übermittelten Fälle analysiert. Dabei wurden die telepathologisch erstellten Diagnosen anhand der nachträglich nach Würzburg übersandten Paraffinblöckchen der Gewebeproben und dort erfolgten Nachbegutachtung nach deutschen Standards überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass der Einsatz telepathologischer Techniken für die Unterstützung unterentwickelter Länder geeignet ist und die Qualität der medizinischen Versorgung langfristig verbessert.
Orale Plattenepithelkarzinome entwickeln sich häufig aus Präkanzerosen. Trotz der Frühdiagnostik ist es für den Kliniker und den Pathologen meist schwierig eine Präkanzerose, die zur Entartung neigt, rechtzeitig als solche zu erkennen. MAGE-A-Antigene sind Tumorantigene, die nur in malignen Zellen vorkommen. Diese Antigene können dazu dienen, Karzinome früher als solche zu erkennen. Das Ziel dieser Studie war, diese Hypothese zu bestätigen, indem gutartige, präkanzeröse und karzinomatöse Veränderung untersucht wurden. Dazu wurden retrospektiv Biopsien der oralen Schleimhaut (orale Ulzera, Epulitiden, follikuläre Zysten, Lichen planus, Leukolakien, epitheliale Dysplasien und Carcinomata in situ) untersucht. Diese wurden immunhistochemisch mit dem polyklonalen Antikörper MAGE-A 57B angefärbt. Dabei stellte sich heraus, dass MAGE-A-Antigene nicht in gutartigen Veränderungen vorkommen, jedoch zu 33-65% in präkanzerösen und malignen Läsionen. Ein weiteres Ziel umfasste die Untersuchung der kritischen Randbereiche. Hier wurde bei den positv gefärbten Präparaten eine eindeutige Grenze zwischen benigner und maligner Schleimhaut durch die Anfärbung mit mAb-57B sichtbar.
Natalizumab ist ein monoklonaler gegen alpha 4-Integrine (CD49d) gerichteter Antikörper, der zur Therapie der schubförmigen Multiplen Sklerose zugelassen ist. Sein Hauptwirkmechanismus beruht auf einer Blockade von VLA-4 (CD49d/CD29) auf Leukozyten, deren Extravasation an der Blut-Hirn-Schranke hierdurch gehemmt wird. Gemäß seiner Konzeption sollte Natalizumab neben seiner blockierenden Eigenschaft keinen weiteren Einfluss auf seine Zielzellen ausüben. Der hohen therapeutischen Effektivität stehen jedoch Begleiterscheinungen gegenüber, die auf direkte oder indirekte immunmodulatorische Kapazitäten von Natalizumab hindeuten. In verschiedenen Studien konnten VLA-4, sowohl durch Antikörper- als auch durch Liganden-vermittelte Aktivierung, Eigenschaften als kostimulatorisches Molekül humaner T-Zellen zugewiesen werden. Ob der Antikörper Natalizumab auf VLA-4 rein blockierend wirkt oder ob er (ko-)stimulatorische Signale in T-Zellen induziert, ist bis heute unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurden RNA-Expressionsanalysen von humanen CD4+ T Zellen mittels Microarrays durchgeführt. Tatsächlich konnte eine erhöhte Expression der Gene IL2 und IFNG sowie der Th17-Effektorzytokine IL17A, IL17F und IL21 durch Anwesenheit von Natalizumab festgestellt werden. Ebenfalls wurde eine gesteigerte Genexpression der Transkriptionsfaktoren FOXP3, TBX21 und RORC beobachtet. Die erhöhte Genexpression von IL2, FOXP3, TBX21 und RORC wurde mittels qRT-PCR validiert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden verschiedene Effektorzytokine durchflusszytometrisch untersucht. Hierbei zeigten neben IL2 die Interleukine IL17 und IFNγ eine erhöhte Syntheserate unter dem Einfluss des therapeutischen Antikörpers. Die Allgemeingültigkeit des kostimulatorischen Effekts wurde anhand der Fähigkeit von Natalizumab verschiedene T-Zellstimuli zu verstärken verdeutlicht. Die Ergebnisse belegen eine direkte Korrelation zwischen der Anwesenheit von Natalizumab und der Ausbildung proinflammatorischer IL2+, IL17+ und IFNγ+CD4+ T-Zellen in vitro und deuten u.a. auf eine verstärkte Polarisierung naïver CD4+ T-Zellen in Richtung Th1- und Th17-Zellen hin. Übereinstimmend mit direkten immunmodulatorischen Eigenschaften über Bindung und Aktivierung von VLA-4 resultierte die Anwesenheit von Natalizumab nicht nur bei Jurkat-Zellen sondern auch in primären humanen CD4+ T-Zellen in einer erhöhten ERK-Phosphorylierung. Weiterhin konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Gabe des Therapeutikums und der CD49d-Reduktion auf humanen CD4+ Effektorzellen bzw. CD4+ Gedächtnis-T-Zellen in vitro hergestellt werden. Dieses Resultat erhärtet den Verdacht, dass es sich bei dem Verlust an VLA-4 auf verschiedenen Leukozytenpopulationen, der bereits in mehreren Studien in vivo beobachtet werden konnte, um eine direkte Auswirkung von Natalizumab handelt. Die in vitro an isolierten T-Zellen von gesunden Spendern gewonnenen Resultate konnten anhand von Zellen aus MS-Patienten reproduziert werden. Bereits 24h nach Natalizumab-Erstgabe wurde sowohl eine deutliche Reduktion an CD49d als auch eine erhöhte IL2-, IL17-, IFNγ- und IL12/IL23p40-Sekretion nachgewiesen. Das unterstreicht die klinische Relevanz dieser Ergebnisse und lässt vermuten, dass Natalizumab neben der Hemmung der Leukozyten-Transmigration ins ZNS Signal-gebende Eigenschaften besitzt, die zu ungewünschten Nebenwirkungen führen können.
Bei vielen Karzinomen spielt EGFR und das KRAS-Onkogen eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung. Da bei den seltenen Karzinomen an Kopfspeicheldrüsen sehr wenig über molekulare Mechanismen der Tumorgenese bekannt ist, war es das Ziel der Arbeit den EGFR-Signalweg zu untersuchen. Es wurden Paraffinschnitte von 43 Speicheldrüsenkarzinomen von den Typen ACC, MEC und Adeno-Ca NOS mit dem phosphorylierten EGFR-Antikörper gefärbt und mit klinisch-pathologischen Daten korreliert. Weiterhin wurde eine Mutationsanalyse der kras-Gensequenz durchgeführt. In allen Fällen war das kras-Gen vom Wildtyp. Bei der Expressionsanalyse von EGFR stellte sich heraus, dass 79% der Proben einen aktivierten EGF-Rezeptor besitzen. Statistisch signifikante Korrelationen gab es zwischen der EGFR-Expression und dem Patientenalter, dem zervikalen Lymphknotenbefall und der Tumorgröße. Der EGF-Signaltransduktionsweg ist bei den untersuchten Karzinomen der Kopfspeicheldrüsen im überwiegenden Masse aktiviert, ohne dass eine autonome Aktivierung beim KRAS-Onkogen vorliegt.
Das Follikuläre Lymphom (FL) ist nach dem Diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) das häufigste Non-Hodgkin-Lymphom in der westlichen Welt. Die aktuelle WHO-Klassifikation für Tumoren der Hämatopoetischen und Lymphoiden Gewebe aus dem Jahr 2008 unterteilt dieses maligne Lymphom nach Histologie und Wachstumsmuster in vier Gruppen, FL 1 bis FL 3A und FL 3B. Obwohl die FL 1 und FL 2 zu den indolenten Tumoren gezählt werden, und FL 3A und FL 3B tendenziell eher als aggressiv gelten, so wurde in einigen Studienarbeiten gezeigt, dass das FL 3A aufgrund seiner immunhistologischen und genetischen Charakteristika, insbesondere dem Vorhandensein der BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21) Translokation, eher den low-grade-Lymphomen (FL 1 und FL 2) nahe steht, während das FL 3B durchaus Eigenschaften des DLBCL, wie das Fehlen einer BCL2/IGH-Translokation und das vermehrte Auftreten von Aberrationen des BCL6-Gens, zeigt. In verschiedenen Arbeiten wurde des Weiteren eine Einteilung in reine FL 3B und FL 3B mit Anteilen eines DLBCL (+ DLBCL) vorgenommen, da sich auch diese beiden Subgruppen durch unterschiedliche Proteinexpression und genetische Eigenschaften auszeichnen würden. Laut den bislang in der Literatur vorliegenden (spärlichen) Daten zeigen FL 3A und FL 3B unterschiedliche Antigen-Profile und offenbar auch unterschiedliche (primäre) genetische Veränderungen, wobei gerade für das FL 3B nur wenige Daten vorliegen. Während Grad 3A-Tumoren einige Ähnlichkeiten zu den FL 1 und 2 zeigen, scheint das FL 3B im Immunphänotyp wie in der Genetik eher dem DLBCL zu ähneln. Allerdings lässt sich bei kritischer Durchsicht der Literatur erkennen, dass die meisten Fälle eines FL Grad 3 entweder gar nicht den Graden 3A oder 3B zugeordnet, beziehungsweise in diese unterschieden wurden, oder häufig bereits einen zusätzlichen diffusen Wachstumstyp aufweisen, nach den Regeln der WHO-Klassifikation für Tumoren der Hämatopoetischen und Lymphatischen Gewebe (2008) also als DLBCL mit einem zusätzlichen follikulären Wachstumsanteil klassifiziert würden. Somit sind die Daten insbesondere über die rein follikulär wachsenden FL 3B äußerst spärlich. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der immunhistochemischen und genetischen Charakterisierung der FL 3B. Von besonderem Interesse war die Bestimmung der Häufigkeit der BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21), BCL6/IGH t(3;14)(q27;q32) und MYC/IGH t(8;14)(q24;q32) Translokationen in den verschiedenen Typen der FL. Weiterhin sollte der Frage nachgegangen werden, ob die Anwendung der Tissue Microarray (TMA)-Technik und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) an TMAs robuste Daten zu dieser Fragestellung liefern kann. In einem ersten Schritt wurden vorhandene TMAs von FL, DLBCL und MALT-Lymphomen mit break-apart-Sonden für BCL2, BCL6, MYC und IGH hybridisiert, und die gewonnenen Ergebnisse mit Daten der konventionellen Zytogenetik abgeglichen. Hierdurch sollte nachgewiesen werden, dass die FISH in Kombination mit der TMA-Technik eine valide Testmethode zur Aufdeckung der gesuchten chromosomalen Aberrationen darstellt, die in Sensitivität und Spezifität der klassischen Zytogenetik nicht nachsteht. In einem zweiten Schritt wurden FL aus dem Archiv des Pathologischen Instituts der Universität Würzburg anhand der aktuellen WHO-Kriterien in die Grade 1, 2, 3A und 3B eingeteilt (und reklassifiziert). Diese Tumoren wurden im TMA und im Vollschnitt durch immunhistochemische Färbungen auf ihre Protein-Expression und mittels FISH auf ihre genetischen Eigenschaften untersucht und charakterisiert.
In der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die in Routineverfahren eingebettet und nach Standardmethoden gefärbt wurden. SHARP-Screening beinhaltet zwei komplementäre Schritte: Zuerst erfolgte die Erstellung einer Genbank aller bakteriellen Gene aus der gesamten extrahierten DNA des analysierten Gewebes durch gezielte Amplifikation des 16S-rRNA-Gens mittels universeller eubakterieller Primer. Als zweiter Schritt wurde nach der Transformation mittels Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus die Selektion der jeweiligen unterschiedlichen Phylotypen der enthaltenen 16S-rRNA-Gene durchgeführt (insgesamt 400). Nach der Sequenzierung wurden die 16S-rRNA-Gene durch den Vergleich mit bekannten bakteriellen Sequenzen mit Hilfe des „Basic-Local-Alignment-Search-Tool“ (BLAST) identifiziert. SHARP-Screening hat sich als geeignete Methode zur Analyse der gesamten, in einer Gewebeprobe enthaltenen bakteriellen Flora erwiesen. Dabei wurden zum Teil andere Erreger gefunden, als aus dem histologischen Bild vermutet wurden. So konnte zum Beispiel mit dem Nachweis von Gluconacetobacter sacchari, als potentieller Erreger einer septischen Granulomatose, eine alternative Differentialdiagnose zur histologisch vermuteten Katzenkratzkrankheit aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnten auch gleichartige histologische Bilder bei dem gleichen identifizierten Erreger beobachtet werden. Zum Beispiel konnten im Zusammenhang mit dem Auftreten von Ödemen, Nekrosen, granulomatös eitrigen Veränderungen und einer ausgeprägten Sinus-histiozytose im Lymphknotengewebe immer wieder Comamonadaceae bzw. Janthinobacterium nachgewiesen werden. Oft zeigte sich nicht ein einzelner Erreger der Lymphadenitis, sondern ein ganzes Spektrum, wobei aus dem Vorhandensein der 16S-rRNA nicht auf das Vorhandensein vitaler Erreger geschlossen werden kann. Dennoch erlaubt die Häufigkeit der entsprechenden Klone eine semiquantitative Abschätzung der Bedeutung des jeweiligen Erregers. So wies SHARP-Screening auch Homologien zu Paracoccus yeeii nach. Eine Spezies, die mit klassischen Methoden häufig übersehen wird, die in Lymphknoten jedoch eine pathogene Rolle spielen kann. Im Zusammenhang mit dem histologischen Verdacht auf ein Malignom wurden in einigen Fällen Streptomyces, Roseomonas gilardii rosea und Stenotrophomonas maltophila nachgewiesen, die auch in der Literatur häufig bei immunsupprimierten Patienten vorkommen. Bei dem Verdacht auf ein Lymphgranuloma venerum wurde eine Cyanobacterium-Spezies detektiert, die es nach Literaturangaben Chlamydia trachomatis erst möglich macht, den eigenen Aminosäurestoffwechsel zu betreiben. Insgesamt dürften vom SHARP-Screening noch weitere tiefgreifende Erkenntnisse der bakteriellen Diversität und kausaler Erregerassoziationen in Erkrankungen des lymphatischen Systems zu erwarten sein.
Basierend auf die vorangegangene Studie der Abteilung für Neuropathologie des Pathologischen Instituts der Universität Würzburg, in der genetische Aberrationen auf dem Chromosom 9 in Ependymome beschrieben wurden, sollte eine Screeninguntersuchung des gesamten Chromosoms sowie eine verfeinerte Analyse der zuvor auffälligen Regionen erfolgen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mögliche Tumorsuppressorgene oder Onkogene, die mit der Entstehung oder Progression von Ependymome verbunden sind, zu definieren. Weiterhin sollte eine Korrelation zu den klinischen Daten erfolgen. Dabei konnte bei erwachsenen Patienten gezeigt werden, dass Aberrationen auf Chromosom 9 die Prognose verbessern. Speziell der Marker D9S1872 bei DCR1 (DBCCR1) zeigte einen Trend zu einem Überlebensvorteil bei Erwachsenen. Deshalb könnte er in Zukunft zur prognostischen Einteilung von Ependymompatienten in der Klinik beitragen. Des Weiteren konnten bei Kindern in supratentoriellen Tumoren signifikant mehr Aberrationen gefunden wurden als in infratentoriellen. Dies deutet darauf hin, dass Ependymome zumindest bei Kindern abhängig von der Lokalisation unterschiedliche Entstehungswege haben. Es konnten zwei Regionen identifiziert werden, in denen sich häufig Aberrationen fanden: 9p21.1-22.3 und 9q31.3-33.3. Weiterhin konnten Lokalisation und Resektionsausmaß als unabhängige Prognosefaktoren bestätigt werden.
Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein.
In dieser Arbeit wurde die Etablierung und Charakterisierung einer großen Daten-, Gewebe- und DNA-Bank an einem Kollektiv von 311 Patienten mit Prostatakarzinom und bekanntem klinischem Follow-up mit einem Beobachtungszeitraum von im Durchschnitt 5 Jahren beschrieben. Sämtliche Fälle wurden von einem Beobachter einheitlich nach einem standardisierten Katalog re-klassifiziert. Die erhobenen Daten konnten durch Korrelation mit den klinischen Verläufen auf Plausibilität überprüft und dadurch validiert werden. Die untersuchten Fälle entsprachen bezüglich Häufigkeitsverteilung in Tumorstadium und Gleason-Grading den aus Literaturangaben zu erwartenden Häufigkeiten. Statistisch signifikante Risikofaktoren bezüglich eines Tumorrezidivs, das hier als postoperativer Wiederanstieg des PSA im Serum definiert wurde, waren ein hohes Tumorstadium, hoher Gleason-Score, extraprostatische Perineuralscheideninfiltrate und unvollständige Resektion, während der Nachweis von Lymphknotenmetastasen zum Zeitpunkt der Operation innerhalb des hier verfügbaren Nachbeobachtungszeitraums zwar einen Trend, jedoch keine statistische Signifikanz aufwies. In einer multivariaten Analyse war die unvollständige Tumorresektion der histologische Parameter mit der höchsten prädiktiven Aussagekraft bezüglich eines Rezidivs. Patienten mit fraglich knapp im Gesunden entfernten oder fraglich durchtrennten Karzinomen wiesen eine signifikant erhöhte Rezidivrate auf und sollten klinisch als Risikopatienten betrachtet werden. Die beschriebene Daten- und Gewebebank legt eine wichtige und wertvolle Grundlage für zukünftige wissenschaftliche Untersuchungen mittels Immunhistochemie, Immunfluoresezenz, Molekulargenetik und andere DNA-basierte Methoden. Die in diesen Untersuchungen erhobenen Befunde können mit den in der Datenbank abgelegten histopathologischen Parametern korreliert und anhand der klinischen Verläufe auf prognostische Relevanz überprüft werden.
Humane Antikörper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universität Würzburg einige rein humane monoklonale Antikörper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antikörper galt es im Rahmen dieser Arbeit näher zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antikörper. Mithilfe immunhistochemischer Färbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antikörpern eine tumorspezifische Reaktivität ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgewählten Fälle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus lässt sich eine zuverlässige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumorösen Zellen, als auch der Größe und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verlässliche Marker für multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und können somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterführenden Untersuchungen überlassen werden.
Bekanntermaßen führt die H.pylori Infektion des Magens über eine komplexe Modulation des Chemokinsystems zur Ausbildung der H.pylori Gastritis. Die Chemokinrezeptorexpression in der H.pylori Gastritis ist jedoch bisher noch fast nicht untersucht. Das Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der Chemokinrezeptorexpression im Magen und die Testung eines Einfluss von H.pylori auf die Expression von Chemokinrezeptoren. In vitro führt die Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer schnellen Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 auf Proteinebene durch Rezeptorinternalisation und intrazellulären Abbau. Der Effekt ist unabhängig vom cag Status von H. pylori, sowie von TNF-α- oder IL-8. Als möglicher Signaltransduktionsmechanismus für diesen Effekt wäre die direkte Interaktion von H. pylori mit „toll-like receptors“ (TLRs) denkbar. Auf mRNA Ebene kommt es in vitro bei der Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 mRNA nach 3 Stunden. Dieser Effekt tritt bei Inkubation mit einem cag positiven H. pylori Stamm verstärkt auf und könnte bedingt sein durch autokrine Herunterregulation der Expression von CXCR1 und CXCR2 durch IL-8. In vivo exprimieren neutrophile Granulozyten in der H. pylori Gastritis in den Krypten ebenfalls vermindert CXCR1 und CXCR2. Sowohl die Expression der Chemokine als auch der korrespondierenden Chemokinrezeptoren wird somit durch H.pylori beeinflusst. Es lässt sich somit der folgende Pathomechanismus postulieren: Nach dem Eintritt der neutrophilen Granulozyten in die Schleimhaut, kommt es über den direkten Kontakt mit H.pylori zum Verlust der Chemokinrezeptoren. Die neutrophilen Granulozyten können somit nicht mehr auf Chemokinsignale reagieren und werden in der Magenschleimhaut immobilisiert. Dort setzen sie reaktive Sauerstoffradikale, proinflammatorische Zytokine und Chemokine frei, die zur Schleimhautschädigung führen. Magenkarzinome exprimieren die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR7. Die Expression wird mit der Neigung zur Metastasierung und einer schlechten klinischen Prognose assoziiert. In unseren Untersuchungen wird CXCR4 in vivo während des Prozess der Karzinogenese im Magen ab dem Stadium der intestinalen Metaplasie exprimiert. Bei Inkubation der Zelllinien mit cagA positiven und cagA negativen H. pylori – Stämmen, kommt es zu keiner Änderung der Expression von CXCR4. Die Infektion mit H. pylori ist zwar die Voraussetzung für die Genese der intestinalen Metaplasie, scheint jedoch nicht ursächlich an der Expression von CXCR4 beteiligt zu sein. CCR7 tritt in vivo auf den Magenepithelien der H. pylori Gastritis, der intestinalen Metaplasie, Dysplasie und Magenkarzinomen auf. In vitro führt die Koinkubation von CCR7 tragenden Magenzelllinien mit H. pylori zur Hochregulation von CCR7 kommt. Die Expression von CCR7 auf Karzinomzellen wird ebenfalls möglicherweise durch eine begleitende Infektion mit H. pylori begünstigt. Der Effekt der CCR7 Induktion durch H. pylori in vitro ist unabhängig vom cag Status des für die Infektion verwendeten H. pylori Stammes. Die Hochregulation von CCR7 ist möglicherweise bedingt durch die intrazelluläre Aktivierung von NFκB infolge der H. pylori Infektion. Denkbar wäre auch eine Induktion der Expression von CCR7 in den Magenepithelzellen in TLR abhängiger Weise, äquivalent zu Mechanismen, die in dendritischen Zellen beschrieben wurden. Es lässt sich abschließend feststellen, dass die H.pylori Infektion nicht nur die Freisetzung von Chemokinen, sondern auch die Expression von Chemokinrezeptoren wesentlich beeinflusst. Neutrophile Granulozyten verlieren in direktem Kontakt zu H.pylori die Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2. Auf Epithelzellen führt der direkte Kontakt zu H.pylori zur vermehrten Expression von CCR7. Die direkte Regulation von Chemokinrezeptoren durch H.pylori scheint also sowohl bei der H.pylori Gastritis, als auch bei der Entstehung und Progression von Magenkarzinomen eine Rolle zu spielen.
MALT1 zusammen mit CARMA1 und BCL10 spielt eine wesentliche Rolle bei Signalübermittlung von B-Zell-Rezeptor und nachfolgender NF-kappa-B Aktivierung. Bei Extranodaler MZBZL vom MALT-Typ ist MALT1-Gen häufig durch unterschiedliche chromosomale Aberrationen, die vermutlich zu einer konstitutiven NF-kappa-B Aktivierung führen, betroffen. Um einen Zusammenhang zwischen genetischen Aberrationen des MALT1-Gens und Aktivität des MALT1 induzierten NF-kappa-B Signale zu untersuchen, wurden genomische Aberrationen sowie MALT1-Expression in eine Serie von 20 MZBZL vom MALT-Typ der Speicheldrüsen untersucht. Dabei ließen sich Gewinne eines zusätzlichen MALT1-Signals in 9/18 (50%) sowie t(14;18)(q32;21) in 2/18 Fällen nachweisen. Die Mikrosatellitenanalyse zeigte eine Amplifikation des 18q21 Locus in 7/20 (35%) der Fälle. In 4 Fällen wurde eine spezifische Amplifikation des MALT1-Gens mit qRT-PCR bestätigt. Andere Translokationen, MSI oder LOH des MALT1-Gens waren nicht nachweisbar. Weiterhin wurden alle 20 MALT-Lymphom-Fälle auf Expression des MALT1-Proteins immunhistochemisch untersucht. Bei den Fällen mit genomischen Zugewinnen des MALT1 wurde gehäuft eine MALT1-Expression im Zellkern beobachtet. Konfokalmikroskopie zeigte, dass das MALT1-protein in Lymphomzellen direkt im Zellkern und in stark ausgebildeten filamentären Strukturen um den Zellkern herum lokalisiert ist. Zudem zeigten die Lymphomzellen mit filamentären MALT1-Strukturen eine kräftige p65-Expression im Zellkern, was einem aktivierten NF-kappa-B Zustand entspricht. Zusammenfassend, sind MALT-Lymphome der Speicheldrüsen durch häufige genomische Aberrationen des Chromosoms 18 gekennzeichnet, wobei Zugewinne des genomischen Materials am häufigsten zu finden sind. Im Gegensatz zu extranodalen Lymphomen anderer Lokalisationen sind bei MALT-Lymphomen der Speicheldrüsen die chromosmalen Translokationen selten. Die Zugewinne des Chromosoms 18 sind mit Relokalisation des MALT1-Proteins im Zellkern und um den Zellkern herum liegenden filamentären Strukturen und NF-kappa-B Aktivierung assoziiert. Somit bekräftigen die hier dargestellten Ergebnisse eine führende Rolle des MALT1-Oncogens in der Pathogenese von MZBZL vom MALT-Typ der Speicheldrüsen.
Die Entdeckung der Autoimmunkrankheit APECED führte zur Entdeckung des verantwortlichen Gens AIRE (autoimmune regulator), das einen Einblick in die Verhinderung oder Entstehung von Autoreaktivität im Thymus bietet. Durch Aktivierung des AIRE-Gens und Expression des AIRE-Proteins werden organspezifische Selbstantigene in medullären Thymusepithelzellen exprimiert und entweder direkt oder nach Transfer auf dendritsche Zellen unreifen T-Zellen präsentiert. Durch Elimination autoreaktiver Zellen entsteht Toleranz gegenüber den körpereigenen Geweben. Da das Immunsystem bei steigendem Alter tiefgreifende Veränderungen erfährt, die zum Teil durch die Thymusinvolution bedingt sind, ist es von Interesse, den Verlauf von AIRE über verschiedene Altersstufen hinweg zu untersuchen. Zielsetzungen dieser Arbeit waren daher die quantitative und räumliche Untersuchung der AIRE+ -Zellen im Alter und im Kontext einer prototypischen organspezifischen Autoimmunerkrankung, der Myasthenia gravis. Diese Fragestellungen wurden bei Normalthymi, entzündlich veränderten Thymi mit assoziierter Myasthenie und an B1-Thymomen untersucht. Als Ergebnis konnte erarbeitet werden, dass der Gehalt an AIRE+ -Zellen mit dem Alter abnimmt, wobei bis in die neunte Lebensdekade noch AIRE+ -Zellen vorhanden waren. Der Gehalt an AIRE+ Zellen stellte sich als stärker mit dem Lebensalter korreliert dar als beispielsweise die Thymusfläche. AIRE scheint damit ein mit der Thymusinvolution eng assoziiertes Gen zu sein. Es fand sich eine hochsignifikante Co-Lokalisation von AIRE+ Zellen und Hassall-Körperchen, die besonders durch die Untersuchungen von Typ B1 Thymomen mit und ohne Hassall-Körperchen bestätigt werden konnte. In Übereinstimmung mit aktuellen Forschungsergebnissen in Mausmodellen fand sich kein Zusammenhang zwischen der Anzahl oder der räumlichen Anordnung regulatorischer T-Zellen und AIRE+ -Zellen. Myoidzellen nahmen mit zunehmendem Alter ebenfalls ab. Ihre Rolle in der Entstehung der Myasthenie ist bei Patienten mit early und late onset wahrscheinlich unterschiedlich; die abnehmende Zahl an Myoidzellen stellt möglicherweise vor allem bei Patienten mit late onset einen Risikofaktor dar.
Die histologische Technik der Tissue-Microarrays ist eine sehr effiziente Methode, um eine große Anzahl auch heterogener Lymphome wie des Hodgkin-Lymphoms bei hohem Durchsatz unter homogenen Färbebedingungen zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass ein Probeschnitt zur vorherigen Auswahl stanzwürdigen Tumorareals nicht nötig ist. Die so genannte Blindstanzung trug weniger als einen Prozentpunkt (0,9%) zum Verlust der auswertbaren Fälle bei. Dennoch war bei einzelnen Parametern (LMP1 und EBER) ein hoher Gewebeverlust zu beobachten. In einer Stichprobe von 2696 Stanzen waren es 24% (631 Stanzen) bedingt durch die Färbetechnik, aber auch durch unterschiedliche Vorbehandlungen und Originalfixationen des Probematerials. In dieser Studie wurden 1212 Fälle zur Immuntypisierung von Tumorzellen des klassischen und nodulär lymphozyten-prädominanten Hodgkin-Lymphoms untersucht. Die Fälle von c-HL wiesen eine häufige Expression von CD30- und CD15-Oberflächenmarkern und kaum B-Zell-Marker auf, während im NLP-HL die Expression in umgekehrter Häufigkeit vorlag. Diese bisher größte Untersuchung von T-Zell-Markern an H-/RS-Zellen, erstmalig auch an NLP-HL, ergab eine bis zu 6-fach höhere Frequenz in der NLP-HL bei häufigerer B-Zell-Marker-Expression. Die in der Literatur beschriebene Rangordnung der Expressionshäufigkeit von Oberflächenantigenen im c-HL (CD2 > CD4 > CD3 > CD5 > CD8) wurde bestätigt und wich nur in den Markern CD3 und CD5 ab: Perforin >> CD4 > CD5 > CD3 > CD8 > GranzymB > TIA-1 > CD7. Tzankov et al. [45] fanden in ihrer Untersuchung mit 259 c-HL-Fällen eine Häufigkeit von 5% T-Zell-Marker-Expression. Die vorliegende Arbeit mit 1147 untersuchten c-HL-Fällen kam zum Ergebnis einer deutlich höheren T-Zell-Marker-Expressionshäufigkeit von 20,1%. Der pathophysiologische Mechanismus der T-Zell-Marker-Expression ist bis heute noch unklar, könnte aber als eine alternative Signalkaskade zur Aufrechterhaltung des Zellzyklus unter geändertem Zellmilieu gedeutet werden. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit betraf die Gruppe der Studienteilnehmer 60 Jahre und älter, um Hinweisen auf das „age-related“ EBV-associated Lymphom und der Rolle der Mikrosatelliten-Instabilität nachzugehen. So fand sich eine signifikante Häufung von Markern für eine EBV-Infektion (EBER, LMP1) in der Gruppe der über 60-Jährigen. Die Expression von DNA-Reparaturenzymen, deren Ausbleiben auf Mikrosatelliten-Instabilität gedeutet hätte, unterschied sich zwischen jüngeren und älteren Studienteilnehmern nicht.
Obwohl sie die Mehrzahl der T-Zell-Lymphome darstellen, war über die Genetik der PTC-NOS und ALK-negativen ALCL bisher nur wenig bekannt. Klassische zytogenetische Untersuchungen dieser Gruppe wiesen auf komplexe chromosomale Veränderungen hin. Aufgrund der Seltenheit dieser Neoplasien basierten die Berichte bis jetzt nur auf einer geringen Anzahl von Fällen. Für die heterogene Gruppe von PTCL-NOS konnten bisher keine charakteristischen genetischen Veränderungen beschrieben werden. Zudem waren die genetische Beziehung zwischen ALK-negativen ALCL und PTCL-NOS, die Genetik von kutanen ALCL und die sekundären genetischen Veränderungen in ALK-positiven ALCL unklar. In dieser Untersuchung wurden 42 PTCL-NOS und 37 ALCL, davon 17 anaplastisch-großzellige Kinase (ALK)-negative ALCL, 9 ALK-positive ALCL und 11 kutane ALCL, durch komparative genomische Hybridisierung analysiert und charakteristische rekurrente genetische Alterationen nachgewiesen. Unter 36 primär diagnostizierten PTCL-NOS fanden sich rekurrente chromosomale Verluste auf den Chromosomen 13q (minimal überlappende Region 13q21, 36% der Fälle), 6q und 9p (6q21 und 9p21-pter, in 31% der Fälle), 10q und 12q (10q23-24 und 12q21-q22, in 28% der Fälle) und 5q (5q21, 25% der Fälle). Rekurrente Zugewinne wurden auf Chromosom 7q22-qter (31% der Fälle) gefunden. In 11 PTCL-NOS wurden High-level-Amplifikationen beobachtet. Bei den PTCL-NOS konnte zudem eine Gruppe von nicht-zytotoxischen nodalen CD5-positiven T-Zell-Lymphomen abgegrenzt werden, die durch rekurrente chromosomale Verluste auf den Chromosomen 5q, 12q und 10q charakterisiert ist. Während kutane und ALK-positive ALCL wenige rekurrente chromosomale Veränderungen zeigten, fielen bei ALK-negativen ALCL wiederholt Zugewinne auf Chromosom 1q (1q41-qter, 46%) und Verluste auf Chromosom 6q (6q21, 31%) und 13q (13q21-q22, 23%) auf. Insgesamt können somit PTCL-NOS von ALK-negativen ALCL durch Verluste auf den Chromosomen 5q und 9p (bei PTCL-NOS) sowie durch Zugewinne auf Chromosom 1q (bei ALCL) abgegrenzt werden. PTCL-NOS und ALK-negative ALCL unterscheiden sich genetisch außerdem von anderen T-NHL, wie Enteropathie-assozierte T-Zell-Lymphome, Prolymphozyten-Leukämien vom T-Zell-Typ und adulte T-Zell-Leukämien/Lymphomen.
Das Nebennierenrindenkarzinom ist ein seltener maligner, epithelialer Tumor mit einer jährlichen Inzidenz in Deutschland von 2 pro 1 Million Einwohnern. Es ist für etwa 0,2% aller Krebstodesfälle verantwortlich. Die Seltenheit der Erkrankung erschwert die Entwicklung wirksamer Therapieansätze erheblich. Erst in letzter Zeit gelang es, größere Patientenkohorten in kontrollierten Studien zu behandeln (Allolio et al. 2006) und größere Fallzahlen an Tumorgewebe wissenschaftlichen Untersuchungen zuzuführen. Erstmalig besteht damit auch die Möglichkeit, die Expression eventuell relevanter Proteine für moderne Therapiekonzepte auch an großen Fallzahlen zu untersuchen. Bislang liegen nur sehr lückenhafte diesbezügliche Studien vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression einiger möglicherweise therapeutisch relevanter Proteine mittels immunhistochemischer Analyse unter Zuhilfenahme der Tissue Microarray-(TMA)-Technik in einer großen Serie von 104 NNR-Ca untersucht und mit der von Nebennierenadenomen und normalem Nebennierengewebe verglichen. Insgesamt 9 verschiedene Proteine wurden immunhistochemisch dargestellt: Als wichtigster Befund wurde eine Überexpression der Alpha-methylacyl-CoA Racemase (AMACR) in 89% der untersuchten NNR-Ca festgestellt. Interessanterweise zeigte auch die Mehrzahl der untersuchten Nebennierenadenome (80%) zumindest eine schwache AMACR-Reaktivität, während die mituntersuchten normalen Nebennieren negativ blieben. Diese bislang nicht beschriebene Beobachtung gleicht den bekannten Befunden z.B. in der Prostata, in der sowohl die dort entstehenden Adenokarzinome, als auch deren Vorläuferläsionen (PIN) eine AMACR-Expression zeigen. EGFR, ein Tyrosinkinaserezeptor, auf den der bereits etablierte therapeutische Antikörper Cetuximab (Erbitux®) zielt, wurde in 49% der untersuchten NNR-Ca verstärkt exprimiert, so dass eine gegen den EGFR gerichtete Therapie in ausgewählten Fällen eine Behandlungsoption zu eröffnen scheint. Die Suche nach Mutationen in diesem potentiellen Zielprotein könnte weitere Ansatzpunkte für Wirkstoffe aufzeigen, Studien gibt es dazu bislang keine. Ähnliche Ergebnisse fanden sich in dieser Studie für VEGF, das von 19% der untersuchten NNR-Ca mäßig oder stark exprimiert wurde. Auch hier könnte eine entsprechende Therapie mit einem bereits kommerziell erhältlichen spezifischen Antikörper (Bevacizumab/Avastin®) in einem Teil der Fälle eine Behandlungsoption, ggf. auch als supportive Maßnahme, eröffnen. Angesichts der Expression von VEGF in nur rund einem Drittel der Fälle, wäre hier aber eine vorangehende Bestimmung des Expressionsstatus am Tumorgewebe unerläßlich. Weitere Untersuchungen sollten auch den VEGF-Rezeptor als möglichen Ansatzpunkt neuer Wirkstoffe, wie z.B. der Multi-Tyrosinkinase-Inhibitor Sunitinib [SU11248; SUTENTTM] (Le Tourneau et al., 2007), erforschen. Im Gegensatz dazu wurde eine wesentliche Expression weiterer untersuchter Proteine (CD117/C-kit, Her-2/neu, Östrogen- und Progesteronrezeptor) in NNR-Ca in dieser Studie nicht in einem Maße gefunden, welches in einer signifikanten Zahl von Fällen eine Therapieoption eröffnen würde. Eine immunhistochemisch bestimmbare Expression von p53, als Surrogatmarker für ein mutiertes p53-Gen wurde in 85% der untersuchten NNR-Ca nachgewiesen. Dies weist auf eine zentrale Bedeutung von p53-Mutationen in der Genese von NNR-Ca hin. (Reincke et al., 1994; Gicquel et al., 2001; Barzon et al.I, 2001; Soon et al., 2008) Auch die Proliferationsfraktion, bestimmt als Ki67-Index, war in den untersuchten Karzinomen gegenüber den Adenomen und den mitgeführten normalen Nebennieren deutlich erhöht, was das aggressive Wachstumspotential der Mehrzahl der NNR-Ca wiederspiegelt.
Histomorphologische Charakteristika klinisch gesicherter Bisphosphonat-assoziierter Kiefernekrosen
(2009)
Bisphosphonate finden seit mehr als 25 Jahren klinischen Einsatz. Ihre Verabreichung ist mittlerweile fester Bestandteil der medikamentösen Therapie von Osteoporose, Morbus Paget, Plasmozytomen und tumorbedingten Osteolysen. Auf eine dabei für den Patienten sehr schwerwiegende und aufgrund der Therapieresistenz oftmals schwierig zu behandelnde Nebenwirkung wurde im Jahr 2003 erstmals aufmerksam gemacht. Als sicher gilt heute, dass es unter Bisphosphonat-Therapie zu Osteonekrosen im Kieferbereich kommen kann. In der vorliegenden Studie wurden 24 Fälle (14 Frauen, 10 Männer; Durchschnittsalter 66 Jahre) Bisphosphonat-assoziierter Kiefernekrosen untersucht. Die Patienten erhielten alle Aminobisphosphonate - in mehr als der Hälfte der Fälle handelte es sich dabei um das hochwirksame Zometa® (Zolendronat; Novartis). In 91,6% der Fälle waren ossär metastasierende Malignome (Mamma- und Prostata-CAs) sowie Plasmozytome/multiple Myelome Grund der Applikation. Klinisch waren freiliegender Knochen, ulzerierende Schleimhautveränderungen, Wundheilungsstörungen nach zahnärztlichen Eingriffen, Abszessbildung, Fistelung, Parästhesien, rezidivierende bzw. zunehmende Schmerzen und gelockerte Zähne zu beobachten. Die dabei auftretenden Symptome besitzen jedoch keine ausreichende Spezifität, so dass es dem Kliniker nur über die genaue Kenntnis der Anamnese möglich ist eine Bisphosphonat-assoziierte Kiefernekrose zu diagnostizieren. Die licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergaben variable Ausprägungsmuster der Nekrose. In der Mehrheit der Fälle lag dabei eine eitrige Nekrose, in 20,8% der Fälle hingegen eine aseptische Nekrose vor. In 79,2% der Fälle trat ein Actinomyces-Befall unterschiedlicher Befallsstärke auf. In 33,3% konnten Epithelproliferate und in seltenen Fällen Anzeichen eines reaktiven Knochenumbaus (16,7%) beobachtet werden. Insgesamt besitzen die histopathologischen Veränderungen wenig Spezifität, so dass der Pathologe ohne Kenntnis des klinischen Gesamtaspektes nicht eindeutig eine Bisphosphonat-assoziierte Kiefernekrose diagnostizieren kann und zur Diagnose klinisch-anamnestische Daten und histologische Befund zusammengeführt werden müssen. Ein hinsichtlich formalpathogenetischer Überlegungen wichtiges histomorphologisches Ergebnis stellte die signifikante Zunahme der Trabekeldicken (p < 0.04) Bisphosphonat behandelten Knochens im Vergleich zu gesundem dar. Die Sklerosierung führt konsekutiv zu einer Verschlechterung der Durchblutungs- und Ernährungssituation und damit auch der Abwehrlage des Kieferknochens und stellt den entscheidenden Ausgangspunkt für die Entstehung von Osteonekrosen dar. Konsens besteht aufgrund der bisherigen Forschungsergebnisse darüber, dass zur Entwicklung der unter Bisphosphonat-Therapie beobachteten Kiefernekrosen jedoch eine Reihe zusätzlicher Risikofaktoren im Sinne eines multifaktoriellen Geschehens bedeutsam sind. In Übereinstimmungen zu anderen Forschungsarbeiten konnte in der eigenen Arbeit der zahnärztliche Eingriff als ein wichtiger Risikofaktor identifiziert werden.
Eine grundlegende Aufgabe unseres Immunsystems ist der Schutz unseres Organismus durch die Abwehr von Erregern. Im Zentrum jeder Immunantwort liegt die Unterscheidung zwischen dem „Selbst“ (der Erkennung körpereigener Antigene) und dem „Nicht-Selbst“ (der Erkennung körperfremder Antigene). Ein wichtiger Faktor in der Aufrechterhaltung der zentralen Toleranz ist das AIRE-Protein. In der Thymusmedulla, dem Ort der stärksten AIRE-Expression, erfolgt die sog. negative Selektion der heranreifenden autoreaktiven T-Zellen. Es wird angenommen, dass AIRE durch Regulation der Präsentation von Selbst-Antigenen in mTECs und DCs die Thymozyten auf Autoreaktivität kontrolliert und potentielle Auslöser einer Autoimmunkrankheit eliminiert. Thymome sind epitheliale Tumoren des Thymus, die häufig mit Autoimmunphänomenen, insbesondere paraneoplastischer Myasthenia gravis, einhergehen. Da bei Thymomen meist ein vollständiger Verlust von AIRE sowohl auf Transkriptions- als auch Proteinebene vorliegt, lag es nahe, einen Zusammenhang mit dem Auftreten Thymom-assoziierter Autoimmunerkrankungen zu vermuten. Thymome wurden initial in einer histogenetischen Klassifikation aufgrund morphologischer Kriterien in „medulläre“ und „corticale“ Typen unterteilt. Dieses Konzept sollte in der vorgelegten Arbeit überprüft werden. Durch Kombination verschiedener Gen-Expressions-Datensätze wurden „medulläre Thymusgene“ identifiziert und in 3 Gruppen (Gene ohne Beeinflussung durch AIRE bzw. Gene mit positiver bzw. negativer Regulation durch AIRE) unterteilt. Unter den hier identifizierten, durch AIRE positiv regulierten Genen fanden sich zahlreiche Gene mit potentieller Bedeutung für die Immunregulation bzw. die Entstehung experimenteller und humaner Autoimmunerkrankungen. Eine Analyse verschiedener Thymom-Subtypen ergab weder eine erkennbare „AIRE-Verlust-Signatur“ noch eine medulläre Gensignatur in den „medullären“ Typ A Thymomen. Die erhobenen Befunde wären aber mit einem Stammzellmodell der Thymomentstehung vereinbar, nach dem die unterschiedlichen Thymom-Subtypen aus unterschiedlich determinierten Stamm- oder Progenitorzellen mit verschiedenen Reifungsblockaden hervorgehen könnten.
Erste tumorassoziierte Veränderungen finden im Glykosilierungsmuster von Glykoproteinen und Glykolipiden statt. Die dabei entstehenden tumorassoziierten Carbohydrat-Antigene sind prominente Zielstrukturen der natürlichen Tumorimmunität (Immune Surveillance) und gewinnen in der Onkologie als immunogene Epitope zunehmend an Bedeutung. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 ist Teil der tumorspezifischen Immunität. Er wurde mit Hilfe der konventionellen Hybridomatechnologie direkt aus einem an Magenkarzinom erkrankten Menschen isoliert. Neben der Erforschung seines außergewöhnlichen Apoptose-mechanismus konnte innerhalb dieser Arbeit eine Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und charakterisiert werden. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 bindet an eine neue Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 (GRP78SAM-6). Das Antigen wurde über mehrstufige chromatographische Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und nach tryptischen Verdau über die Methode des Peptidmassen-Fingerprinting eindeutig als humanes GRP78 identifiziert. Die auf der Zellmembran lokalisierte Variante des GRP78 besitzt ein Molekulargewicht von 82 kD und wird auf vielfältigen Tumorgeweben stabil exprimiert. GRP78SAM-6 liegt parallel zur 78 kD-Wildtyp-Variante co-exprimiert vor und konnte im Gegensatz zur Wildtyp-Variante nicht auf gesundem Gewebe nachgewiesen werden. Bei der SAM-6-spezifischen Variante des GRP78 handelt es sich um eine posttranslational modifizierte Form des GRP78, die spezifisch auf der Zellmembran lokalisiert ist, nicht jedoch intrazellulär zu finden ist. Sie unterscheidet sich durch zusätzliche Glykosilierungen vom GRP78-Wildtypen, wobei O-glykosidisch verknüpfte Glykane für die Bindung und die Reaktion mit dem SAM-6 Antikörper essentiell sind. Der SAM-6-Rezeptor stellt eine tumorspezifische Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 dar, deren O-glykosilierte Carbohydrat-Regionen als Epitop fungieren. Durch die Bindung an GRP78SAM-6 hemmt der Antikörper SAM-6 in vitro als auch in vivo konzentrationsabhängig das Wachstum von Magen- und Pankreaskarzinomzellen und induziert eine neue Art des apoptotischen Zelltodes, die sog. Lipoptose. Es handelt sich um einen durch den Antikörper vermittelten direkten Effekt, der sich ausschließlich auf malignes Gewebe beschränkt. Schlüsselpunkt der apoptotischen Wirkung ist die Akkumulation zytotoxischer Mengen an Cholesterol und Triglyceridestern, die nach Bindung an den Antikörper in Form von Lipoprotein-Partikeln in die Tumorzelle gelangen. Der pentamere IgM-Antikörper bindet neben membranständigem GRP78SAM-6 der Tumorzelle, die ApoB 100-haltigen Lipoproteine VLDL und LDL. Insbesondere oxidativ modifizierte Formen des LDL (oxLDL) zeigten dabei die höchste Bindungsaffinität zum SAM-6 Antikörper. In deren Anwesenheit war ein maximaler lipotoxischer Effekt zu beobachten. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, weite Teile des Lipoptose-Mechanismus aufzuklären. Eigenen Immunfluoreszenzstudien zufolge wird der SAM-6 Antikörper über rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert. Die GRP78-vermittelte Internalisierung von oxLDL-beladenem Antikörper scheint daher plausibel und für die tödliche Anhäufung der Lipide verantwortlich zu sein. Die SAM-6-induzierte Apoptose verläuft anschließend über einen spezifischen Signalweg, der Gemeinsamkeiten mit dem intrinsischen Signalweg aufweist, jedoch wie beim extrinsischen Signalweg über externe pro-apoptotische Liganden angeregt wird. Infolge der unphysiologisch hohen intrazellulären Konzentration an oxLDL kommt es zur Induktion einer Caspasenkaskade, die nach der initialen Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien über die Initiatorcaspasen 8 und 9 verläuft und letztendlich durch die Aktivierung der terminalen Caspasen 3 und 6 den apoptotischen Zelltod einleitet. Die Entdeckung von extrazellulär exprimiertem GRP78 auf Tumorzellen bietet die Möglichkeit neuer Therapieansätze in der Onkologie. Die SAM-6-spezifische Variante des GRP78 bietet insbesondere die Möglichkeit eines gezielten Angriffs auf die Tumorzelle, ohne gesunde Zellen zu tangieren. Sie wird auf Tumorgeweben verschiedenster Ätiologie stabil exprimiert und infolge ihres tumorspezifischen Auftretens zur optimalen Zielstruktur der natürlichen körpereigenen Immunantwort gegen Tumore. Der natürliche IgM-Antikörper ist Teil der natürlichen Immunität. Diese verfügt über ein breites Repertoire an Rezeptoren und garantiert die permanente Überwachung und Reaktion gegen modifizierte körpereigene Zellen. Sie ist dafür verantwortlich, dass Tumore sich nur in Ausnahmefällen manifestieren.
Humane oder humanisierte monoklonale Antikörper haben sich in den letzten zehn Jahren als Arzneimittel etabliert. Sie sind hochspezifisch und zeigen in ihrer Anwendung im Vergleich zu konventionellen Therapeutika viel weniger Nebenwirkungen. In den 80er Jahren gelang es am Pathologischen Institut der Universität Würzburg eine Reihe von humanen Antikörpern aus Patienten zu isolieren, die hochspezifisch mit malignen Zellen reagieren und diese sowohl in vitro als auch im experimentellen Tiermodel selektiv durch Induktion von Apoptose töten. Um die Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern in der Krebstherapie zu erhöhen, werden die meisten in Kombination mit herkömmlichen Methoden, wie Chemotherapie, eingesetzt. Die ideale Therapieform sind hinsichtlich der Nebenwirkungen sog. Cocktails aus verschiedenen monoklonalen Antikörpern. Allerdings sind die Studien hierzu noch wenig fortgeschritten. Das Ziel dieser Arbeit war es, in präklinischen Versuchsreihen den Einsatz verschiedener tumorspezifischer humaner monoklonaler Antikörper als Cocktail und in Kombination mit Chemotherapie zu evaluieren. Hierzu wurden neun Antikörper in 32 verschiedenen Antikörperkombinationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die in vitro Proliferation einer Pankreaskarzinom-Zellinie untersucht. In Immunfluoreszenz-Aufnahmen ließ sich zeigen, dass kombinierte Antikörper an unterschiedlichen Stellen an der Zelle binden, was eindeutig auf verschiedene Zielstrukturen hinweist. Einige werden dabei endozytiert, während andere auf der Zellmembran bleiben. Interessanterweise ließen sich Kombinationen identifizieren, deren antiproliferative Wirkung sowohl additiv als auch synergistisch ist, das heißt größer als die Summe ihrer Einzelaktivitäten. Wurden Antikörper mit Zytostatika (5-Flurouracil) kombiniert, so ließen sich ebenfalls synergistische Effekte beobachten. In FACS-Analysen zeigt sich ein gesteigertes Bindungsverhalten der Antikörper, wenn die Zellen mit 5-FU vorinkubiert wurden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Beobachtung, dass die Wirkung humaner monoklonaler Antikörper in Kombination mit Chemotherapie erhöht werden kann. Für die Zukunft humaner Antikörper als Therapiemittel gegen maligne Erkrankungen mag allerdings noch wichtiger sein, dass Antiköper in Cocktails tatsächlich synergistische Wirkung zeigen können.