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Mit Hilfe von in vivo ChIP-Experimenten identifizierten wir eine präRC Bindungsstelle von -2519 bis -2152 (Fragment B) innerhalb eines „origin of bidirectional replication (OBR)“ der 44 kb langen Maus-rDNA-Einheit. Diese Bindungsstelle befindet sich ungefähr 2,3 kb ubstream des Transkriptionsstartpunktes der RNA-Poymerase I. An dieser Bindungsstelle konnte in der G1-Phase der komplette ORC-Komplex sowie Geminin, MCM3 und -6 nachgewiesen werden. Für den G1/S-Phasenübergang deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich ORC6 und Geminin von Fragment B ablösen, während sich CDC6 und -45 an den ORC-Komplex anlagern. Mit Erreichen der S-Phase konnte gezeigt werden, dass sich CDC6 und -45 sowie ORC1 wieder ablösen und ein Core-Komplex von ORC2-5 sowie MCM3 und -6 gebunden bleibt. Außerdem konnte an Fragment B eine spezifische Bindung eines aus FM3A-Zellkernprotein angereicherten präRC-Komplexes (Komplex A) auch in vitro mit Hilfe von EMSA-Experimenten beobachtet werden. Die Bindungsaktivität von Komplex A an Fragment B konnte durch ATP verstärkt werden.
Die Gruppe der adrenergen Rezeptoren (AR) umfasst neun Rezeptoren (3 alpha1-, 3 alpha2-, 3 beta-AR), die alle durch die physiologischen Liganden Adrenalin und Noradrenalin aktiviert werden können. Eine Subgruppe der AR bilden die drei alpha2-AR alpha2A, alpha2B und alpha2C. Sie können prä- oder postsynaptisch lokalisiert sein. Präsynaptisch lokalisierte alpha2-AR hemmen die Transmitterfreisetzung im Sinne einer negativen Rückkopplung. Die Hauptrolle bei der präsynaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung spielen alpha2-AR vom Subtyp alpha2A. Es lagen zu Beginn dieser Arbeit auch Hinweise vor, daß noch weitere alpha2-Rezeptorsubtypen an dieser Funktion beteiligt sind. Eine eindeutige Zuordnung dieser alpha2-AR zu den Subtypen alpha2B oder alpha2C gelang aber bisher nicht. In dieser Arbeit sollte deshalb die Frage beantwortet werden, welche alpha2-AR neben dem alpha2A-AR an der präsynaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Zur Subtypunterscheidung wurden "knockout"-Mäuse verwendet, die nur einen oder zwei alpha2-Rezeptorsubtypen exprimierten. Gehirnschnitte aus dem Neokortex und den Basalganglien dieser Mauslinien wurden mit radoaktiv markiertem Noradrenalin bzw. Dopamin inkubiert. Anschließend wurde in Transmitterfreisetzungsexperimenten mit den so behandelten Gehirnschnitten Konzentrations-Wirkungskurven mit verschiedenen Liganden erstellt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, daß neben den alpha2A-AR auch alpha2C-AR präsynaptisch die Transmitterfreisetzung von Noradrenalin und Dopamin hemmen. In einem weiteren Schritt wurde die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der alpha2A- und alpha2C-AR im heterologen Expressionssystem untersucht. Hierzu wurden stabile HEK293-Zellinien generiert, die entweder alpha2A- oder alpha2C-AR unterschiedlich stark exprimierten. Diese Zellinien wurden transient mit GIRK-Kanälen transfiziert, um die durch Stimulation mit Noradrenalin resultierenden Kaliumströme mit der "patch-clamp"-Technik zu messen. Dabei ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen alpha2A- und alpha2C-AR bezüglich der Aktivierungskinetik. Alpha2C-AR deaktivierten jedoch deutlich langsamer als alpha2A-AR. Diese Befunde belegen, daß zwei der drei alpha2-AR-Subtypen, alpha2A und alpha2C, als präsynaptische Autorezeptoren (Noradrenalin) bzw. Heterorezeptoren (Dopamin) die Neurotransmission modulieren. Dies könnte in der Zukunft für die Entwicklung neuer, subtypspezifischer Pharmaka von großer Bedeutung sein.
Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.
Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3.
Dendritische Zellen stellen eine Gruppe morphologisch, phänotypisch und funktionell einzigartiger Leukozyten dar, die eine zentrale Rolle bei der Regu-lation des Immunsystems spielen. Als die mit Abstand effektivsten antigen-präsentierenden Zellen besteht ihre Funktion sowohl in der Auslösung als auch in der Verhinderung spezifischer Immunantworten, wobei diese Fähigkeiten von ihrem jeweiligen Reifungsstadium abhängig sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Dendritische Zellen aus Milzen von Mäusen verschiedener Linien mit¬tels Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von OptiPrep (Iodixanol) isoliert und phänotypisch sowie funktionell charakterisiert. Die gewonnenen Zellsuspensionen bestanden durchschnittlich zu 41 Prozent aus residenten konventionellen Dendritischen Zellen. Die isolierten Dendritischen Zellen waren unabhängig von der untersuchten Mauslinie bis zu 26 Prozent CD8α-positiv und bis zu 81 Prozent CD8α-negativ. Dendritische Zellen wiesen unmittelbar nach der Zellgewinnung einen unreifen Phänotyp auf mit starker Expression von MHC-Klasse-II, aber schwacher bis fehlender Expression der kostimulato¬rischen Moleküle CD80, CD86 und CD40. Eine 24- bzw. 48-stündige Kulti¬vierung in vitro führte zur Reifung der Dendritischen Zellen mit Zunahme der Expression von MHC-Klasse-II, CD80, CD86 und CD40 um den Faktor 2 bis 4. Diese Zellen wiesen zudem immunstimulatorische Eigenschaften in der gemischten (allogenen) Leukozytenkultur auf. Dendritische Zellen der Mauslinie NMRInude exprimierten nach der In-vitro-Kultur ebenfalls zahlreiche Ober¬flächenmarker, darunter die Reifungsmarker. Die Stärke der Expression war jedoch um bis zu 50 Prozent schwächer als bei Dendritischen Zellen der anderen Mauslinien. Dieser Befund weist auf potentielle Unterschiede zwischen Dendritischen Zellen der thymuslosen Mauslinie NMRInude und Dendritischen Zellen von Wildtyp-Mäusen hin. Es wurde gezeigt, dass OptiPrep zur Isolierung Dendritischer Zellen aus Mäusemilzen bei geringem Arbeitsaufwand und niedrigen Kosten verwendet werden kann. Die isolierten Dendritischen Zellen weisen die zu erwartenden phänotypischen und funktionellen Eigenschaften auf und scheinen somit für den Einsatz in weiterführenden Experimenten geeignet.
Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen weiterhin die Todesursache Nummer eins in Deutschland dar, welche hauptsächlich durch Atherosklerose verursacht werden. Als ein Prädiktor der atherosklerotischen Plaqueentwicklung wird die Wandschubspannung (WSS) diskutiert. Ziel dieser Arbeit war es daher, anhand von Flussphantomen und C57bl/6 Mäusen eine 2D-Gradientenecho-Bildgebungsmethode mit einer 3D-Phasenkontrast-Flusskodierung zu optimieren und anschließend eine longitudinale Kleintierstudie mit ApoE-/- Mäusen durchzuführen, um den Zusammenhang der WSS und der atherosklerotischen Plaqueentwicklung näher zu untersuchen. Zunächst wurden Flussphantome mit einem Schlauchdurchmesser von 4 mm und 1 mm zur Optimierung der Messmethode verwendet. Anschließend wurde die Messmethode weiter angepasst, um in vivo Messungen an C57bl/6 Mäusen durchführen zu können. Nach erfolgter Optimierung wurde eine longitudinale Kleintierstudie mit zwei verschiedenen Diäten, Western Diät und Chow Diät, durchgeführt. Im Rahmen der Studie erfolgten nach einer, acht und zwölf Wochen MR-Messungen sowie histologische Analysen. Es konnte gezeigt werden, dass die Wandschubspannung in Mäusen bei 17,6 Tesla quantifiziert werden kann. Es zeigte sich eine Tendenz, dass Plaqueformationen mit einer höheren Wandschubspannung einhergehen.
Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als Überlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizität. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizität und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zunächst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum für die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bezüglich BDNF keine Veränderungen in Hippocampi CNTF-defizienter Mäuse gegenüber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten Mäusen eine eingeschränkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verständnis der – laut LTP-Untersuchungen – veränderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-Färbung nachweisbar. Zur Klärung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout Mäusen durchgeführt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in ähnlichem Maße hochreguliert, was für alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF&LIF-defizienten Mäusen, wobei LIF-defiziente Tiere keine veränderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorläuferzellen bestätigten die Hypothese, wonach cortikale Vorläuferzellen zunächst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorläuferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo für die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.
Herzkreislauferkrankungen stellen die häufigsten Todesursachen in den Industrienationen dar. Die Entwicklung nichtinvasiver Bildgebungstechniken mit Hilfe der Magnetresonanz-Tomografie (MRT) ist daher von großer Bedeutung, um diese Erkrankungen frühzeitig zu erkennen und um die Entstehungsmechanismen zu erforschen. In den letzten Jahren erwiesen sich dabei genetisch modifzierte Mausmodelle als sehr wertvoll, da sich durch diese neue Bildgebungsmethoden entwickeln lassen und sich der Krankheitsverlauf im Zeitraffer beobachten lässt.
Ein große Herausforderung der murinen MRT-Bildgebung sind die die hohen Herzraten und die schnelle Atmung. Diese erfordern eine Synchronisation der Messung mit dem Herzschlag und der Atmung des Tieres mit Hilfe von Herz- und Atemsignalen. Konventionelle Bildgebungstechniken verwenden zur Synchronisation mit dem Herzschlag EKG Sonden, diese sind jedoch insbesondere bei hohen Feldstärken (>3 T) sehr störanfällig. In dieser Arbeit wurden daher neue Bildgebungsmethoden entwickelt, die keine externen Herz- und Atemsonden benötigen, sondern das MRT-Signal selbst zur Bewegungssynychronisation verwenden. Mit Hilfe dieser Technik gelang die Entwicklung neuer Methoden zur Flussbildgebung und der 3D-Bildgebung, mit denen sich das arterielle System der Maus qualitativ und quantitativ erfassen lässt, sowie einer neuen Methode zur Quantisierung der longitudinalen Relaxationszeit T1 im murinen Herzen. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden ermöglichen robustere Messungen des Herzkreislaufsystems. Im letzten Kapitel konnte darüber hinaus gezeigt werden dass sich die entwickelten Bildgebungstechniken in der Maus auch auf die humane Bildgebung übertragen lassen.
Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.