Refine
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Document Type
- Doctoral Thesis (3)
Keywords
- guard cells (2)
- ABA (1)
- AKT1 (1)
- Abscisinsäure (1)
- Anionenkanal (1)
- Anionentranslokator (1)
- Arbuscular Mycorrhiza (1)
- Arbuskuläre Mykorrhiza (1)
- CIPK23 (1)
- Ca2+ signal (1)
Institute
Bei der arbuskulären Myorrhiza-Symbiose (AM) und der Wurzelknöllchen-Symbiose (RNS) handelt es sich um symbiotische Interaktionen, die einen großen Vorteil für Pflanzenwachstum und kultivierung mit sich bringen. Während bei der AM Pilze die Pflanze mit verschiedenen Nährstoffen aus dem Boden versorgen, stellen die in den Wurzelknöllchen lokalisierten Rhizobien der Pflanze fixierte Stickstoffverbindungen zur Verfügung. Folglich ist es von großem Interesse, die Entwicklung dieser Symbiosen im Detail zu verstehen.
Für die Erkennung der arbuskulären Mykorrhiza-Pilze und der Stickstoff-fixierenden Rhizobien durch die Pflanze sind lösliche symbiotische Signalmoleküle essentiell, die zu der Gruppe der Lipochitinoligosaccharide (LCOs) gehören. Während der Entwicklung der AM und der RNS erkennen die Pflanzenwurzeln diese LCOs über Lysin-Motiv-Rezeptor-ähnliche Kinasen der Plasmamembran. Eine der ersten Antworten der Wurzelzellen auf Nod-LCOs ist eine Depolarisierung des Membranpotentials. An dieser Antwort sind mit großer Wahrscheinlichkeit Anionenkanäle der Plasmamembran beteiligt, da sie auch bei Depolarisierungen als Antwort auf andere Stimuli bzw. Stressantworten involviert sind.
In Arabidopsis stellt die S-Typ-Familie eine bedeutende Gruppe von Anionenkanälen dar, die von Calcium-abhängigen Kinasen (CPKs) aktiviert werden. Da Nod-LCOs repetitive Veränderungen des zytosolischen Calcium-Levels induzieren, wurde in dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass Calcium-Signale CPKs aktivieren. CPKs sorgen im Gegenzug für die Stimulation von S-Typ-Anionenkanälen in Wurzelzellen.
Die Änderungen des Membranpotentials in M. truncatula-Wurzelhaarzellen als Antwort auf Nod- und Myc-LCOs wurden mittels intrazellulärer Mikroelektroden analysiert. Es wurde gezeigt, dass Nod-LCOs in M. truncatula-Wurzelhaarzellen eine Depolarisierung des Membranpotentials induzieren. Doch Wurzelhaarzellen reagieren nicht nur auf Nod-LCOs. So konnte in dieser Studie zum ersten Mal eine Depolarisierung als Antwort auf sulfatisierte Myc-LCOs nachgewiesen werden. Eine zweite Gruppe von Myc-LCOs, denen die Sulfatgruppe fehlt, löste keine Reaktion des Membranpotentials aus. Diese Daten deuten darauf hin, dass Wurzelhaarzellen für die Erkennung von sulfatisierten LCOs von symbiotischen Pilzen und Bakterien dasselbe Perzeptionssystem nutzen. Diese Schlussfolgerung wird von Experimenten unterstützt, in denen vor der Stimulation durch Nod-LCOs ein sulfatisierter Myc-LCO hinzugegeben wurde. Diese sukzessive Zugabe von zwei Stimuli führte zu einer einzigen Depolarisierung. Die sulfatisierten Myc-LCOs unterdrückten die Antwort des Membranpotentials auf Nod-LCOs.
Die Beziehung zwischen Nod-LCO-induzierten zytosolischen Calcium-Signalen und Änderungen des Membranpotentials wurde mit einer Kombination aus intrazellulären Mikroelektroden und Imaging eines Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs analysiert. In Messungen der zytosolischen Calcium-Konzentration wurde keine transiente Zunahme innerhalb der ersten vier Minuten nach der Applikation der Nod-LCOs beobachtet. Die durch Nod-LCOs induzierten Depolarisierungen traten früher auf und erreichten ihr Maximum normalerweise nach drei Minuten. Demnach geht die Depolarisierung des Membranpotentials den zytosolischen Calcium-Signalen voraus. Diese Beobachtung wurde von simultanen Messungen beider Antworten bestätigt.
Um der Möglichkeit einer Beteiligung von S-Typ-Anionenkanälen an der LCO-abhängigen Depolarisierung nachzugehen, wurden zwei in den Wurzeln exprimierte M. truncatula-Orthologe der AtSLAC1-Anionenkanal-Familie identifiziert. Die klonierten Anionenkanäle, MtSLAC1, MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B zeigten bei der Untersuchung in Xenopus-Oozyten die typischen Charakteristika von S-Typ-Anionenkanälen. So konnte gezeigt werden, dass MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B eine Proteinkinase sowie externes Nitrat zur Aktivierung benötigen. Außerdem zeichnen sie sich durch eine sehr viel höhere Permeabilität für Nitrat im Vergleich zu Chlorid aus. Ähnlich wie bei AtSLAH3 macht eine Koexpression mit AtSLAH1 genau wie eine intrazelluläre Azidifikation MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B zu Anionenkanälen, die unabhängig von externem Nitrat und einer Phosphorylierung durch eine Proteinkinase aktiv sind.
Weil S-Typ-Anionenkanäle eine hohe Permeabilität für Nitrat aufweisen, wurde der Einfluss von Änderungen der extrazellulären Anionenkonzentration auf die Nod-LCO-induzierte Depolarisierung analysiert. Es stellte sich heraus, dass eine Verringerung der extrazellulären Nitratkonzentration die Antwort beschleunigt. Eine Erhöhung der extrazellulären Chlorid- und Sulfatkonzentration hingegen führte zu einer Verstärkung der Depolarisierung. Diese Beobachtung spricht dafür, dass andere Anionenkanal-Typen wie ALMT-Kanäle an der Depolarisierung des Membranpotentials durch LCOs beteiligt sind.
Die Daten dieser Arbeit zeigen eine Abhängigkeit der Nod-LCO-induzierten Änderungen des Membranpotentials vom M. truncatula-Genotyp. Neben Nod-LCOs lösen auch sulfatisierte Myc-LCOs eine Depolarisierung des Membranpotentials aus. Vermutlich werden sulfatisierte Nod- und Myc-LCOs von demselben Rezeptorsystem erkannt. Die Nod-LCO-induzierte Depolarisierung ist unabhängig von Änderungen des zytosolischen Calcium-Levels. Folglich sind in die Depolarisierung keine S-Typ-Anionenkanäle involviert, die ausschließlich durch Calcium-abhängige Protein-Kinasen aktiviert werden. Interessanterweise lassen sich die MtSLAH2-3-Anionenkanäle aus M. truncatula im Gegensatz zu AtSLAH3 von Calcium-unabhängigen SnRK2/OST1-Proteinkinasen aktivieren. Dies ermöglicht die Aktivierung der MtSLAH2-3-Anionenkanäle in Abwesenheit eines Calcium-Signals.
In weiterführenden Studien sollten die Genexpressionsprofile von Calcium-unabhängigen Proteinkinasen wie SnRK2 und S-Typ-Anionenkanälen aus M. truncatula sowie deren Interaktionen untersucht werden. So könnte eine Aussage darüber getroffen werden, ob diese Proteinkinasen die Anionenkanäle MtSLAH2-3 Nod-LCO-spezifisch aktivieren. Außerdem wäre es von großem Interesse, verschiedene M. truncatula-Mutanten zu untersuchen, denen Gene für MtSLAH2-3A, MtSLAH2-3B und R-Typ-Anionenkanäle fehlen. Diese Experimente könnten zur Identifizierung von Genen führen, die an der frühen Entwicklung der Symbiose beteiligt sind und erklären, warum nur eine kleine Gruppe von Pflanzen dazu in der Lage ist, eine RNS einzugehen, während die AM im Pflanzenreich weit verbreitet ist.
Stomata are pores in the leaf surface, formed by pairs of guard cells. The guard cells modulate the aperture of stomata, to balance uptake of CO2 and loss of water vapor to the atmosphere. During drought, the phytohormone abscisic acid (ABA) provokes stomatal closure, via a signaling chain with both Ca2+-dependent and Ca2+-independent branches. Both branches are likely to activate SLAC1-type (Slow Anion Channel Associated 1) anion channels that are essential for initiating the closure of stomata. However, the importance of the Ca2+-dependent signaling branch is still debated, as the core ABA signaling pathway only possesses Ca2+-independent components. Therefore, the aim of this thesis was to address the role of the Ca2+-dependent branch in the ABA signaling pathway of guard cells.
In the first part of the thesis, the relation between ABA-induced Ca2+ signals and stomatal closure was studied, with guard cells that express the genetically encoded Ca2+-indicator R-GECO1-mTurquoise. Ejection of ABA into the guard cell wall rapidly induced stomatal closure, however, only in ¾ of the guard cells ABA evoked a cytosolic Ca2+ signal. A small subset of stomata (¼ of the experiments) closed without Ca2+ signals, showing that the Ca2+ signals are not essential for ABA-induced stomatal closure. However, stomata in which ABA evoked Ca2+ signals closed faster as those in which no Ca2+ signals were detected. Apparently, ABA-induced Ca2+ signals enhance the velocity of stomatal closure. In addition to ABA, hyperpolarizing voltage pulses could also trigger Ca2+ signals in wild type guard cells, which in turn activated S-type anion channels. However, these voltage pulses failed to elicit S-type anion currents in the slac1/slah3 guard cells, suggesting that SLAC1 and SLAH3 contribute to Ca2+-activated conductance. Taken together, our data indicate that ABA-induced Ca2+ signals enhance the activity of S-type anion channels, which accelerates stomatal closure.
The second part of the thesis deals with the signaling pathway downstream of the Ca2+ signals. Two types of Ca2+-dependent protein kinase modules (CPKs and CBL/CIPKs) have been implicated in guard cells. We focused on the protein kinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23), which is activated by the Ca2+-dependent protein CBL1 or 9 (Calcineurin B-Like protein 1 or 9) via interacting with the NAF domain of CIPK23. The CBL1/9-CIPK23 complex has been shown to affect stomatal movements, but the underlying molecular mechanisms remain largely unknown. We addressed this topic by using an estrogen-induced expression system, which specifically enhances the expression of wild type CIPK23, a phosphomimic CIPK23T190D and a kinase dead CIPK23K60N in guard cells. Our data show that guard cells expressing CIPK23T190D promoted stomatal opening, while CIPK23K60N enhanced ABA-induced stomatal closure, suggesting that CIPK23 is a negative regulator of stomatal closure. Electrophysiological measurements revealed that the inward K+ channel currents were similar in guard cells that expressed CIPK23, CIPK23T190D or CIPK23K60N, indicating that CIPK23-mediated inward K+ channel AKT1 does not contribute to stomatal movements. Expression of CIPK23K60N, or loss of CIPK23 in guard cells enhanced S-type anion activity, while the active CIPK23T190D inhibited the activity of these anion channels. These results are in line with the detected changes in stomatal movements and thus indicate that CIPK23 regulates stomatal movements by inhibiting S-type anion channels. CIPK23 thus serves as a brake to control anion channel activity. Overall, our findings demonstrate that CIPK23-mediated stomatal movements do not depend on CIPK23-AKT1 module, instead, it is achieved by regulating S-type anion channels SLAC1 and SLAH3.
In sum, the data presented in this thesis give new insights into the Ca2+-dependent branch of ABA signaling, which may help to put forward new strategies to breed plants with enhanced drought stress tolerance, and in turn boost agricultural productivity in the future.
Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen
beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein
Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation
hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran
hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden.
Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt.