Institut für Pharmakologie und Toxikologie
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- Na/H-Austauscher (1)
- Na/H-exchanger (1)
- Na\(_V\)1.8 (1)
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- Nebenniere (1)
- Neomycin Resistance (1)
- Nephrotoxicity (1)
- Nervennetz (1)
- Nervenzelle (1)
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- Niereninsuffizienz (1)
- Nierenschädigung (1)
- Nierenschädigungsmarker (1)
- Nierenzellkarzinom (1)
- Nitrosation (1)
- Nitrosativer Stress (1)
- Nitrosierung (1)
- No:cGMP-Signalling (1)
- No:cGMP-Signalweg (1)
- Nrf 2 (1)
- OXPHOS (1)
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- Oxidative Stress (1)
- Oxidative stress (1)
- Oxygen radical (1)
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- PDE-Hemmung (1)
- PDE2 (1)
- PDXP inhibitors (1)
- PKA (1)
- PLCβ3 (1)
- PLP (1)
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- PTH1R (1)
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- Pharmakogenetik (1)
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- alkylating agents (1)
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- transgenic animals (1)
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- vitamin-D-receptor (1)
- volume overload (1)
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- Östrogen (1)
- ß-adrenerge Rezeptoren (1)
- ß-adrenerge Signaltransduktion (1)
- ß-adrenergic Receptors (1)
- β-adrenergic receptors (1)
- β1-adrenoceptor/β1-adrenergic receptor (1)
- βAR (1)
- γ-Aminobutyric acid (GABA) (1)
- γ-H2AX (1)
Institute
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (410)
- Graduate School of Life Sciences (39)
- Rudolf-Virchow-Zentrum (20)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (18)
- Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (11)
- Deutsches Zentrum für Herzinsuffizienz (DZHI) (10)
- Medizinische Klinik und Poliklinik I (10)
- Institut für Anatomie und Zellbiologie (6)
- Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie (5)
- Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin (4)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Institut für Biopsychologie, Universität Dresden (1)
- Johns Hopkins School of Medicine (1)
- Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD, U.S. (1)
- Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften - ISAS - e.V. (1)
- Max Delbrück Center for Molecular Medicine (1)
- Max-Delbrück-Center für molekulare Medizin, Berlin (1)
- Pharmakologie, Universität Bonn (1)
- Pharmazie, Universität Mailand (1)
- Universitätsklinikum Düsseldorf, Institut für Toxikologie (1)
Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
Es gibt viele Hinweise, dass G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bei ihrer Aktivierung durch einen Agonisten ligandenselektive Konformationen eingehen. Ein tatsächlichen Beleg hierfür konnte bisher in lebenden Zellen noch nicht erbracht werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Ansatz gewählt, um ligandenselektive Konformationen in der dritten intrazellulären Schleife des α2a-adrenergen Rezeptors (α2a-AR) in lebenden Zellen darzustellen. Dazu wurden Rezeptorsensoren erstellt, welche jeweils ein CFP am Ende des C-Terminus trugen und in der dritten intrazellulären Schleife an verschiedenen Stellen mit einem Tetracysteinmotiv versehen wurden. Drei Konstrukte wurden verglichen, die das Tetracysteinmotiv N-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne V (I3-N), in der Mitte der dritten intrazellulären Schleife (I3-M) beziehungsweise C-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne VI (I3-C) trugen. Die drei Rezeptorsensoren unterschieden sich hinsichtlich ihrer Ligandenbindung sowie ihrer G-Proteinaktivierung nicht vom Wildtyp α2a-AR. Durch das Tetracysteinmotiv ist es möglich, den Rezeptor spezifisch mit dem niedermolekularen Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) zu markieren, welcher als Akzeptor für den Donor CFP in FRET-Experimenten dient. Die Änderung des FRET-Signals zwischen den beiden Fluorophoren, das durch den vollen Agonist Norepinephrin ausgelöst wurde, war bei allen drei Rezeptorsensoren vergleichbar. Der starke partielle Agonist Clonidin war ebenfalls in der Lage, in allen drei Konstrukten ein ähnliches FRET-Signal hervorzurufen. Dagegen zeigte der partielle Agonist Dopamin an dem Konstrukt I3-N ein signifikant schwächeres Signal, als an I3-C. Die schwachen partiellen Agonisten Octopamin und Norphenephrin konnten an den Konstrukten I3-N und I3-M keine Änderung des FRET-Signals bewirken, wobei an I3-C eine deutliche Signaländerung detektiert wurde. Dies legt nahe, dass die Transmembrandomäne V bei der Aktivierung des Rezeptors eine kleinere Bewegung eingeht als die Transmembrandomäne VI, und bestätigt damit ein auf Röntgenstrukturanlysen basierendes Modell der Rezeptorbewegung. Außerdem wurden die Aktivierungskinetiken für die Agonisten Norepinephrin und Dopamin verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die durch Norepinephrin ausgelöste Bewegung an allen beobachteten Punkten gleich schnell war. Im Gegensatz dazu aktivierte Dopamin I3-C und I3-M ca. 1,5-mal langsamer, als Norepinephrin. Für das I3-N Konstrukt wurde sogar eine 3-mal langsamere Aktivierung gemessen. Diese Daten zeigen, dass unterschiedliche Agonisten in der dritten intrazellulären Schleife spezifische Konformationen auslösen können. Die Untersuchungen zur Rezeptorbewegung im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit dem kleinen Fluorophor FlAsH in Kombination mit einer großen GFP-Variante durchgeführt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der es möglich ist Proteine spezifisch mit beiden kleinen Fluorophoren FlAsH und ReAsH in einer lebenden Zelle zu markieren. Hierfür wurden zwei Tetracysteinmotive, CCPGCC und FLNCCPGCCMEP, gewählt, an die beide kleine Fluorophore kovalent binden. Durch Verdrängungsexperimente mit BAL konnte gezeigt werden, dass FlAsH für beide Motive eine dreifach höhere Affinität besitzt, als ReAsH. Dabei besitzt das FLNCCPGCCMEP-Motiv jedoch eine dreifach höhere Affinität zu dem jeweiligen Fluorophor besitzt als CCPGCC. Durch Ausnutzung dieser Affinitätsunterschiede konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem es möglich ist, beide Motive in einer Zelle zu markieren. Dabei werden zunächst beide Motive mit ReAsH markiert. Durch anschließendes Waschen mit einer geeigneten Konzentration von BAL wird das ReAsH ausschließlich von der CCPGCC-Sequenz verdrängt, wohingegen die FLNCCPGCCMEP-Sequenz mit ReAsH markiert bleibt. Die nun unbesetzte CCPGCC-Sequenz kann dann anschließend mit FlAsH markiert werden, ohne dabei die Bindung des ReAsH an die FLNCCPGCCMEP-Sequenz zu beeinflussen. Um die Funktionalität dieses Protokolls zu überprüfen, sollten zwei verschiedene Proteine mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisation in einer lebenden Zelle spezifisch mit jeweils einem kleinen Fluorophor markiert werden. Hierzu wurden ein PTH-Rezeptor, in dem im C-Terminus die FLNCCPGCCMEP-Sequenz eingebracht wurde, mit ReAsH und ein β-Arrestin-2, dem die CCPGCC-Sequenz eingebracht wurde, in Zellen co-exprimiert und gemäß dem Protokoll mit FlAsH und ReAsH markiert. Beide Proteine konnten spezifisch markiert werden, wobei der mit ReAsH markierte PTH-Rezeptor eine deutliche Lokalisation in der Zellmembran zeigte. Durch sequentielle Exzitation konnte in der gleichen Zelle das zytosolisch lokalisierte, mit FlAsH markierte β-Arrestin-2 detektiert werden. Wurden die so markierten Zellen mir 1 µM PTH stimuliert, wurde das FlAsH-markierte β-Arrestin-2 an die Zellmembran rekrutiert. Somit konnte durch die Entwicklung dieses Protokolls eine duale spezifische Markierung von Proteinen mit zwei kleinen Fluorophoren zu innerhalb einer Zelle erreicht werden.
Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener β-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne β-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes.
trans-1,1,1,3-Tetrafluoropropene (HFO-1234ze) and 2,3,3,3-tetrafluoropropene (HFO-1234yf) are non-ozone-depleting fluorocarbon replacements with low global warming potentials and short atmospheric lifetimes. They are developed as foam blowing agent and refrigerant, respectively. Investigations on biotransformation in different test species and in vitro systems are required to assess possible health risks of human exposure and needed for commercial development. The biotransformation of HFO-1234ze and HFO-1234yf was therefore investigated after inhalation exposure. Male Sprague-Dawley rats were exposed to air containing 2 000; 10,000; or 50,000 ppm (n=5/concentration) HFO-1234ze or HFO-1234yf. Male B6C3F1 mice were only exposed to 50,000 ppm HFO-1234ze or HFO-1234yf. Due to lethality observed in a developmental study with rabbits after exposure to high concentrations of HFO-1234yf, the metabolic fate of the compound was tested by whole body inhalation exposure of female New Zealand White rabbits to air containing 2 000; 10,000; or 50,000 ppm (n=3/concentration) HFO-1234yf. All inhalation exposures were conducted for 6 h in a dynamic exposure chamber. After the end of the exposures, animals were individually housed in metabolic cages and urines were collected at 6 or 12 h intervals for 48 h (rats and mice) or 60 h (rabbits). For metabolite identification, urine samples were analyzed by 1H-coupled and 1H-decoupled 19F-NMR and by LC/MS-MS or GC/MS. Metabolites were identified by 19F-NMR chemical shifts, signal multiplicity, 1H-19F coupling constants and by comparison with synthetic reference compounds. Biotransformation of HFO-1234ze in rats exposed to 50,000 ppm yielded S-(3,3,3-trifluoro-trans-propenyl)mercaptolactic acid as the predominant metabolite which accounted for 66% of all integrated 19F-NMR signals in urines. No 19F-NMR signals were found in spectra of rat urine samples collected after inhalation exposure to 2 000 or 10,000 ppm HFO-1234ze likely due to insufficient sensitivity. S-(3,3,3-Trifluoro-trans-propenyl)-L-cysteine, N-acetyl-S-(3,3,3-trifluoro-trans-propenyl)-L-cysteine, 3,3,3-trifluoropropionic acid and 3,3,3-trifluorolactic acid were also present as metabolites in urine samples of rats and mice at the 50,000 ppm level. A presumed amino acid conjugate of 3,3,3-trifluoropropionic acid was the major metabolite of HFO-1234ze in urine samples of mice exposed to 50,000 ppm and related to 18% of total integrated 19F-NMR signals. Quantitation of three metabolites in urines of rats and mice was performed, using LC/MS-MS or GC/MS. The quantified amounts of the metabolites excreted with urine in both mice and rats, suggest only a low extent (<<1% of dose received) of biotransformation of HFO-1234ze and 95% of all metabolites were excreted within 18 h after the end of the exposures (t1/2 approx. 6 h). Due to its low boiling point of −22 °C, most of the inhaled HFO-1234ze is expected to be readily exhaled. Moreover, steric and electronic factors may decrease the reactivity of the parent compound with soft nucleophiles such as glutathione. The obtained results suggest that HFO-1234ze is subjected to an addition-elimination reaction with glutathione and to a cytochrome P450-mediated epoxidation at low rates. The extent of a direct addition reaction of HFO-1234ze with glutathione is negligible, compared to that of the observed addition-elimination reaction. The results of in vivo testing of HFO-1234ze could not be supported by in vitro investigations, since HFO-1234ze was not metabolized in incubations with either liver microsomes or subcellular fractions from rat and human. Regarding the structures delineated in the biotransformation scheme of HFO-1234ze, 1,1,1,3-tetrafluoroepoxypropane and 3,3,3-trifluoropropionic acid are toxic intermediates which, however, are not supposed to display toxicity in the species after exposure to HFO-1234ze, due to the low extent of formation and an efficient detoxification of the epoxide by hydrolysis and glutathione conjugation. The findings of biotransformation of HFO-1234ze in rats and mice correlate with the absence of adverse effects in the toxicity testings and indicate their innocuousness to a human exposure. Biotransformation of HFO-1234yf yielded N-acetyl-S-(3,3,3-trifluoro-2-hydroxypropanyl)-L-cysteine as predominat metabolite which accounted for approx. 44, 90 and 32% (50,000 ppm) of total 19F-NMR signal intensities in urine samples from rabbits, rats and mice, respectively. S-(3,3,3-Trifluoro-2-hydroxypropanyl)mercaptolactic acid and the sulfoxides of mercapturic acid and mercaptolactic acid S-conjugate were identified as minor metabolites of HFO-1234yf in urine samples from rabbits, rats and mice, whereas trifluoroacetic acid, 3,3,3-trifluorolactic acid and 3,3,3-trifluoro-1-hydroxyacetone were present as minor metabolites only in urine samples from rats and mice. The absence of these metabolites in rabbit urine samples...
Evaluation of 1H-NMR and GC/MS-based metabonomics for the assessment of liver and kidney toxicity
(2009)
For the assessment of metabonomics techniques for the early, non-invasive detection of toxicity, the nephrotoxins gentamicin (s.c. administration of 0, 60 and 120 mg/kg bw 2x daily for 8 days), ochratoxin A (p.o. administration of 0, 21, 70 and 210 µg/kg bw 5 days/week for 90 days) and aristolochic acid (p.o. administration of 0, 0.1, 1.0 and 10 mg/kg bw for 12 days) were administered to rats and urine samples were analyzed with 1H-NMR and GC/MS. Urine samples from the InnoMed PredTox project were analyzed as well, thereby focusing on 1H-NMR analysis and bile duct necrosis as histopathological endpoint. 1H-NMR analysis used water supression with the following protocol: 1 M phosphate buffer, D2O as shift lock reagent, D4-trimethylsilylpropionic acid as chemical shift reference, noesygppr1d pulse sequence (Bruker). For multivariate data analysis, spectral intensity was binned into 0.04 ppm wide bins. GC/MS analysis of urine was carried out after protein precipitation with methanol, drying, derivatization with methoxyamine hydrochloride in pyridine and with methyl(trimethylsilyl)trifluoroacetamide on a DB5-MS column using EI ionization. The chromatograms were prepared for multivariate data analysis using the R-program based peak picking and alignment software XCMS version 2.4.0. Principal component analysis (PCA) to detect and visualize time-point and dose-dependent differences between treated animals and controls and orthogonal projection to latent structures discriminant analysis (OPLS-DA) for identification of potential molecular markers of toxicity was carried out using SIMCA P+ 11.5 1H-NMR-based markers were identified and quantified with the Chenomx NMR Suite, GC/MS based markers were identified using the NIST Mass Spectral Database and by co-elution with authentic reference standards. PCA of urinary metabolite profiles was able to differentiate treated animals from controls at the same time as histopathology. An advantage over classical clinical chemistry parameters regarding sensitivity could be observed in some cases. Metabonomic analysis with GC/MS and 1H-NMR revealed alterations in the urinary profile of treated animals 1 day after start of treatment with gentamicin, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate, trigonelline and 3-indoxylsulfate increased excretion of 5-oxoproline, lactate, alanine and glucose were observed. Ochratoxin A treatment caused decreased excretion of citrate, 2-oxoglutarate and hippurate and and increased excretion of glucose, myo-inositol, N,N-dimethylglycine, glycine, alanine and lactate as early as 2 weeks after start of treatment with 210µg OTA/kg bw, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Integration of histopathology scores increased confidence in the molecular markers discovered. Aristolochic acid treatment resulted in decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate and creatinine as well as increased excretion of 5-oxoproline, N,N-dimethylglycine, pseudouridine and uric acid. No alterations in clinical chemistry parameters or histopathology were noted.Decreased excretion of hippurate indicates alterations in the gut microflora, an effect that is expected as pharmacological action of the aminoglycoside antibiotic gentamicin and that can also be explained by the p.o. administration of xenobiotica. Decreased Krebs cycle intermediates (citrate and 2-oxoglutarate) and increased lactate is associated with altered energy metabolism. Increased pseudouridine excretion is associated with cell proliferation and was observed with aristolochic acid and ochratoxin A, for which proliferative processes were observed with histopathology. 5-oxoproline and N,N-dimethylglycine can be associated with oxidative stress. Glucose, a marker of renal damage in clinical chemistry, was observed for all three nephrotoxins studied. Single study analysis with PCA of GC/MS chromatograms and 1H-NMR spectra of urine from 3 studies conducted within the InnoMed PredTox project showing bile duct necrosis revealed alterations in urinary profiles with the onset of changes in clinical chemistry and histopathology. Alterations were mainly decreased Krebs cycle intermediates and changes in the aromatic gut flora metabolites, an effect that may result as a secondary effect from altered bile flow. In conclusion, metabonomics techniques are able to detect toxic lesions at the same time as histopathology and clinical chemistry. The metabolites found to be altered are common to most toxicities and are not organ-specific. A mechanistic link to the observed toxicity has to be established in order to avoid confounders such as body weight loss, pharmacological effects etc. For pattern recognition purposes, large databases are necessary.
G-Protein-gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kalium-Kanäle sind durch zwei Eigenschaften gekennzeichnet: (I) Die Leitfähigkeit für K+-Ionen ist positiv des Kalium-Gleichgewichtspotentials reduziert und (II) die Kanal-Aktivität wird durch Bindung von G betagamma-Dimere heterotrimerer Gi/o-Proteine reguliert. In der Literatur wurde die Aktivierung von GIRK-Kanälen als eine Zunahme ihrer Offenwahrscheinlichkeit unabhängig vom Membranpotential beschrieben. Die vorliegenden Untersuchungen zeigten, dass es bei starker Aktivierung des GIRK-Kanals durch G betagamma-Dimere auch zu einer Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung kommt. Im heterologen Expressionssystem konnte bei Rezeptor-Stimulation mit Agonist die Einwärtsgleichrichtung von GIRK-Kanälen abhängig von der Stärke der Koexpression von G betagamma-Dimeren geschwächt werden. Dieser Effekt entstand nicht durch eine Veränderung der Affinität, mit der Polyamine und Mg2+-Ionen den GIRK-Kanal membranpotentialabhängig blockieren. Die Kinetik, mit der Polyamine den GIRK-Kanal blockieren, war nicht verändert; eine Erhöhung der intrazellulären Mg2+-Konzentration um den Faktor 20 konnte eine Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung nicht mindern. Es wurde vermutet, dass eine Änderung der Konformation von Strukturen nahe des Selektivitätsfilters die Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung verursacht. Gestützt wurde diese Vermutung zum einen dadurch, dass Ba2+- und Cs+-Ionen, die von extrazellulärer Seite her den Kanal an Strukturen nahe des Selektivitätsfilters blockieren können, unter schwach einwärtsgleichrichtenden Bedingungen eine geringere Bindungsaffinität hatten und zum anderen dadurch, dass das relative Ausmaß des GIRK-Kanal-Blocks durch Cs+-Ionen mit der Stärke der Einwärtsgleichrichtung korrelierte.
Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.
Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden.
The widely used chemical acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen. This classification was based on positive results in rodent carcinogenicity studies as well as on a number of in vitro mutagenicity assays. In 2002, AA was discovered to be formed during the preparation of starch-containing foods. According to the latest FDA exposure assessment (2006), the average daily intake has been estimated from AA levels in foodstuffs and from nutritional habits to be around 0.4 µg/kg b.w. with a 90th percentile of 0.95 µg/kg b.w.. In children and adolescents however, the daily AA intake is about 1.5 times higher, due to lower body weight and differing consumption patterns. Apart from the diet, humans may be exposed to AA during the production or handling of monomeric AA, from AA residues in polyacrylamides, and from cigarette smoke. After oral administration, AA is readily absorbed and distributed throughout the organism. AA is metabolized to the reactive epoxide glycidamide (GA) via the CYP 450 isoenzyme CYP 2E1. Both, AA and GA are conjugated with glutathione. After enzymatic processing, the mercapturic acids N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)-L-cysteine (AAMA) as well as the regioisomers N-Acetyl-S-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cysteine (GAMA) and N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxy-ethyl)-L-cysteine (iso-GAMA) are excreted with urine. An additional pathway for the metabolic conversion of GA is the epoxide hydrolase mediated hydrolysis to the diol compound glyceramide. Following administration of AA at doses exceeding the daily dietary intake by a factor of 1000 - 6000 to human subjects, a new urinary metabolite was found, which could be identified as the S-oxide of AAMA (AAMA-sulfoxide). In general, data from animal studies are used for risk assessment of (potential) human carcinogens. However, inter-species differences in toxicodynamics or toxicokinetics, e.g. in biotransformation may lead to under- or overestimation of human risk. The objective of this work was to establish a highly specific and sensitive analytical method to quantify the major urinary metabolites of AA. Other aims apart from measurements concerning the human background exposure were the evaluation of biotransformation and toxicokinetics of AA in humans and rats after oral administration of 13C3-AA. The obtained data was intended to help avoid linear extrapolation from animal models for future risk assessments of AA carcinogenicity.
Kaffee, die in der westlichen Welt am häufigsten verwendete psychoaktive Substanz, erwies sich im Mikrokern-Testes an Maus-Lymphomzellen L 5178Y als modulierend auf bekannte mutagene Agentien. In dieser Arbeit wurde meist Instantkaffee verwendet, der gegen N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Mitomycin C (MMC), Genistein, und Methylmethansulfonat getestet wurde. Bei MMC und Genistein erwies sich Kaffee als antimutagen. Bei MNNG hatte Kaffee keinen klaren Einfluss auf die Gentoxizität, ebenso blieb die Kaffee-Wirkung bezüglich MMS unklar. Kaffee minderte dosisabhängig das Wachstum und die Überlebensrate von L 5178Y - Zellen. Es wurde die Frage nach den Ursachen der modulierenden Effekte diskutiert. Insbesondere wurde die Hypothese erörtert, dass für die Richtung der Modulation nicht so sehr die Konzentration des Kaffees, sondern die mutagene Potenz der koinkubierten Substanz eine entscheidende Rolle spielen könnte. Ggf. wirkt Kaffee - im Sinne eines "abhärtenden" Effektes - bei schwach mutagenen Substanzen anitmutagen, bei stark mutagenen Substanzen hingegen synergistisch mutagen.
Bei Dialysepatienten sind vermehrte Genomschäden bekannt, sie unterliegen auch einer erhöhten Karzinominzidenz. Erhöhte Genomschäden können in vivo durch die Substitution von Folsäure reduziert werden, unter Gabe von Vitamin B12 sinkt die Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Agentien. 27 Dialysepatienten nahmen an dieser Studie teil. Die 9 Patienten der Substitutions-gruppe Folsäure erhielten dreimal wöchentlich 15 mg Folsäure intravenös, den 10 Patienten der Substitutionsgruppe Folsäure + Vitamin B12 wurde zusätzlich einmal wöchentlich 1000 µg Vitamin B12 intravenös verabreicht. 8 Dialysepatienten und 7 nicht dialysepflichtige Probanden dienten als Kontrolle. Zu drei Zeitpunkten vor und drei Zeitpunkten nach Substitutionsbeginn wurden die Mikrokernfrequenzen in peripheren, doppelkernigen Lymphozyten bestimmt. Mikro-kerne dienen als Marker für Genomschäden, die Methode ist gut erprobt und es ist ein Zusammenhang zwischen erhöhten Mikrokernfrequenzen und einer prospektiv erhöhten Karzinominzidenz beschrieben. Weiterhin wurden die Homocystein-Plasmaspiegel vor und nach Substitutionsbeginn gemessen. Homocystein zählt zu den Urämietoxinen, in vitro steigt bei erhöhten Homocysteinwerten dosisabhängig der Genomschaden in Form von Mikrokernen an. Vor Substitutionsbeginn wiesen die Dialysepatienten um ein mehrfaches gegenüber den Referenzwerten erhöhte Mikrokernfrequenzen auf, wobei die Mikrokernfrequenzen der Frauen deutlich über denen der Männer lagen. Mit zunehmender Dialysedauer kam es zu einer Reduktion der Mikrokernfrequenz, wobei diese immer noch gegenüber den Referenzwerten erhöht blieb. Unter Gabe von Folsäure + Vitamin B12 kam es zu einem signifikant stärkeren Rückgang der Mikrokernfrequenz als unter alleiniger Folsäuregabe. Dieser Rückgang unter Vitaminsubstitution nahm mit zunehmendem Dialysealter zunächst zu, bei einer Dialysedauer von länger als 10 Jahren nahm er wieder ab. Die Homocysteinspiegel waren vor Substitutionsbeginn deutlich erhöht. Unter kombinierter Gabe von Folsäure und Vitamin B12 kam es zu einer signifikanten Reduktion der Homocysteinwerte, so dass diese sogar unterhalb der im Normbereich liegenden Homocysteinwerte der nicht dialysepflichtigen Kontrollgruppe lagen. Ob die in der Studie vielversprechende kombinierte Substitution von Folsäure und Vitamin B12 tatsächlich das Krebsrisiko von Dialysepatienten beeinflussen kann, wird nur durch prospektive Langzeitstudien zu klären sein. Ebenfalls werden weitere Studien nötig sein, um die optimale Dosis, welche möglicherweise in Abhängigkeit von Alter, Geschlecht, Dialysedauer und Grunderkrankung variieren kann, zu ermitteln. Weitere Vorteile einer therapeutischen Gabe von Folsäure und Vitamin B12 liegen sicherlich einerseits in den vergleichsweise geringen Kosten und andererseits in der guten Verträglichkeit, welche für die Compliance der Patienten von großer Bedeutung ist.
Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Phänotyp hierfür der Begriff „Metabotyp“ geprägt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, können Signaturen gegenübergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einführung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die ursprünglich zur Prädiktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu übertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben präklinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ernährung einen Schritt näher zu kommen. Da sich die ursprünglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anfällig gegenüber biologischen und analytischen Einflussgrößen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckflüssigchromatographie erwies sich hierbei für das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datensätze resultierten, die häufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen“ zu können. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zusätzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufwändiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschränkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, können die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erhöht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Schädigungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verfügt der Körper über einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkaptursäuren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkaptursäurederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilitätsmarkerklasse der Merkaptursäuren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker für diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erhöht werden.
Die Herzinsuffizienz ist eine der führenden Todesursachen weltweit. Eine auf die neurohumorale Aktivierung zugeschnittene Therapie mit ACE-Hemmern bzw. Angiotensin-Rezeptorantagonisten, Betablockern, Aldosteronantagonisten und Diuretika verbessert zwar die Symptomatik und Prognose. Letztere ist bei Diagnosestellung jedoch immer noch schlechter als die vieler maligner Erkrankungen einzuschätzen. Ziel ist daher die Entwicklung von Medikamenten, die den Krankheitsverlauf des Syndroms Herzinsuffizienz aufhalten bzw. umkehren. Ein Ansatz ist dabei die Analyse sogenannter Kandidatengene, die im kranken Herzen differentiell exprimiert werden und potentiell medikamentös beeinflussbar sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei solcher Kandidatengene charakterisiert. Mäuse mit kardialer Überexpression b1-adrenerger Rezeptoren entwickeln eine Herzinsuffizienz mit kardialer Hypertrophie und Fibrose. In Gen Arrays mit 21000 Maus-ESTs zeigten sich unter anderem die Gene des Uncoupling Protein 2 (UCP2) und der Diphosphoinositol-Polyphosphat-Phosphohydrolase 2 alpha (DIPP2a) aktiviert. Diese Befunde wurden zunächst mittels RNase Protection Assay und RT-PCR bestätigt. Auch andere murine Herzinsuffizienzmodelle wurden untersucht. So ließ sich ebenfalls im druckinduzierten Herzinsuffizienzmodell nach artifizieller Aortenstenose sowie im b2-AR überexprimierenden Herzen eine erhöhte Konzentration von UCP2- und DIPP2a-mRNA messen. Um zu prüfen, ob diese differentielle mRNA-Expression deletäre oder protektive Effekte vermittelt, wurden jeweils transgene Mauslinien mit herzspezifischer Überexpression von UCP2 und DIPP2a generiert. Die Linie UCP2-TG1 mit hoher Überexpression sowie ein Gründer-Tier der UCP2-transgenen Mäuse entwickelten eine Herzinsuffizienz mit vergrößertem Herzen, linksventrikulärem Pumpversagen, interstitieller Fibrose und typischen Veränderungen der molekularen Marker ANF und SERCA. Zudem fanden sich dilatierte Vorhöfe sowie eine bradykarde Herzrhythmusstörung. UCP2 ist ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung im Mitochondrium. Im energieintensiven Stoffwechsel des Myokards könnte eine durch UCP2 reduzierte ATP-Synthese zu den genannten Veränderungen führen. Für UCP2 wurden auch protektive Eigenschaften durch das Abfangen freier Radikale beschrieben. Die Linie UCP2-TG3 mit niedrigerem Überexpressionsniveau und ohne kardialen Phänotyp wurde deshalb einem Aortic banding unterzogen, wo sich in der Überlebenskurve kein protektiver oder deletärer Effekt einer moderat vermehrten Entkopplung im Vergleich zum Wildtyp zeigte. In drei unabhängigen Linien transgener Mäuse mit herzspezifischer Überexpression von DIPP2a ließ sich morphometrisch eine kardiale Hypertrophie nachweisen. Die Linie DIPP2a-TG9 mit dem höchsten Überexpressionsniveau zeigte zudem eine kardiale Fibrose sowie unter Dobutamin eine verminderte kardiale Kontraktilitätsreserve im Vergleich zum Wildtypen. DIPP-Proteine hydrolysieren Inositolphosphate und Nukleosiddiphosphate und greifen so in zentrale Stoffwechselvorgänge ein, die im einzelnen noch nicht geklärt sind. Es konnte hier im Mausmodell gezeigt werden, dass UCP2 und DIPP2a zwei für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz relevante Zielproteine darstellen. Geplant ist die weitere Aufklärung der beteiligten Mechanismen, um diese letztlich auch therapeutisch beeinflussen zu können.
Nierenerkrankungen und die dazu gehörige Nierenersatztherapien spiegeln im Verlauf der letzten fünfzig Jahren die rasanten Entwicklungen der heutigen hochtechnisierten Medizin wider. Durch die zunehmende Lebenserwartung der Patienten unter langjährigen Blutreinigungsverfahren werden Probleme sichtbar, die vorher nicht zu erwarten waren, insbesondere ist hier die schwerwiegende Problematik der erhöhten Malignominzidenz in dieser Bevölkerungspopulation hervorzuheben. Die Ursachenforschung und die Prävention dieser erhöhten Malignominzidenz wird immer wichtiger. Die Zahl der Betroffenen steigt kontinuierlich. "Moderne" Erkrankungen wie Diabetes mellitus und arterielle Hypertonie, die zur terminalen Niereninsuffizienz führen, haben die Dimension von Volkserkrankungen erreicht. Die Entstehung von Mikrokernen im Zellplasma neben dem eigentlichen Zellkern steht im dringendem Verdacht, dass sie einen Schritt in der Mutationsinduktion und Kanzerogenese darstellen und/oder diese Entwicklung anzeigen. Die Mikrokernfrequenz wird auch als Marker für eine akzidentelle oder chronische Schädigung des Genmaterials (z.B. nach beruflicher Exposition) genutzt. Auf zellulärer Ebene ist die Mikrokerninduktion auch Zeichen einer herabgesetzten Funktion der DNA-Repairmechanismen. Defekte dieser Mechanismen begünstigen nachgewiesenermaßen die Entstehung von Malignomen aller Art. Ziel der Arbeit war zu zeigen ob die in vivo beobachtete erhöhte Malignominzidenz bei Patienten unter Hämodialyse auch in Mikrokernfrequenzen abgebildet werden kann. Hier wurde die in vitro Behandlung mit einer bekannten kanzerogenen Substanz verwendet, um eine eventuell veränderte zelluläre Antwort in Form von gesteigerter Mikrokernfrequenzen in vitro zu provozieren. Dies wird als indirektes Zeichen der DNA-Repairfähigkeit angesehen. Als Substanz wurde Methylmethansulfonat verwendet. Die dafür modifizierte Methodik mit der Zusatz des kanzerogenen Methylmethansulfonat in Konzentrationen von 10, 20 und 40 µg/ml war ein zusätzlicher Stress für die Zellkulturen. Diese ließ aber in ausreichendem Maße die Vermehrung und Induktion von doppelkernigen Lymphozyten zu, so dass die Registrierung der Mikrokerne glaubhaft und repräsentativ war. Es wurden drei Gruppen von Probanden untersucht: Personen unter Dialyse, Patienten in einem Prädialysestadium und nierengesunde Probanden als Kontrollgruppe. Die Hämodialysepatienten zeigten keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollpatienten. Tendenziell erhöhte Mikrokernraten zeigten die Prädialysepatienten in allen Kategorien. Erwartungsgemäß war bei älteren Personen-Subgruppen eine gesteigterte Rate an in vitro induzierten Mikrokernen nach Erhöhung der kanzerogenen Substanzkonzentration zu finden. Es müssen sicherlich weitere Faktoren identifiziert werden, um den genetischen Schaden durch die verminderte DNA-Repairkapazität in Form von Mikrokernen zuverlässig abbilden zu können. Hier könnten eine Mindestdauer der Dialyse von 10 Jahren sowie ein Kreatininwert von über 5 mg/dl eine entscheidende Rolle spielen.
Die vorliegende Studie zeigt erstmals, dass eine erhöhte Ca2+-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente im Tiermodell einen selbstständigen Risikofaktor bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen darstellt. Dies konnte sowohl für chronische Erhöhung der Ca2+-Empfindlichkeit im Rahmen einer Familiären Hypertrophen Kardiomyopathie (FHK) als auch für eine akute Erhöhung mit Hilfe eines Ca2+-Sensitizers gezeigt werden. Die Ergebnisse der Arbeit bieten so eine mögliche Erklärung für plötzlichen Herztod bei bestimmten Patienten mit FHK. Sie schränken weiterhin den Einsatz von Ca2+-Sensitizern ein. Schließlich beleuchten sie einen bisher kaum untersuchten Aspekt in der Arrhythmogenese von Herzinsuffizienz und nach einem Myokard-Infarkt. Auf zellulärer Ebene findet sich ein veränderter Ca2+-Zyklus mit erniedrigten und verlangsamten Transienten. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich eine direkte Konsequenz der erhöhten Bindungsaffinität für Ca2+. Die Myofilamente sind „klebriger“ für Ca2+, während der Systole wird mehr Ca2+ gebunden, während der Diastole hingegen dissoziiert es langsamer. Bei adrenerger Stimulation und schnellen Herzfrequenzen mit entsprechender Verkürzung der Diastole kommt es zu erhöhtem diastolischem [Ca2+]i und zu erhöhten Ca2+-Inhalt des Sarkoplasmatischen Retikulums. Der so veränderte Ca2+-Zyklus führt wahrscheinlich mit Hilfe des Na+/Ca2+-Austauschers zu Veränderungen der Repolarisation des Aktionspotentials. Bei schnellen Herzfrequenzen treten Aktionspotential-Verlängerung, Ca2+-abhängige Nachdepolarisationen und getriggerte Schläge auf. Auf Organ-Ebene findet sich eine verkürzte Refraktärzeit. Damit sind sowohl ein Trigger als auch ein arrhythmogenes Substrat für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien gegeben.
In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes.
alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielfältige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzelluläre Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle für die funktionelle Diversität der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellulären Lokalisation der Rezeptoren abhängt. Hierfür wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Phäochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Fortsätze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformationsänderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellulärer Lokalisation abhängig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen höhere Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zusätzlich zur Diversität der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zelluläre Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle für dessen Funktion spielt.
Vor etwas mehr als 20 Jahren wurden erstmals an das Myokard bindende beta1-Rezeptorantikörper im Zusammenhang mit der Chagas-Krankheit beschrieben. Die Arbeiten der beiden folgenden Jahrzehnte konnten zeigen, dass solche beta1-Rezeptorantikörper mit einer Prävalenz von ca. 30 bis 95% (in Abhängigkeit vom verwendeten Nachweisverfahren) v.a. auch bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) nachgewiesen werden können. Insbesondere Antikörper gegen die zweite extrazelluläre Domäne des beta1-adrenergen Rezeptors (beta1-ECII) scheinen dabei in der Lage zu sein, den Rezeptor funktionell zu beeinflussen und zu aktivieren. Beta1-ECII wurde in der Folge als potentes Autoantigen mit T- und B-Zell-Epitopen identifiziert. Erste klinische Untersuchungen an Patienten mit DCM haben gezeigt, dass das Vorhandensein zirkulierender b1-ECII-Antikörper mit einer schlechteren linksventrikulären Funktion, dem Auftreten ventrikulärer Arrhythmien sowie mit einer erhöhten kardiovaskulären Mortalität verbunden ist. Der Verdacht, dass beta1-Antikörper bei der DCM nicht nur ein Epiphänomen, sondern bei einem Teil der betroffenen Patienten auch mögliche Krankheitsursache darstellen könnten, verstärkten dann in jüngster Zeit die Bestrebungen, ein Tiermodell für die Antikörper-induzierte Genese einer Kardio-myopathie zu generieren. So fanden 1997 Matsui et al. im Kaninchenmodell nach Immunisierung mit einem beta1-ECII-homologen Peptid über 12 Monate eine biventrikuläre Dilatation und kompensatorische Hochregulation der beta-Adrenozeptoren im Myokard. Im Gegensatz dazu fanden Iwata et al. wenige Jahre später im gleichen Tiermodell nach 6-monatiger Immunisierung eine linksventrikuläre Hypertrophie bei beta1-ECII-Antikörper-positiven Tieren und eine Downregulation der beta-Rezeptoren. Diese Diskrepanzen ließen das Kaninchenmodell daher als fraglich geeignet erscheinen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurde die Lewis-Ratte zur Generierung eines Kardiomyopathiemodells gewählt, da die beta1-ECII-Sequenz bei Ratte und Mensch 100% homolog ist. Zur Immunisierung verwendeten wir ein Fusionsprotein aus GST und der humanen beta1-ECII-Sequenz. Der Schwerpunkt des Vorhabens lag auf der Charakterisierung der durch die Immunisierung induzierten morphologischen und funktionellen Veränderungen am Herzen der Versuchstiere. Echokardiographisch konnte bei immunisierten Tieren bereits nach 9 Monaten eine linksventrikuläre Erweiterung nachgewiesen werden, die sich nach 12 bzw. 15 Immunisierungsmonaten durch das Auftreten einer progredienten linksventrikulären Dysfunktion (Echokardiographie/Herzkatheteruntersuchung) auch funktionell manifestierte. Makroskopisch-morphometrisch ließ sich an Paraffinschnitten eine Erweiterung des linken Ventrikels bei relativer Abnahme der Wanddicke nachweisen und bestätigte somit histologisch die echokardiographischen Messungen. Die mikroskopische Analyse zeigte eine relative Vergrößerung der Kardiomyozytenkerne ohne signifikante Zellhypertrophie. Durch Radioligandenbindungsversuche konnte zudem in beta1-ECII-immunisierten Tieren eine Downregulation der kardialen beta1-Rezeptoren nachgewiesen werden. Durch die Immunisierung mit beta1-ECII-Antigen konnte der Phänotyp einer DCM somit erstmals in der Ratte induziert werden. Dieser Phänotyp ist vermutlich überwiegend auf die agonist-ähnliche funktionelle Aktivität der durch spezifische Immunisierung induzierten beta1-Rezeptorantikörper zurückzuführen. Das vorgestellte Tiermodell erfüllt dabei einerseits die immunologischen Kriterien des 1. Koch’schen Postulats für den „indirekten“ Nachweis einer Kardiomyopathieinduktion durch Antikörper, die gegen die zweite extrazelluläre Domäne des b1-adrenergen Rezeptors gerichtet sind. Andererseits lieferte es im Anschluss auch die direkte Evidenz für eine kausale Rolle solcher Antikörper bei der Induktion einer Autoimmunkardiomyopathie durch den Transfer induzierter Antikörper auf genetisch identische, herzgesunde Ratten (Nachahmen von Rezeptor-Autoantikörpern). Zukünftig könnte dieses Tiermodell auch dazu dienen, weitere immunologische Faktoren, die an der Entwicklung einer Autoimmunkardiomyopathie durch beta1-Rezeptor-antikörper beteiligt sind, zu untersuchen. Ferner können mit diesem Modell neue therapeutische Ansätze für die Behandlung der Rezeptorantikörper-positiven Kardiomyopathie entwickelt werden, mit dem Ziel einer späteren Anwendung im Tiermodell erprobter Strategien auch bei Antikörper-positiven Patienten.
Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositionsbiomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss.
Arsen ist dafür bekannt, dass es mutagen und kanzerogen wirkt und ein gentoxisches Potential besitzt. Die Mechanismen, durch die diese Effekte ausgeübt werden, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Parameter, die mit der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxiddismutaseaktivität und Hämoxygenase-Genexpression, und Veränderungen des epigenetischen Musters der DNA, z.B. Depletion von S-Adenosylmethionin, in Zusammenhang stehen, durch Arsen beeinflusst werden. In dieser Studie wurde versucht, das gentoxische Potential von Arsen mit Hilfe des Comet Assay, eines Standard-Gentoxizitätstests, zu charakterisieren sowie zu prüfen, ob dieser Test eine geeignete Messmethode für die gentoxische Wirkung von Arsen darstellt. Dies wurde unter Heranziehung verschiedener additiver Messgrößen wie der Vitalität und der Proliferation sowie der parallelen Quantifizierung der Mitose-, C-Mitose-, Mikrokern- und Apoptosefrequenzen der verwendeten murinen L5178Y-Zellen durchgeführt. Des Weiteren wurde der den Arsen-bedingten DNA-Schäden zugrundeliegende Mechanismus genauer beleuchtet. Unter Zuhilfenahme verschiedener Modulatoren wurden durch Arsen induzierter oxidativer Stress und durch Arsen induzierte Veränderung der epigenetischen DNA-Struktur untersucht. Ferner wurde geprüft, inwieweit die Inhibition von oxidativem Stress und Hypomethylierung der DNA zur Verringerung von potenziellen Folgen wie der Entstehung unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen beitragen können, die wiederum eventuell in der Entstehung von Karzinomen resultieren können. Für die Modulation der Freisetzung von ROS wurden als prooxidative Substanz 4-Nitrochinolin-1-Oxid und als Antioxidantien Benfotiamin (Vitamin-B1-Prodrug), N-Acetylcystein (NAC) und α-Tocopherol (Vitamin E) ausgewählt. Das Methylierungs¬muster der DNA sollte durch das hypomethylierende Agens 5-Azacytidin und durch die potenziell hypermethylierenden Verbindungen S-Adenosylmethionin (SAM) und Folat beeinflusst werden. Die Untersuchungen bezüglich des gentoxischen Potentials von Arsen und die Eignung des Comet Assay für dessen Quantifizierung ergaben, dass unter Miteinbeziehung der erwähnten additiven Parameter und der Quantifizierung nach Behandlung mit unterschiedlichen Arsen-Konzentrationen nach unterschiedlich langen Behandlungszeiten die im Comet Assay erzielten Werte als korrekt und zuverlässig angesehen werden können. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen der Freisetzung von ROS und der Veränderung des DNA-Methylierungsmusters mit Hilfe von Modulatoren, dass beide Mechanismen an den Arsen-induzierten Effekten beteiligt sind. Nicht nur konnte mit Hilfe der Modulatoren jeweils die Inhibition der Freisetzung von ROS und der DNA-Hypomethylierung erreicht werden, es konnte zudem gezeigt werden, dass die Substanzen auch die Reduktion der erhöhten Anzahl unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen bewirkten. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie zum ersten Mal aufgezeigt werden und könnte im Hinblick auf die potenzielle Erniedrigung der Krebsinzidenzen durch Supplementierung der Bevölkerung in Gebieten mit Arsen-belastetem Trinkwasser mit den genannten Modulatoren von Bedeutung sein.
Um realistische Risikoabschätzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu können, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung loslöst. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizität einer Kombination in ihrer Stärke vom erwarteten Effekt der normalen Additivität abweicht, wenn die Kurven der Dosis – Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verläufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander ähnlichen oder unabhängigen Wirkmechanismus verfolgen. Für nicht lineare Dosis – Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverläufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen möglichen Bereich der Additivität zwischen ihnen (auch: „Hülle der Additivität“). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, dürfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese Überlegungen wurden überprüft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus – Lymphom – Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis – Wirkungsbeziehungen. Für die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei binären Mixturen miteinander gemischt. Für MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant höher als der vorkalkulierte Effekt der Netto – Wirkung. Für MMS + GEN lag der gemessene Effekt über der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. Für MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis – Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen wäre ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN fälschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN wäre mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen könnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA – Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearität von Dosis – Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend für die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen über tiefere mechanistische Vorgänge hilfreich für eine Vorhersage von ähnlichen oder unabhängigen Wirkprozessen.
In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as α-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like α-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS).
Der Einsatz der Vitamin B 1 Vorstufe Benfotiamin hat sich im Tiermodell durch Verhinderung oder gar Aufhebung typischer diabetischer Folgeschäden wie Ne- phropathie, Retinopathie und Neuropathie ausgezeichnet. Diese Wirkung wird unter anderem der Aktivitätssteigerung des Enzyms Transketolase zugeschrie- ben, welches auch bei Dialysepatienten ohne diabetische Grunderkrankung sup- primiert ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Auswirkungen einer ora- len Benfotiaminsubstitution auf den Stoffwechsel von Langzeithämodialysepati- enten zu untersuchen. Die 15 rekrutierten Patienten mit und ohne Diabetes mel- litus erhielten über einen Zeitraum von 2 Monaten eine Dosis von 300 mg/d Benfotiamin, die in den folgenden 2 Monaten bis maximal 450 mg/d gesteigert wurde. Um einen Eindruck über den Verlauf der Entzündungssituation und des oxidativen Stresses zu gewinnen, wurden im Patientenvollblut AGEs und pro- inflammatorische Zytokine gemessen. Außerdem wurden peripheren Lympho- zyten mit Hilfe des alkaline Comet-Assay und des Mikrokerntestes auf DNA- Schädigungen analysiert. In beiden Patientengruppen lässt die Senkung der Mi- krokernraten den Schluss zu, dass Benfotiamin DNA-Schäden und somit eventu- ell das Krebsrisiko reduziert. Dieses vielversprechende Ergebnis korreliert jedoch nicht mit dem Resultat des Comet-Assay. Da hier der relative DNA-Schaden ten- dentiell ansteigt, sollte es Ziel weiterer Studien sein, diesen Sachverhalt an ei- nem größeren Patientenkollektiv mit Kontrollgruppen zu überprüfen. Eventuell ist letzteres Testsystem wegen seiner hohen Sensitivität in diesem Fall nicht op- timal geeignet. Außerdem sollte gezielt auf die beobachtete schnellere und stär- kere Mikrokernsenkung der diabetischen Patienten eingegangen werden, da die- se in der vorliegenden Studie zahlenmäßig unterrepräsentiert waren. Positiv zu bewerten ist der leichte CRP-Abfall sowie der Anstieg des Gesamtproteins und Albumin im Serum, was auf eine Reduktion der Mikroinflammation und oder eine verbesserte Ernährungssituation hinweist. Andererseits spricht der Anstieg des Neopterin- und Interleukin 6-Spiegels gegen die Veränderung des Inflamma- tionsstatus. Entgegen der Erwartung ließ sich in dieser Studie keine Reduktion der zirkulierenden AGEs und AOPPs im Serum erzielen. Um eine Reduktion des oxidativen Stresses besser beurteilen zu können, sollten in Folgestudien direkte und leicht veränderliche Marker wie der Glutathionspiegel verwendet werden. Zusammenfassend reduzierte Benfotiamin bei Hämodialysepatienten mit und ohne Diabetes mellitus DNA-Schäden in peripheren Lymphozyten bei unver- änderter Inflammationssituation und steigerte die Plasmaproteinkonzentration. Dies wurde eventuell durch Reduktion von oxidativem Stress und oder Beein- flussung seiner Ursachen wie Reduktion von Urämietoxinen erreicht.Weitere kli- nische Studien sind notwendig, um dieses vielversprechende Medikament in der täglichen Praxis einsetzen zu können. Besonders vorteilhaft ist seine gute Verträg- lichkeit auch in hoher Dosierung. Darüber hinaus soll das Präparat auch neuro- patische Schmerzen reduzieren, die sich bei Dialysepatienten häufig manifestie- ren, und wirkt somit multikausal.
Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.
Herzmuskelschwäche (Herzinsuffizienz) ist in industralisierten Ländern neben malignen Erkrankungen noch immer die zweithäufigste Todesursache. Das Zusammenspiel der zu einer Herzmuskelschwäche führenden, molekularen Signalwege und die zugrunde liegenden Mechanismen sind trotz intensiver Forschung bisher noch weitgehend unverstanden. Ein detailierteres Verständnis der Entstehung einer Herzinsuffizienz könnte somit entscheidend zur Entwicklung innovativer Therapiestrategien beitragen. Mit Hilfe eines cDNA Expressions Arrays wurde die differentielle Genexpression in einem murinen Herzinsuffizienzmodell untersucht. Die Cysteinprotease Caspase-1 ist eines der in diesem Array identifizierten Kandidatengene. Die verstärkte Expression der Caspase-1 konnte zunächst sowohl für die murine als auch die humane Herzinsuffizienz verifiziert werden. Caspasen werden klassischerweise, ihrer Funktion entsprechend, in proinflammatorische und proapoptotische Caspasen unterteilt. In der Literatur ist Caspase-1 als ein über die Generierung von aktivem IL-1? und IL-18 wirkender, proinflammatorischer Mediator beschrieben. IL-? und IL-18 sind proinflammatorische Zytokine und als solche zentrale Mediatoren bei entzündlichen Prozessen. Während die Funktion der proapoptotischen Caspasen bei Herzmuskelschwäche weitgehend bekannt ist, ist unklar, welche Bedeutung der verstärkten kardialen Expression der Caspase-1 bei der Entstehung und Progression der Herzmuskelschwäche zukommt. Zur funktionellen Analyse der verstärkten Expression der Caspase-1 in vivo wurde die Caspase-1 in einem transgenen Mausmodell kardial überexprimiert. Herzen mit verstärkter Expression der Caspase-1 entwickelten ab dem vierten Lebensmonat morphologische und funktionelle Veränderungen, die charakteristisch für eine angehende Herzinsuffizienz sind. Dennoch war, trotz progressiver Kardiomyozytenhypertrophie und Myokardfibrose, zu keinem Zeitpunkt des untersuchten Zeitraumes (ein bis vierzehn Monate alt) eine Zunahme des Ventrikelgewichtes evident. Die funktionelle Analyse der Herzfunktion von neun Monate alten Caspase-1-transgenen Mäusen zeigte eine signifikante Einschränkung der Linksherzkontraktilität. Diese Herzinsuffizienz war schließlich auch makroskopisch an einer starken Linksherzdilatation als auch an einer Reduktion der linksventrikulären Wandstärke erkennbar. Ist die Induktion einer Herzinsuffizienz durch Caspase-1 als proinflammatorischer Mediator im Herzen zu erklären? In einer Reihe von Versuchen konnten keine Hinweise auf eine Induktion inflammatorischer Prozesse durch kardiale Caspase-1 festgestellt werden. Weder eine verstärkte Bildung der proinflammatorischen Zytokine IL-1? und IL-18, noch eine vermehrte Infiltration von Entzündungszellen oder eine verstärkte Proteinexpression weiterer Zytokine waren detektierbar. Ferner waren der oxidative Stresstatus und der nekrotische Gewebeuntergang im linksventrikulären Myokard Caspase-1-transgener Mäuse unverändert. Doch besonders im Herzmuskelgewebe junger Caspase-1-transgener Mäuse zeigte sich eine deutliche, mit fortschreitendem Alter bestehende Zunahme des apoptotischen Zelltods von Herzmuskelzellen. Diese direkte, proapoptotische Wirkung der kardialen Caspase-1 konnte ebenfalls in isolierten Kardiomyozyten von Caspase-1-transgenen Mäusen ex vivo und in vitro, nach adenoviraler Infektion von neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCM) mit Caspase-1, demonstriert werden. Durch Infektion von NRCM mit dem Caspase-1-exprimierenden Adenovirus (Adv-Casp-1) konnte eine selektive Aktivierung des intrinsischen apoptotischen Signaltransduktionsweges durch Caspase-1 nachgewiesen werden. Ist die endogen exprimierte Caspase-1 ein westenlicher Regulator kardialer Apoptose? In dem Kardiomyozytenapoptose-induzierenden Schädigungsmodell der Ischämie/Reperfusion waren die Caspase-1-defizienten Mäuse durch eine Reduktion der Kardiomyozytenapoptose um nahezu 75% gegenüber der Kontrollgruppe deutlich begünstigt. Des Weiteren zeigte die Ausschaltung der endogenen Caspase-1 in dem Herzinsuffizienzmodell des operativen Herzinfarkts eine deutliche Verminderung der reaktiven Kardiomyozytenhypertrophie und eine geringere Einschränkung der Herzkontraktilität. Diese Verbesserung des kardialen Phänotyps spiegelte sich ferner in einer reduzierten Sterblichkeit gegenüber der Kontrollgruppe wieder. Eine Inhibition der Caspase-1 stellt somit ein interessantes therapeutisches Target zur Prävention der Entwicklung einer Herzinsuffizienz dar.
Clonidine is an agonist at alpha2-adrenergic receptors that mediate a wide variety of the physiological responses to epinephrine and norepinephrine, such as inhibition of neurotransmitter release as well as sedation and analgesia. As with other therapeutically used alpha2-agonists such as moxonidine and rilmenidine, clonidine possesses an imidazoline structure and is believed to lower blood pressure not only via central and peripheral alpha2-receptors, but perhaps even more so by acting on central “imidazoline I1 receptors” in the brain stem. The molecular structure of these hypothetical “imidazoline I1 receptors” has not yet been identified. In order to test whether ligands with an imidazoline structure elicit pharmacological effects via alpha2-adrenergic receptors or via “imidazoline receptors”, mice were generated with a targeted deletion of all three alpha2-adrenergic receptor subtypes (alpha2ABC-KO). These alpha2ABC-KO mice were an ideal model in which to examine the pharmacological effects of the centrally acting antihypertensives clonidine, moxonidine and rilmenidine in the absence of alpha2-adrenergic receptors. As expected, sedative and analgesic actions of clonidine were completely absent in alpha2ABC-KO mice, confirming the sole role of alpha2-receptors in these properties of clonidine. Clonidine significantly lowered heart rate in anesthetized alpha2ABC-KO and wild-type mice by up to 150 beats/min. A similar bradycardic effect of clonidine was observed in isolated spontaneously beating right atria from alpha2ABC-KO mice. After treatment with the specific If inhibitor ZD 7288, clonidine was no longer able to lower spontaneous beating frequency, suggesting a common site of action. Furthermore, in HEK293 cells stably transfected with HCN2 and HCN4, it could be shown that clonidine inhibits the If current via blockade of pacemaker channels with similar affinity as in isolated alpha2ABC-KO and wild-type atria. This inhibition was demonstrated again in isolated sinoatrial node (SAN) cells from alpha2ABC-KO mice and was identical in potency and efficacy to clonidine inhibition observed in isolated wild-type SAN cells, confirming that inhibition of atrial HCN channels constitutes the alpha2-independent bradycardic action of clonidine. Direct inhibition of cardiac HCN pacemaker channels contributes to the bradycardic effects of clonidine in gene-targeted mice. Thus clonidine-like drugs represent novel structures for future HCN channel inhibitors.
Die karzinogene Aktivität von Östradiol wurde bereits in mehreren Studien nachgewiesen und scheint das Ergebnis einer Kombination von hormonellen und genotoxischen Mechanismen zu sein. In der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Mechanismus der Induktion chromosomaler Schäden durch Östradiol festgestellt werden. Es kam in der östrogenrezeptorpositiven Zelllinie MCF-7 zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Zellproliferation und Mikrokernsteigerung, als Maß für die chromosomale Schädigung. In der östrogenrezeptornegativen Zelllinie MDA-MB231 konnte weder einer Steigerung der Zellproliferation, noch eine vermehrte Mikrokerninduktion nachgewiesen werden. Die Vermutung ist, dass die Zellen, durch den Proliferationsdruck den Zellteilungszyklus schneller durchlaufen und infolgedessen vermehrt Fehler im Replikationsablauf entstehen können. Zudem können wichtige Reparaturmechanismen oder Zellzykluskontrollpunkte nicht mehr adäquat agieren.
Einfluß der Dialysetherapie auf den Genomschaden von Nierenpatienten in einer prospektiven Studie
(2007)
Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz haben im Vergleich zur Normalbevölkerung eine deutlich erhöhte Inzidenz maligner Erkrankungen. Frühere Untersuchungen zeigten, dass periphere Blutlymphozyten dieser Patienten einen höheren genetischen Schaden aufweisen, wodurch das Risiko einer malignen Entartung steigt. In dieser Arbeit wurde der genetische Schaden mithilfe zweier Testverfahren, Comet Assay und Mikrokerntest, untersucht. Es handelte sich um eine prospektive Studie mit zwei Patientenkollektiven. Die erste Gruppe bestand aus Patienten, die aufgrund einer terminalen Niereninsuffizienz innerhalb der nächsten Monate eine Dialysetherapie mittels konventioneller Hämodialyse beginnen mußten. Die zweite Gruppe bildeten Dialysepatienten, die im Verlauf von konventioneller Dialyse auf Hämodiafiltration umgestellt wurden. Bei allen Patienten wurde der genetische Schaden der peripheren Blutlymphozyten in den Monaten vor und nach Therapiebeginn bzw. Therapieumstellung regelmäßig untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass 4 der 10 Prädialysepatienten nach Beginn der Dialyse einen niedrigeren genetischen Schaden hatten, 2 Patienten hatten unterschiedliche Werte in Comet Assay und Mikrokerntest und bei 2 Patienten ergab sich im Verlauf eine höhere DNA-Schädigung. Die verbliebenen 2 Patienten mußten aufgrund einer konstant bleibenden Niereninsuffizienz nicht mit der Dialysetherapie beginnen. Bei Zusammenfassung aller Einzelwerte zeigte sich, dass das Kollektiv der Prädialysepatienten insgesamt vom Beginn der Behandlung profitiert hat. In der Gruppe der Dialysepatienten hatte 2 von 7 Patienten nach Umstellung auf Hämodiafiltration eine geringere DNA-Schädigung, 2 Patienten zeigten unterschiedliche Ergebnisse im Comet Assay und Mikrokerntest und 2 weitere Patienten wiesen eine höheren genetischen Schaden in den Lymphozyten auf. Ein Patient konnte bei fehlenden Vorwerten nicht berücksichtigt werden. Im Gruppenvergleich zeigte sich für alle Dialysepatienten ein gleichbleibender DNA-Schaden, gemessen mithilfe des Comet Assays bei leicht erhöhten Mikrokernraten. Jedoch hatte sich die Zellproliferation ebenfalls etwas verbessert. Zusammenfassend ergibt sich somit in beiden Gruppen kein eindeutiges Ergebnis, woraus neue Therapieempfehlungen für Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz abzuleiten wären. Um weiter Einflußvariablen auf die Höhe des genetischen Schadens festzustellen, sind weiter Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven erforderlich.
Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices.
Phosducin-like protein (PhLP) gehört zur Phosducinfamilie der G-Protein-betagamma-Regulatoren und kommt in zwei Spleißvarianten vor. Die lange Isoform PhLPlong und die kurze Isoform PhLPshort unterscheiden sich allein durch das Vorhandensein des 81 Aminosäuren langen N-Terminus von PhLPlong. In Versuchen mit gereinigten Proteinen erwies sich PhLPlong als der stärkere Gbetagamma-Inhibitor, während die Bedeutung von PhLPshort nicht bekannt war. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß in transfizierten HEK 293-Zellen PhLPshort die Gbetagamma-vermittelte Signalbildung 20mal stärker hemmt als PhLPlong. Da der zusätzliche N-Terminus von PhLPlong mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die konstitutiv aktive Caseinkinase 2 besitzt, wurde angenommen, daß die lange Spleißvariante in Zellen einer solchen Regulation unterliegt, was sich auf seine Funktion als Gbetagamma-Inhibitor auswirkt. Durch schrittweise Trunkierungen bzw. Serin-/Threonin-Alaninmutationen wurden die potentiellen Phosphorylierungsstellen entfernt, was zur Verbesserung der Gbetagamma-Hemmfähigkeit führte. Der N-terminale Aminosäurenabschnitt Ser-18/Thr-19/Ser-20 wurde dabei als die verantwortliche Stelle identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, daß PhLPlong in HEK 293-Zellen im Gegensatz zu PhLPshort einer konstitutiven Phosphorylierung unterliegt und durch die Caseinkinase2 katalysiert wird. In dieser Arbeit werden die Phosphorylierung von PhLPlong durch die Caseinkinase2 anhand von rekombinanten Proteinen sowie ihre Kinetik dargestellt. Das Vorhandensein von mRNA der Caseinkinase2 in HEK 293-Zellen zeigt, daß sie in der Zelle exprimiert und somit aktiv ist, was ihre physiologische Bedeutung herausstellt. Eine direkte Gbetagamma-Bindung konnte durch Immunpräzipitation nur für PhLPlong nachgewiesen werden, weswegen für PhLPshort ein alternativer Mechanismus der Gbetagamma-Hemmung angenommen wurde, was in folgenden Arbeiten näher untersucht wurde.
Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO"
(2006)
Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumgänglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellulären Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molekül SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verstärke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zurückzuführen war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Darüberhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, über den die Verfügbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird.
Eine durch Aktivierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors induzierte Konfirmationsänderung resultiert in einer Signaltransduktion durch das G-Protein zu einem Effektorenzym wie der Adenylylcyclase. In dieser Arbeit konnten Aminosäuren in dem zur G-Protein gekoppelten Rezeptorfamilie zugehörigen beta1-adrenergen Rezeptor identifiziert werden, welche für dessen Aktivierung von Bedeutung sind. Der Analyse von beta1-adrenergen Rezeptormutanten lag die Erkenntnis zu Grunde, dass therapeutisch genutzte Liganden wie Terbutalin, oder das experimentell eingesetzte Broxaterol Agonisten am beta2- und beta3-adrenergen Rezeptor, jedoch Antagonisten am beta1-adrenergen Rezeptor sind. Dieses Verhalten wurde zum Anlass genommen spezifische Aminosäuren zu identifizieren, welche eine bedeutende Funktion in der Aktivierung von beta -Rezeptorsubtypen haben könnten. Nach einem Aminosäurevergleich innerhalb der Familie der beta-adrenergen Rezeptoren konnten Aminosäurepositionen identifiziert werden, die identisch im beta2- bzw. beta3-Rezeptor sind und sich von denen des beta1- Rezeptors unterscheiden und damit das Aktivierungsprofil von Broxaterol und Terbutalin widerspiegeln. Mit zielgerichteten Punktmutationen wurden nun insbesondere im Bereich der Transmembranregionen solche Aminosäuren im beta1-adrenergen Rezeptor durch die entsprechende des beta2- (beta3-) Rezeptors ersetzt. Obwohl keine der getesteten Mutanten Unterschiede im pharmakologischen Bindungsprofil zeigten, konnten vier Mutanten gefunden werden, welche partiell oder vollständig durch Broxaterol oder Terbutalin aktiviert wurden. Die beiden Mutanten I185L sowie D212N konnten mit Broxaterol und Terbutalin aktiviert werden, zwei Liganden, die Antagonisten am beta1- Wildtyprezeptor sind. Außerdem konnten zwei weitere Mutanten, V120L und K253R, durch Terbutalin aktiviert werden. Betrachtet man die Struktur von Terbutalin, so ist dieser Ligand den endogenen Katecholaminen ähnlicher als Broxaterol. Ein Rezeptormodell zeigt, dass die vier relevanten Aminosäuren außerhalb der Ligandenbindungsregion liegen und somit eine direkte Interaktion mit dem Liganden unwahrscheinlich erscheint. Diese These wird durch das im Vergleich zum Wildtyp nicht veränderte Bindungsprofil der beta1-Rezeptormutanten unterstützt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aminosäuren V120, I185, D212 und K253 in der ligandeninduzierten Konfirmationsänderung des beta1-Rezeptors von Bedeutung sind.
In der vorliegenden Arbeit wurden die kardial differenzierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mittels der von Wobus et al. entwickelten Tröpfchentechnik gewonnen. Eine Optimierung der kardialen Ausbeute konnte durch eine Selektionsmethode erreicht werden, die auf der Expression eines Resistenzgens in den kardial differenzierten ES-Zellen beruht. Hierdurch wurde eine reproduzierbar hohe Anreicherung von ES-Kardiomyozyten erzielt. Die erstmalig durchgeführte quantitative Bestimmung der endogenen β-adrenergen Rezeptorexpression in ES-Kardiomyozyten zeigte eine Subtyp-Verteilung, die mit derjenigen in adulten Maus-Kardiomyozyten übereinstimmt, wobei eine höhere endogene Expression in ES-Kardiomyozyten vorlag. Ferner konnte durch eine β-adrenerge Stimulation in 16 Tage alten ES-Kardiomyozyten eine positive chronotrope Reaktion sowie eine Aktivierung der Adenylatzyklase-Aktivität hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass ES-Kardiomyozyten am 16. Differenzierungstag einen vollständig ausgereiften β-adrenergen Signalweg aufweisen und hinsichtlich der physiologischen Effekte vergleichbare Merkmale mit adulten Maus-Kardiomyoyzten haben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit eines adenoviralen Gentransfers in ES-Kardiomoyzten zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass der Gentransfer mittels rekombinanten Adenoviren eine sehr effiziente und durchführbare Methode zur Expression von Transgenen in ES-Kardiomyozyten ist. Weiterhin konnte die funktionelle Kopplung der adenoviral überexprimierten β1-adrenergen Rezeptoren nachgewiesen werden. Die Überexpression hatte eine ausgeprägte Sensitivierung der Rezeptorantwort zur Folge, während die maximale Isoprenalin-induzierte cAMP-Produktion nur wenig erhöht wurde. Dies entspricht Befunden an transgenen Mausmodellen mit einer β1-adrenergen Rezeptor-überexpression. Eine Sensitivierung des chronotropen Effektes konnte dagegen nicht gezeigt werden. Möglicherweise führte die Transfektion der ES-Kardiomyozyten-Zellverbände nur zu einem oberflächlich begrenzten Gentransfer, der keinen Einfluss auf die Gesamtheit des funktionellen Synzytiums hatte. Außerdem wurde in dieser Arbeit der Einfluss einer unterschiedlichen Phosducin-Expression auf die kardiale Differenzierungsfähigkeit in transgenen ES-Zellen untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied in der kardialen Differenzierung sowie in der Basalfrequenz von homozygoten und heterozygoten Phosducin Knock-out Klonen beziehungsweise von Phosducin überexprimierenden Zellklonen festgestellt werden.
The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 μm/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of β1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications.
Seit langem werden auf das β-adrenerge System wirkende Pharmaka, v.a. β1-Antagonisten und β2-Agonisten, therapeutisch eingesetzt, allerdings sind die pharmakologischen Eigenschaften dieser Stoffe an den drei bekannten β-adrenergen Subtypen teilweise nur unzureichend untersucht. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, vergleichbare pharmakologische Daten für Agonisten (Adrenalin, Noradrenalin, Isoprenalin, Fenoterol, Salbutamol, Salmeterol, Terbutalin, Formoterol, Broxaterol) und Neutrale und Inverse Antagonisten (Propranolol, Alprenolol, Atenolol, Metoprolol, Bisoprolol, Carvedilol, Pindolol, BRL 37344, CGP 20712, SR 59230A, CGP 12177, ICI 118551) an allen drei Subtypen von adrenergen Rezeptoren in einem zellbiologisch identischen Hintergrund zu gewinnen. Dazu stellten wir stabil transfizierte CHO-Zelllinien her, die die einzelnen humanen β-adrenergen Subtypen in vergleichbarer Menge exprimierten. Nach der pharmakologischen Charakterisierung der einzelnen Rezeptorsubtypen erfolgte die Affinitätsmessung von klinisch häufig eingesetzten wie auch experimentell verwendeten Substanzen mit dem unselektiven β-adrenergen Antagonisten 125I-CYP als Radioligand. Darüber hinaus untersuchten wir die β-adrenerg vermittelte Stimulation der Adenylylcyclase in isolierten Membranen dieser Zelllinien. Alle untersuchten Substanzen zeigten charakteristische Bindungs- und funktionale Eigenschaften. Wir konnten nachweisen, dass einige β2- bzw. β3-Agonisten an den anderen Subtypen inversen Agonismus zeigen. Zusätzlich konnten β1-Antagonisten mit agonistischer Aktivität an β2- und β3-AR gefunden werden. Die gewonnenen Daten können somit helfen, klinisch beobachtete Effekte, wie z.B. die unerwünschten Wirkungen der entsprechenden Medikamente, besser zu verstehen. Insbesondere die Ergebnisse am β3-AR sind als Referenz und Ausgangspunkt weiterer Studien an diesem noch relativ wenig untersuchten Rezeptor wertvoll.
Hormone spielen bei der Kanzerogenese eine wichtige Rolle, indem sie vor allem auf die Phase der Promotion einwirken und die Proliferation bereits initiierter Zellen steigern können. In dieser Arbeit wurden humane Ovarialkarzinomzellen mit Östrogen, Insulin, IGF und EGF zur Proliferation angeregt, woraus eine erhöhte Mikrokernrate resultierte. Mikrokerne sind chromatinhaltige Strukturen, die außerhalb des Zellkerns liegen. Somit lag nahe, dass durch die Steigerung der Proliferation eine genetische Instabiltät erzeugt wurde. Weitere Experimente zeigten eine Forcierung der genetisch geschädigten Zellen durch den Zellzyklus, so dass vermutet werden kann, dass schnell proliferierende Zellen durch Verringerung der zellulären Reparaturmechanismen eine erhöhte Rate an genetischer Instabilität aufweisen. Unterstützt wird diese Hypothese durch Analyse diverser Zellzyklusregulationsproteine mittel Wester-Blot.
Azoles are important chemicals used as antifungal agents in agriculture and human medicine, but also as cytostatic drugs in tumour chemotherapy. Antifungal activities are based on inhibition of lanosterol-14α-demethylase (CYP51). CYP51 catalyses the oxidative removal of the methyl group # 32 of lanosterol to produce follicular fluid meiosis activating steroid (FF-MAS). For fungi the later resulting ergosterol is an essential compound of the cell membrane. Exposed fungi lack ergosterol, which leads to a collapse of the cell membrane. In mammals cholesterol, the downstream product of lanosterol-14α-demethylation necessary for the synthesis of bile acids, mineral corticoids, glucocorticoids and sex steroids, can be supplemented with food intake. However FF-MAS and the resulting T-MAS (testis meiosis activating steroids), the direct products of the CYP51 reaction, act as meiosis-activating steroids on ovaries and testes and are not supplemented with food intake. Inhibition of CYP51 in humans may therefore affect the endocrine system and is an unwanted side effect of azoles. Aromatase (CYP19) catalyses the demethylation of testosterone to estradiol and is inhibited by azoles. Reduction of estrogen levels by CYP19 inhibition is the working principle of cytostatic drugs used in breast cancer therapy but is considered an unwanted side effect for azoles used to treat fungal infections. A favourable fungicide or antifungal drug should be a strong inhibitor of fungal CYP51. In contrast human CYP51 and human CYP19 should not be inhibited by an azole fungicide or antifungal agent. The favourable cytostatic drug should show a high potency towards human CYP19. Neither human CYP51 nor fungal CYP51 should be inhibited by a cytostatic drug. The aim of this work was to assess: are fungicides and antifungal drugs strong inhibitors of fungal CYP51? In return do they not inhibit human CYP51 and human CYP19? Do cytostatic drugs strongly inhibit human CYP19? And in return do they not inhibit human CYP51 or fungal CYP51? Inhibitory potencies of 22 azole compounds used for the three purposes were tested in four inhibition assays: i) on commercially available human CYP19 utilising a fluorescent pseudo substrate dibenzylfluorescein (DBF) ii) on CYP19 utilising testosterone as substrate iii) on human CYP51 and iv) Candida albicans CYP51 utilising lanosterol as substrate. Product formation was measured by liquid chromatography – tandem mass spectrometry utilising photospray ionisation (APPI). A functional human CYP51 was available from BD Gentest Cooperation. A functional enzyme complex comprising of the Candida albicans lanosterol-14α-demethylase and the Candida tropicalis oxidoreductase was expressed in the baculovirus system. When comparing inhibitory potencies on CYP19, human CYP51 and Candida albicans CYP51 a number of agents show desirable patterns of inhibition e.g. the two cytostatic drugs, or two antifungal agents used in human medicine, fluconazole and itraconazole, and a wide variety of the fungicides, e.g. cyproconazole and hexaconazole. Undesirable patterns of inhibition were exhibited by a number of compounds, e.g. prochloraz, bifonazole, ketoconazole and miconazole. Seven compounds show a more complex picture of inhibitory potencies though. To get a picture of residue levels of azoles in food in a model case an LC-ESI-MS/MS method was developed for the determination of azole compounds in wine. All residues were below the maximum residue levels set by authorities. To classify the inhibitory potencies on the different enzyme systems IC50 values obtained were compared to exposure levels measured in farmers, maximum plasma concentrations in humans reported after exposure to antifungal drugs and to acceptable daily intake levels set by authorities. Based on the findings presented, the following conclusions can be drawn. The risk for agricultural workers set by exposure to azole fungicides with respect to human CYP51 and CYP19 can be regarded as negligible when safety measures are adhered to. As a matter of principle however, the usage of bifonazole, miconazole and ketoconazole has to be viewed with caution in respect to the high level of inhibition of human CYP51 and/or CYP19. Under the assumption that the acceptable daily intake amounts set by authorities for azole compounds are not exceeded the residues do not pose a threat to consumer safety judged by our findings. Inhibition of CYP19 with the consequence of a reduction of estradiol levels has to be regarded as a possible disrupting effect of the hormone balance. The relevance of FF-MAS and T-MAS in the endocrine system however still has to be evaluated completely bringing with it the question of how much importance has to be attached to the inhibition of human CYP51.
The biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane was investigated in rats and in in vitro systems. First, the metabolites were identified in vivo using GC/MS and 19F NMR analysis. The main metabolite was identified as trifluoroacetic acid, the minor metabolite as 3,3,3-trifluoropropionic acid and as a cleavage product, inorganic fluoride was found. As the in vitro system, liver microsomes from rat and human samples and rat liver homogenates were used. Trifluoroacetic acid and 3,3,3 trifluoropropionic acid were confirmed in vitro as metabolic intermediates, following biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane by the cytochrome P-450-system. Studies, designed for clarifying the cardiotoxicity of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane were driven by the hypothesis that 3,3,3-trifluoropropionic acid is the toxic agent. This was based on the lethal toxicity, which was observed in previous in vivo experiments. In addition, the point of its structural similarity to toxic agents as for example monofluoroacetic acid or of possible metabolic intermediates like difluoroacrylic acid with known toxicity were considered to support this assumption. However, trifluoroacetic acid was neglected as the sought-after toxic agent because of its different toxic effects, known from literature. Investigations on the biotransformation of 3,3,3-trifluoropropionic acid were performed and resulted in no metabolic activity and in poor elimination of 3,3,3-trifluoropropionic acid in vivo. The histopathological effects on the heart, which were observed in the 90-day oral toxicity study of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane in rats, namely mononuclear inflammatory cell infiltrations and degenerated myocardial fibers, were not observed after a 28 day repeated exposure of up to 10 mg/kg b.w. of 3,3,3-trifluoropropionic acid. However, a single high dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid lead to severe toxicological effects. The difference in the observed toxic effects after a single and repeated administration may be due to adaptive mechanisms in rats. The toxicological effects included clinical signs like ataxia, coma and cramps. The conditions of the rats suggested possible inhibition of the energy supply to the organism. Furthermore, the interference of 3,3,3-trifluoropropionic acid in the functionality of the organism was investigated. Experiments were performed in vitro in rat liver and heart mitochondria to investigate effects on the mitochondrial ß-oxidation. However, the transformation of the substrate [U14C] palmitic acid in the ß oxidation pathway was not inhibited by 3,3,3-trifluoropropionic acid. In addition, no cytotoxicity of 3,3,3 trifluoropropionic acid was observed in the cell culture systems. The main effect after a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid was seen in clinical pathology and metabonomic analysis. The decrease in blood glucose is considered to have the most far-reaching consequences for the toxicity of 3,3,3-trifluoropropionic acid. If considering this change as the primary effect after a single dose, secondary effects, for example, the above-mentioned clinical signs could be explained. In addition, the observed high level of ketone bodies might have been responsible for life-threatening possible ketoacidosis. In general, ketoacidosis occurs after an imbalance between glycolysis, lipolysis, TCA cycle activity and respiratory function. Based on the results, ß-oxidation of fatty acids was not affected, and due to the decrease in glucose levels and the high levels of acetyl CoA, glycolysis was considered not to be impaired. Increased amounts of acetyl CoA might be a result of insufficient activity of the TCA cycle. However, the inhibition of the TCA cycle can be based on the impairment of specific enzymes and/or on the involvement of messenger substrates like insulin. Supporting the first mentioned aspect are decreased levels of TCA cycle intermediates, like α-ketoglutarate or citrate, as seen in 1H-NMR spectra of urine. However, the second aspect would explain the drop in blood glucose with the impairment of glucose transporters or the impairment of the insulin balance. If a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid had stimulated the insulin release, glycolysis would be activated, and high amounts of acetyl CoA would be produced. In case of impaired use by the TCA cycle, levels of ketone bodies would be increased. Experiments were designed to characterize the direct effect of 3,3,3-trifluoropropionic acid on rat insulinoma-derived INS-1 cells as possible increase in insulin release. Further investigations are necessary to answer in which step of the metabolic pathway 3,3,3-trifluoropropionic acid interferes or finally which specific enzyme is inhibited or activated by 3,3,3-trifluoropropionic acid, leading to the drop in blood glucose and finally in lethal toxicity.
Hintergrund: Passivrauchen ist nicht nur als kanzerogen für den Menschen eingestuft, sondern verursacht auch verschiedene andere Erkrankungen. Oft wird dabei der Passivrauchbelastung von Kindern im häuslichen Bereich zu wenig Beachtung geschenkt. In dieser Arbeit wurde deswegen der Zusammenhang zwischen Passivrauchen auf der einen Seite und atopischen Erkrankungen, Erkrankungen der oberen Atemwege und Gentoxizität auf der anderen Seite untersucht. Methoden: Die Daten von über 100 Kindern zwischen 1 und 15 Jahren wurden mit Hilfe eines Fragebogens erhoben und zusammen mit den Krankenakten ausgewertet. Zur Prüfung der Gentoxizität wurden Mikrokernraten und Schwesterchromatidenaustausche in peripheren Lymphozyten bestimmt. Der Erfassung der inneren Exposition dienten Hämoglobinaddukte von 4-Aminobiphenyl, welches in Zigarettenrauch vorkommt und als krebserzeugend für den Menschen eingestuft ist. Ergebnisse: Bei Untersuchung der Mikrokernraten zeigten die rauchbelasteten Kinder höhere Mikrokernraten (Mittelwert: 12,7/1000 zweikernige Lymphozyten) als die unbelasteten (Mittelwert: 11,7 Mikrokerne/1000 zweikernige Lymphozyten). Der Unterschied war aber nicht signifikant (p = 0,344). Außerdem hatten die Vorschulkinder mit rauchenden Eltern signifikant höhere Mikrokernraten (Mittelwert: 14,2/1000 zweikernige Lymphozyten) als die Schulkinder (Mittelwert: 9,2/1000 zweikernige Lymphozyten; p = 0,031). Die Analyse der 4-Aminobiphenyl-Hämoglobinaddukte der 1,25- bis 4,0-Jährigen ergab leicht höhere Werte für Kinder mit rauchenden Eltern (Mittelwert: 66,52 pg/g Hb) als für Kinder, deren Eltern nicht zu Hause rauchten, und deren Werte (Mittelwert: 56,18 pg/g Hb) waren höher als die der unbelasteten Kinder (Mittelwert: 49,60 pg/g Hb). Der Unterschied war nicht signifikant. Bei Betrachtung der atopischen Erkrankungen war der Anteil der Atopiker bei der rauchexponierten Gruppe höher (31,3 %) als bei der nicht exponierten (16,3 %), obwohl die genetische Vorbelastung in der rauchbelasteten Gruppe etwas geringer war als in der unbelasteten. Bei den Kindern mit Erkrankungen der oberen Atemwege zeigte sich ein höherer Anteil rauchexponierter Kinder (61,3 %) als in der Gruppe der Kinder mit Erkrankungen, die wahrscheinlich nicht mit postnataler Passivrauchexposition in Zusammenhang stehen (44,8 %). Schlussfolgerung: Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung von Passivrauchen im Hinblick auf atopische Erkrankungen und Erkrankungen der oberen Atemwege bei Kindern. Gerade die häusliche Passivrauch-Belastung im Vorschulalter und ihre Auswirkung auf das Erbgut sollten hinsichtlich der erhöhten Mikrokernraten mehr Beachtung finden.
Ein Problem der Therapie maligner Tumore ist die Resistez gegenüber Chemotherapeutika. Diskutiert wird ein Zusammenhang zur Expression von Hitzeschockproteinen (HSP). Insbesondere das in Mamma-Karzinomen stark exprimierte HSP27 und HSP70 scheinen hier beteiligt. Hitzeschockproteine sind Teil eines durch Noxen induzierten Mechanismus, welcher Schutz vor weiterer Noxenexposition verleiht, also die entsprechenen Zellen im Unterschied zu nicht exponierten Kontrollzellen zu überleben befähigt. Es kommt nach einem Streßereignis zu einer Veränderung von Zelltod unter nachfolgenden Bedingungen, z.B. Verhütung von Apoptose (physiologischer Zelltod). Tumortherapie mittels Zytostatika stellt eine „kontrollierte Apoptose“ dar. Ziel dieser Therapie muß es also folglich sein, eine HSP-Induktion zu vermeiden, da eine solche den Therapieerfolg und Benefit für den Patienten schmälert. Die Exposition einer Tumorzelle mit einem chemotherapeutisch wirksamen Medikament bedeutet für diese Zelle toxischen/oxidativen Streß, den sie nur durch Induktion entsprechender Abwehrmechanismen überleben kann. Diese Mechanismen haben letztlich einen wesentlichen Einfluß auf die Wirksamkeit des Medikamentes und Profit des Patienten durch die ihm angebotene Therapie. Eine frühe adaptive Zellantwort von Säugerzellen auf toxische Einflüsse stellt die Expression von Hitzeschockproteinen dar. Den Fokus der vorliegenden Untersuchungen stellen einerseits diejenigen Substanzen dar, welche heutzutage in der Therapie des Mamma-Karzinoms eingesetzt werden, den drei Einzelsubstanzen des CMF-Protokolls Methotrexat, 5-Fluorouracil und Cyclophosphamid, andererseits die Hitzeschockproteine mit der höchsten bekannten Bedeutung für Tumorwachstum. In einem ersten Schritt wurde in vitro mit einem Zellsystem, welches durch Transfektion mit dem humanen hsp27-Gen bei bekannter HSP70-Induzierbarkeit als einfaches isoliertes Zellsystem ein gutes Werkzeug zur spezifischen Untersuchung dieser beiden Proteine darstellt, untersucht werden, inwieweit sich diese speziellen Proteine durch die unterschiedlichen Substanzgruppen des CMF-Protokolls induzieren lassen. Es wurde also nach einer adaptiven Zellantwort in Form einer Induktion von HSP27 und HSP70 nachfolgend einer Noxenexposition gesucht werden. In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob die für diese beiden HSPs postulierte zytoprotektive Eigenschaften auch für Zytostatika gelten. Es wurde überprüft , inwieweit Chemotherapeutika unter dem Einfluß von HSP70 und HSP27 stehen, also inwieweit die Expression von HSP27 und HSP70 einen Zellschutz gegen toxischen Streß (durch CMF) in den verwendeten L929-Mausfibroblasten darstellen kann.
Phytohormone, insbesondere solche mit östrogenem Potential werden heute vermehrt in der postklimakterischen Hormonersatztherapie als natürliche Alternative zu Designeröstrogenen eingesetzt, da sie vermutlich ein besseres Wirkungs-Nebenwirkungsprofil besitzten. Mengenmäßig am bedeutensten sind die Phytoöstrogene aus den Stoffgruppen der Isoflavone, Cumestane und Indol-3-carbinole. Weit über 100 Pflanzen produzieren Phytohormone. Die bekanntesten sind die Sojabohne, Weintrauben, Leinsamen, Haferflocken, Spargel, Traubensilberkerze und roter Klee. Phytohormone können täglich in großer Menge aufgenommen werden (1mg pro kg Körpergewicht), wobei durchaus Plasmaspiegel von über 1µM erreicht werden. Gerade deshalb darf nicht davon ausgegangen werden, daß natürliche Produkte per se gut für die Gesundheit wären. Phytohormone und insbesondere deren Metaboliten, die während der intestinalen Passage entstehen, wurden vielfach nicht den gleichen Prüfbedingungen unterzogen wie sie für andere in Lebensmitteln vorkommenden Substanzen, wie z.B. Konservierungs-, Farb- oder Aromastoffen, heute selbstverständlich ist. Diese Arbeit soll deshalb anhand von in-vitro Tests an Mauslymphomzellen L5178Y für eine Auswahl an Phytohormonen und deren Metaboliten mögliche toxische oder gentoxische Effekte detektieren und die bestehende Datenlage ergänzen. Aus der Gruppe der Isoflavone wurden die Daidzeinmetaboloiten Equol und O-desmethylangolensin und die Glyceteinmetaboliten 3,4,7- und 4,6,7-Trihyroxyisoflavon untersucht. Aus der Gruppe der Flavone wurde Fisetin und aus der Gruppe der Stilbene Resveratrol untersucht. Weiterhin wurden Daten zu den Anthocyanen Delphinidin-, Pelargonidin- und Cyanidin-Chlorid erhoben. Toxische Effekte wurden anhand von Proliferatiosexperimenten, durch die Bestimmung der Zellvitalität (Ethidiumbromid-Flouresceinmethode) und durch die Analyse der Teilungsaktivität nach Behandlung mit Cytocalasin B und anschließender Bestimmung des Anteils mehrkerniger Zellen detektiert. Zur Bestimmung von gentoxischen Effekte wurde auf den Mikrokerntest zurückgegriffen. Ergänzend sollte eine Immunfloureszenzfärbung der Kinetochorproteine in Mikrokernen Aufschluß über aneugene oder klastogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen geben. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten weisen darauf hin, daß erste adverse Effekte der Phytohormone oder deren Metaboliten im Bereich der erreichbaren Plasmakonzentration liegen, so daß eine übertriebene Aufnahme hochdosierter Phytohormonen derzeit als kritisch erachtet und weiterer Forschungsbedarf festgestellt werden muß.
Mechanisms of apoptosis modulation and their contribution to genomic instability in tumor cells
(2004)
The concept of programmed cell death has been increasingly considered from various aspects since early 1970’s. Primarily, knowledge of apoptosis referred to morphological changes in which chromatin is condensed and increasingly fragmented, revealed as small structure in the nucleus. The membrane shrinks and the cell becomes dense as can be seen by flow cytometry. Interestingly, similar modes of cell deletion were observed in nematodes indicating that apoptosis is a highly conserved machinery. Three Caeonorhabditis elegans gene products are found to have high homology with mammalian apoptotic genes: CED-9 inhibits apoptosis and is related to bcl-2; CED-3 and CED-4 promote apoptosis and are related to caspase 9 and APAF-1. Apoptosis is not accidental death, but a highly controlled and medically important molecular process. More general terms such as ‘physiological’ or ‘regulated’ cell death cover different morphologies and sequences. Programmed suicide of cells that were subjected to toxic exogenous and endogenous stimuli plays a key role in understanding cancer development and its treatment. Apoptosis involves sequences of events that may overlap and play contradictory or antagonistic roles in cell death. Generally, the ability to trigger apoptotic processes in cancer cells would benefit an organism by keeping homeostasis intact. Programmed cell death is a regularly present mechanism, for instance, in lymphocyte recruitment in the thymus where immature lymphocytes may recognize host antigens. Therefore, such lymphocytes become apoptotic and are removed by macrophages. Removal prevents possible autoimmune diseases. Unlike apoptosis, necrosis is a passive process of cell death recognizable by membrane morphological changes and accompanied by leakage of intracellular material into intercellular space that may cause inflammation in the organism. Signals that may initiate apoptosis are generally classified into two groups: signals that launch extrinsic apoptotic pathways starting with aggregation of death receptors and intrinsic apoptotic pathways starting with disruption of intracellular homeostasis such as the release of mitochondrial factors or DNA degradation. Early in the process, apoptotic signals may lead to a broad range of signaling mechanisms such as DNA repair and assessment of DNA damage (check points). Thus, failure in any of these steps can cause a defective apoptotic response that plays a decisive role in both tumorigenesis and drug resistance in tumor treatment. More distinctly, the capability of cancer cells to go into apoptosis prevents further neoplastic changes. Generally, the purpose of this study is to investigate the balance between formation of genomic damage and induction of apoptosis under genotoxic stress. After genotoxic insult there are different possibilities for the fate of a cell (Figure 1). The genomic integrity is analyzed at cellular checkpoints, usually leading to a delay in cell cycle progression if DNA was damaged. Mutations in genes such as p53 and p21 change the cellular response to genotoxic stress and may alter the balance between apoptosis and genomic damage. However, p53 is usually mutated or not expressed in 70% of human tumors. Alterations in p53 states that reflect distinct apoptotic response upon induction of DNA damage were examined. In this study, three cell lines with distinct p53 states were used: TK6 harboring wild-type p53, WTK1 with mutated p53 and NH32 with knocked out p53. In the present work we applied different approaches to investigate the correlation between DNA damage and apoptotic responsiveness in cancer cell lines with different p53 states or in hormone responsive cell lines with over expressed bcl-2 gene. We were focused on effects caused by temporary down regulation of the p53 and Bcl-2 activity in human lymphoblastoid cell lines. In addition, we investigated the impact of estradiol-induced proliferation on apoptosis and DNA damage in stably transfected cells with bcl-2gene.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich im Gegensatz zu bisherigen Studien (überwiegend im Rahmen von Querschnittsstudien) v.a. prospektiv mit der Untersuchung der Auswirkung verschiedener Faktoren (1. Prädialysephase, 2. Wechsel von der Hämodialyse zu HDF-Behandlung, 3. Einfluß einer Angiotensin IIAntagonistentherapie sowie (durch einmalige Erhebung) „Langzeit“-HDF-Behandlung)auf den relativen genetischen Schaden, ermittelt durch den Comet-Assay und den Mikrokern-Test in peripheren Lymphozyten bei Dialysepatienten bzw. Prädialysepatienten.
Ergebnisse vieler epidemiologischer Studien über die Risikoabschätzungen von Tumoren hormonabhängiger Gewebe legen einen deutlichen Zusammenhang zwischen den Hormonen und dem Auftreten dieser Tumoren nahe. Dabei wird der zellproliferationssteigernde Effekt der Hormone im Rahmen des Mehrstufenkonzeptes der Kanzerogenese meist als Promotionsfaktor beschrieben. In der vorliegenden Arbeit soll gezeigt werden, dass die hormonelle Induktion einer erhöhten Zellteilungsrate auch primär zu einer genetischen Instabilität beiträgt, mit dem Ziel einen weiteren Mechanismus in der Pathogenese hormonabhängiger Tumoren aufzuklären. Die östrogenrezeptorpositive Ovarialtumorzellinie BG-1 und die rezeptornegativen UCI-107 Zellen wurden mit 17-ß Östradiol behandelt und anschließend mit Hilfe des Mikrokerntests auf chromosomale Schäden untersucht. Die Bestimmung der Mikrokernrate bei den östrogensensitiven BG-1 Zellen zeigte, dass mit steigender Proliferationsinduktion auch die Mikrokernfrequenz konzentrationsabhängig erhöht war. Bei der Behandlung der BG-1 Zellen mit 17-ß Östradiol in Kombination mit dem spezifischen Östrogenrezeptorantagonisten 4- Hydroxytamoxifen wurde die östradiolinduzierte rezeptorabhängige Proliferationsstimulation durch Hydroxytamoxifen gehemmt. Parallel dazu sank auch die Mikrokernrate. Bei vergleichbaren Versuchen mit der östrogeninsensitiven UCI-107 Zellinie, bei der keine Effekte auf die Proliferation bei Behandlung der Zellen mit 17-ß Östradiol alleine sowie in Kombination mit 4- Hydroxytamoxifen detektiert werden konnte, wurde auch keine Mikrokerninduktion beobachtet. Eine erhöhte Mikrokernfrequenz konnte wiederum ausschließlich in den östradiolstimulierten BG-1 Zellen festgestellt werden, als durch den Einsatz des Zytokineseinhibitors Cytochalasin B die Auswertung der Mikrokerne auf jene Zellen normiert wurde, die genau eine Zellteilung durchgeführt hatten. Die Ergebnisse machten deutlich, dass die östradiolstimulierten Zellen auf Grund der beschleunigten Proliferation eine „andere Art von Zellteilung“ durchführen. In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde der Einfluss der Östradiolstimulierung auf den Zellzyklus untersucht. Mittels eines FACScans konnten die prozentualen Zellzyklusphasenanteile (G1/ G0-, S- und G2/ M- Phase) der BG-1 Zellen zu verschiedenen Zeiten des Wachstums bestimmt werden. Zum Beispiel war der Anteil an Zellen der östradiolstimulierten Zellpopulation in der G2/ M Phase durchgehend um 6-8 % geringer gegenüber dem Anteil an Zellen, die mit Lösungsmittel behandelt wurden. Möglicherweise ist dies ein Erklärungsansatz für das vermehrte Auftreten von Mikrokernen bei Östradiolstimulierung, da bekannt ist, dass es in der G2/ M-Phase einen wichtigen Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus zur Detektion und Reparatur chromosomaler Schäden gibt. Bei Berechnung der Zellzyklusphasenzeiten ergab sich ebenso in der G2/M Phase eine deutlich verkürzte Verweildauer der östradiol-behandelten BG-1 Zellen. Zusammengefaßt leitet sich die Hypothese ab: „Die Zellen werden auf Grund der hormonellen Proliferationsstimulierung durch den Zellzyklus „gejagt“, demzufolge werden wichtige „Checkpoints“ im Zellzyklus überlaufen, wodurch eine genetische Instabilität entstehen.kann“.
Die Gruppe der adrenergen Rezeptoren (AR) umfasst neun Rezeptoren (3 alpha1-, 3 alpha2-, 3 beta-AR), die alle durch die physiologischen Liganden Adrenalin und Noradrenalin aktiviert werden können. Eine Subgruppe der AR bilden die drei alpha2-AR alpha2A, alpha2B und alpha2C. Sie können prä- oder postsynaptisch lokalisiert sein. Präsynaptisch lokalisierte alpha2-AR hemmen die Transmitterfreisetzung im Sinne einer negativen Rückkopplung. Die Hauptrolle bei der präsynaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung spielen alpha2-AR vom Subtyp alpha2A. Es lagen zu Beginn dieser Arbeit auch Hinweise vor, daß noch weitere alpha2-Rezeptorsubtypen an dieser Funktion beteiligt sind. Eine eindeutige Zuordnung dieser alpha2-AR zu den Subtypen alpha2B oder alpha2C gelang aber bisher nicht. In dieser Arbeit sollte deshalb die Frage beantwortet werden, welche alpha2-AR neben dem alpha2A-AR an der präsynaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Zur Subtypunterscheidung wurden "knockout"-Mäuse verwendet, die nur einen oder zwei alpha2-Rezeptorsubtypen exprimierten. Gehirnschnitte aus dem Neokortex und den Basalganglien dieser Mauslinien wurden mit radoaktiv markiertem Noradrenalin bzw. Dopamin inkubiert. Anschließend wurde in Transmitterfreisetzungsexperimenten mit den so behandelten Gehirnschnitten Konzentrations-Wirkungskurven mit verschiedenen Liganden erstellt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, daß neben den alpha2A-AR auch alpha2C-AR präsynaptisch die Transmitterfreisetzung von Noradrenalin und Dopamin hemmen. In einem weiteren Schritt wurde die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der alpha2A- und alpha2C-AR im heterologen Expressionssystem untersucht. Hierzu wurden stabile HEK293-Zellinien generiert, die entweder alpha2A- oder alpha2C-AR unterschiedlich stark exprimierten. Diese Zellinien wurden transient mit GIRK-Kanälen transfiziert, um die durch Stimulation mit Noradrenalin resultierenden Kaliumströme mit der "patch-clamp"-Technik zu messen. Dabei ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen alpha2A- und alpha2C-AR bezüglich der Aktivierungskinetik. Alpha2C-AR deaktivierten jedoch deutlich langsamer als alpha2A-AR. Diese Befunde belegen, daß zwei der drei alpha2-AR-Subtypen, alpha2A und alpha2C, als präsynaptische Autorezeptoren (Noradrenalin) bzw. Heterorezeptoren (Dopamin) die Neurotransmission modulieren. Dies könnte in der Zukunft für die Entwicklung neuer, subtypspezifischer Pharmaka von großer Bedeutung sein.
Zusammenfassung Systeme zur induzierbaren Transgenexpression sind wichtige Werkzeuge, um die Funktion einzelner Gene in vitro und in vivo zu untersuchen. Sie bestehen aus drei Grundkomponenten, einem zu regulierenden Zielgen, einem "Schalter" und einem Liganden, der diesen Schalter bedient. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen am Ecdysonsystem durchgeführt, das als Schalter den Insektensteroidhormonrezeptor für das Verpuppungshormon Ecdyson verwendet. Zunächst wurde ein neuer Rezeptor mit der Ligandenbindedomäne des Ecdysonrezeptors (EcR) des Seidenspinners Bombyx mori konstruiert, dessen Eigenschaften in der Zellkultur mit einem DrosophilaEcR-Konstrukt, das für mammalische Expression optimiert ist, verglichen wurden. Mit dem BombyxEcR konnte die Transgenexpression durch den nichtsteroidalen Liganden Tebufenozid gesteuert werden, was beim DrosophilaEcR nicht möglich war. Damit ist man in diesem Expressionssystem nicht wie beim DrosophilaEcR auf teure steroidale Liganden wie Ponasteron angewiesen. Außerdem mußte beim BombyxEcR der Heterodimerisierungspartner RXR nicht kotransfiziert werden. In Bezug auf erreichbaren Induktionsfaktor und Kinetik der Genexpression zeigten sich für die beiden Systeme vergleichbare Ergebnisse. Weiterhin wurden durch Pronukleusinjektion transgene Mäuse erzeugt, die den BombyxEcR unter einem herzspezifischen Promotor (aMHC) exprimieren. Als Zielgen wurde die b2a-Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals eingebracht, die mit dem neuen Schaltsystem herzspezifisch gesteuert werden sollte. Die Bioverfügbarkeit des Agonisten Tebufenozid nach intraperitonealer Injektion wurde in einem in-vitro Assay in HEK293-Zellen überprüft. Es ergaben sich hinreichende Wirkstoffspiegel im Serum der Mäuse, um das Reportergen zu induzieren. Auch wenn bei der transgenen Maus nach der Induktion mit Tebufenozid kein immunologischer Nachweis erhöhter Expression der b2a-Untereinheit gelang,konnte doch in Herzkatheteruntersuchungen eine veränderte Herzfunktion nachgewiesen werden. Bei transgenen Mäusen führte die intraperitoneale Applikation von Tebufenozid für bis zu sieben Tage zu einem signifikanten Anstieg des systolischen Blutdrucks und der maximalen linksventrikulären Kontraktionsgeschwindigkeit, der bei nicht-transgenen Kontrolltieren nicht beobachtet wurde. Diese Befunde deuten erstmals in vivo darauf hin, daß die b2a–Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals am Herzen eine positiv inotrope Wirkung vermitteln kann. Systeme zur induzierbaren Genexpression müssen weiterentwickelt werden, um die Ideale der präzisen Steuerung ohne Nebenwirkungen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für eine in weiterer Zukunft liegende Verwendung in der Gentherapie zu erreichen.
Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier.