535 Licht, Infrarot- und Ultraviolettphänomene
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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy
(2012)
Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 °C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 °C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.
Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are
likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost.
However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time.
In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data.
I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them.
I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units.
The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model.
I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples.
I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities.
Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems.
I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging.
In dieser Dissertation wurden zwei Aspekte der Wechselwirkung von Laserpulsen mit Molekülen betrachtet: Erstens wurden numerische Algorithmen, die auf der zeitabhängigen Störungstheorie basieren, zur Berechnung von quantenmechanischen Wellenfunktionen analysiert. Zweitens wurden Effekte der absoluten Phase (Carrier envelope phase = CEP) von Laserpulsen bei der Laseranregung molekularer Systeme analysiert. In den Analysen zum ersten Aspekt wurden zwei verschiedene Algorithmen - in dieser Arbeit als simple und improved algorithm bezeichnet - verwendet, und die Normabweichung von mit diesen Algorithmen berechneten Wellenfunktionen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Normabweichung für beide Algorithmen in zwei unterschiedliche Beiträge zerlegt werden kann. Der erste Normabweichungsbeitrag tritt aufgrund der numerischen Diskretisierung der Zeit auf und verschwindet, wenn der Zeitschritt, der die Dauer der Intervalle für diese Diskretisierung angibt, gegen Null geht. Man kann den ersten Normabweichungsbeitrag mit exzellenter Genauigkeit berechnen und seine Eigenschaften, die sich für die beiden Algorithmen erheblich unterschieden, eingehend analysieren. Der zweite Normabweichungsbeitrag tritt dadurch auf, dass die zeitabhängige Störungstheorie nicht normerhaltend ist, und geht daher gegen Null, wenn die Störungsordnung gegen unendlich geht. Dieser zweite Beitrag ist außerdem in guter Näherung unabhängig vom Zeitschritt und für beide Algorithmen näherungsweise gleich. Des Weiteren kann man das Verhalten des zweiten Normabweichungsbeitrags im Gegensatz zum ersten Beitrag nur qualitativ beschreiben. Für die Analyse zum zweiten Themengebiet dieser Arbeit, den CEP-Effekten, wurde betrachtet, ob CEP-Effekte auch für Laserpulse beliebiger Länge auftreten können. Über eine analytische Betrachtung erkennt man, dass dies für ein Zweiniveausystem nur dann der Fall ist, wenn beide Zustände vor Beginn der Wechselwirkung des Systems mit dem Laserpuls besetzt sind. Man kann aus diesem Ergebnis folgern, dass für einen Laserpuls, der zwei elektronische Zustände eines Moleküls über Einphotonenübergänge koppelt, in der Regel kein CEP-Effekt für beliebige Längen dieses Pulses auftritt. Der Grund dafür ist, dass vor der Wechselwirkung eines molekularen Systems mit einem Laserpuls für dieses üblicherweise nur der elektronische Grundzustand besetzt ist. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass dieses Problem durch ein spezielles Zweipulsschema für die Anregung eines molekularen Systems gelöst werden kann. Für dieses Pulsschema wird ein erster Puls verwendet, der zeitlich so kurz ist, dass Wellenpakete in mehreren elektronischen Zuständen angeregt werden. Der nachfolgende zweite Laserpuls ist spektral schmal, und seine zeitliche Länge kann beliebig groß gewählt werden. Man erhält für dieses Pulsschema Observablen, die von der CEP des zweiten Pulses, aber nicht von der CEP des ersten Pulses abhängen; somit ist ein CEP-Effekt nachweisbar. Derartige Observablen sind geometrische Asymmetrien für Zerfallsprodukte von Photodissoziationsreaktionen. Insbesondere unterscheidet sich das hier vorgestellte Pulsschema von anderen Zweipulsschemata, für welche Observablen von der Differenz der CEPs beider Pulse abhängen, aber nicht von der CEP einer der beiden Pulse allein.