570 Biowissenschaften; Biologie
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The composition of stable-isotope labelled isotopologues/isotopomers in metabolic products can be measured by mass spectrometry and supports the analysis of pathways and fluxes. As a prerequisite, the original mass spectra have to be processed, managed and stored to rapidly calculate, analyse and compare isotopomer enrichments to study, for instance, bacterial metabolism in infection. For such applications, we provide here the database application ‘Isotopo’. This software package includes (i) a database to store and process isotopomer data, (ii) a parser to upload and translate different data formats for such data and (iii) an improved application to process and convert signal intensities from mass spectra of \(^{13}C\)-labelled metabolites such as tertbutyldimethylsilyl-derivatives of amino acids. Relative mass intensities and isotopomer distributions are calculated applying a partial least square method with iterative refinement for high precision data. The data output includes formats such as graphs for overall enrichments in amino acids. The package is user-friendly for easy and robust data management of multiple experiments.
Words are built from smaller meaning bearing parts, called morphemes. As one word can contain multiple morphemes, one morpheme can be present in different words. The number of distinct words a morpheme can be found in is its family size. Here we used Birth-Death-Innovation Models (BDIMs) to analyze the distribution of morpheme family sizes in English and German vocabulary over the last 200 years. Rather than just fitting to a probability distribution, these mechanistic models allow for the direct interpretation of identified parameters. Despite the complexity of language change, we indeed found that a specific variant of this pure stochastic model, the second order linear balanced BDIM, significantly fitted the observed distributions. In this model, birth and death rates are increased for smaller morpheme families. This finding indicates an influence of morpheme family sizes on vocabulary changes. This could be an effect of word formation, perception or both. On a more general level, we give an example on how mechanistic models can enable the identification of statistical trends in language change usually hidden by cultural influences.
Volumenregulatorische Transportwege von anorganischen und organischen Osmolyten in Säugetierzellen
(2014)
Die Aufrechterhaltung des Zellvolumens unter variablen osmotischen Bedingungen stellt für nahezu alle tierischen Zellen eine essenzielle Aufgabe dar. Um regulatorische Volumenanpassungen vorzunehmen besitzen sie daher effektive Mechanismen, mit deren Hilfe der zelluläre Gehalt an organischen und anorganischen Osmolyten erhöht (= regulatorische Volumenzunahme; RVI) oder gesenkt (= regulatorische Volumenabnahme; RVD) werden kann. Trotz langjähriger Forschung auf diesem Gebiet konnten die hieran beteiligten Transportwege für Osmolyte bisher nur unvollständig aufgeklärt werden.
Insbesondere bei T-Lymphozyten sind wichtige Zellfunktionen wie die Proliferation, Migration und die T-Zell-Aktivierung eng mit volumenregulatorischen Mechanismen verbunden. Bei all diesen Prozessen sind u. a. unterschiedliche Kaliumkanäle beteiligt, die insbesondere für die pharmakologische Manipulation von Immunsystemprozessen von wissenschaftlichem Interesse sind. Bisherige Modelle der hypotonen Volumenregulation von T-Lymphozyten berücksichtigen lediglich den spannungsabhängigen KV1.3 sowie den Ca2+-aktivierten IKCa1-Kanal, die zur Klasse der 6TM/P-K+-Kanäle gehören.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine potentielle Rolle von kürzlich entdeckten Zwei-Poren Domänen Kaliumkanälen (K2P) am RVD von murinen und humanen primären CD4+-T-Lymphozyten untersucht. In einem kombinierten genetischen und pharmakologischen Ansatz mittels knockout-Tiermodellen und dem Einsatz kanalspezifischer Inhibitoren konnte mithilfe zellvolumetrischer Analysen gezeigt werden, dass die K2P-Vertreter TASK1, TASK2, TASK3 und TRESK maßgeblich am schwellungsaktivierten Efflux von K+ beteiligt sind. Beurteilt an den Ergebnissen dieser Untersuchung sind der spannungsabhängige TASK2- und der Ca2+-aktivierte TRESK-Kanal für die hypotone Volumenregulation in T-Zellen deutlich bedeutender als TASK1 und TASK3. Der Beitrag der Kanäle TASK2 und TRESK am RVD-Prozess war über dies vergleichbar mit dessen des bisher bekannten KV1.3-Kanals. In dieser Arbeit wurde damit erstmals eine Beteiligung der K2P-Kanäle am RVD muriner und humaner CD4+-Lymphozyten identifiziert. Aufgrund der engen Verbindung zwischen T-Zell-Funktion und der Volumenregulation können Zwei-Poren Domänen K+-Kanäle damit in den engeren Kreis potentieller immunmodulierende Angriffspunkte aufgefasst werden.
Im zweiten und umfangreicheren Teil dieser Arbeit wurden darüber hinaus die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte (small organic osmolytes; SOOs) untersucht. SOOs stellen chemisch inerte Verbindungen dar, zu denen vor allem Polyole (Sorbitol, myo-Inositol), Methylamine (Betain, α-Glycerophosphocholin) sowie Aminosäuren (α- bzw. β-Alanin und Prolin) und deren Derivate (Taurin) zählen. Da SOOs weder die zelluläre Struktur noch die Funktion von Makromolekülen beeinträchtigen, sind sie wichtige Instrumente der Volumenregulation, die sich in hohen Konzentrationen im Zytosol nahezu aller Zellen wiederfinden. Werden tierische Zellen mit hypotonen Bedingungen konfrontiert, dann ist bei nahezu allen Zellen die Freisetzung organischer Osmolyte zu beobachten, wodurch die zelluläre Osmolarität unabhängig von Elektrolyten angepasst werden kann. Trotz der wichtigen Funktion der SOOs in der Osmoregulation tierischer Zellen konnte die molekulare Identität beteiligter Effluxwege (Kanäle bzw. Transporter) bisher nicht aufgeklärt werden.
Ungeachtet der molekularen Identität der SOO-Effluxwege war es aus zahlreichen biotechnologischen Anwendungen zu Beginn dieser Arbeit bekannt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte eine größenselektive Permeabilität für eine Reihe monomerer Zucker und verwandter Verbindungen aufweisen. Um diese Größenselektivität näher zu charakterisieren, wurde im ersten Schritt die schwellungsaktivierte Membranpermeabilität für eine Reihe strukturell homogener Polyethylenglykole unterschiedlicher Polymerlänge (PEG200–1500; hydrodynamische Radien zwischen ~0,5-1,5 nm) unter iso- und hypotonen Bedingungen in Jurkat-Lymphozyten untersucht. Unter milden hypotonen Bedingungen (200 mOsm) war die Plasmamembran der untersuchten Lymphozyten für PEG300-1500 undurchlässig, was aus der Fähigkeit der Zellen zur hypotonen Volumenregulation geschlossen werden konnte. Darüber hinaus wurde RVD in stark hypotonen Lösungen (100 mOsm) mit PEG600-1500 beobachtet, während PEG300-400 unter vergleichbaren osmotischen Bedingungen die Volumenregulation der Zellen inhibierten. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass starkes hypotones Zellschwellen der Lymphozyten zur Permeabilisierung der Plasmamembran für PEG300-400, nicht jedoch für PEG600-1500, führt. Anhand der hydrodynamischen Radien Rh der verwendeten PEGs konnte ein cutoff-Radius von ~0,74 nm für schwellungsaktivierte Transportwege organischer Osmolyte bestimmt werden. Da diese schwellungsaktivierten Transportwege vielfältig für Zellbeladungstechniken verwendet werden, könnte dieses Ergebnis für zahlreiche biotechnologische und biomedizinische Anwendungen von Interesse sein.
Im zweiten Schritt wurde der Versuch unternommen, potentielle Transportwege für organische Osmolyte im RVD-Prozess molekular zu identifizieren. Da es grundlegend ungeklärt war, wie viele unterschiedliche Transporter bzw. Kanäle am Efflux der zahlreichen organischen Osmolyte beteiligt sind, erfolgte zunächst die vergleichende Analyse des schwellungsaktivierten Membrantransports strukturell verschiedener SOOs einschließlich der Aminosulfonsäure Taurin und des Polyols myo-Inositol. Hierbei wurde erstmals gezeigt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für Taurin und myo-Inositol deutlich unterschiedliche Aktivitätsprofile aufweisen. Während der Taurintransport bereits unter milden hypotonen Bedingungen, d.h. nach einer geringen Absenkung der Osmolalität von 300 auf ~230 mOsm, aktiviert wurde, erfolgte die Aktivierung der Membranpermeabilität für myo-Inositol bei einer viel niedrigeren Osmolalität von ~150 mOsm. Darüber hinaus wiesen die beiden Transportwege unter vergleichbarem hypotonen Stress von 100 mOsm deutlich unterschiedliche Aktivitätsdauern auf (Transport von Taurin ~95 min und myo-Inositol ~40 min). Somit deuteten diese Ergebnisse erstmals auf substrat-spezifische Transportwege für SOOs hin, die voneinander stark abweichende osmotische Aktivierungsprofile besitzen.
Als aussichtsreiche Kandidaten für diese Transportwege wurden zwei Mitglieder der Gruppe der Solute Carrier (SLC) untersucht, die klare Übereinstimmungen mit den gesuchten Transportern für SOOs aufweisen. Daher wurde im Weiteren eine RVD-Beteiligung dieser Transportergruppe mit einer Kombination aus molekularbiologischer und konventioneller bzw. hochaufgelöster mikroskopischen Techniken überprüft. Die semiqantitativen RT-PCR-Ergebnisse dieser Arbeit zeigen dabei, dass die Gentranskription der potentiellen SOO-Transporter SLC5A3 und SLC6A6 in den untersuchten Zelllinien Jurkat, HEK wie auch HepG2-Zellen durch hypotone Bedingungen deutlich verstärkt wird. Hierbei nimmt der zelluläre mRNA-Gehalt der Gene SLC5A3 zwischen 20-60% und SLC6A6 um 30-100% innerhalb von 10-20 min zu, was auf eine potentielle RVD-Beteiligung von SLC-Transportern hindeutet. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde daraufhin die zelluläre Lokalisation des SLC5A3-Transporters unter isotonen und hypotonen Bedingungen mikroskopisch untersucht. Wie anhand der konfokalen lasermikroskopischen Untersuchung zu erkennen ist, findet unter hypotoner Stimulation eine zelluläre Umverteilung des mit EGFP fluoreszenzmarkierten Proteins SLC5A3 statt. Innerhalb von 10 min wird der Transporter dabei von intrazellulären Regionen in Richtung Plasmamembran verlagert. Darüber hinaus konnte mit Hilfe der hochauflösenden Mikroskopie-Technik dSTORM gezeigt werden, dass der Transporter SLC5A3 unter hypotoner Stimulation verstärkt mit der Plasmamembran assoziiert vorliegt. Diese verstärkte Membranassoziation des SLC5A3-Proteins deutet damit auf einen schwellungsinduzierten exozytotischen Einbau des Transporters hin.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen damit erstmals, dass SLC-Transporter wie SLC5A3, SLC6A6 und vermutlich andere Vertreter der SLC-Superfamilie potentiell am Mechanismus der hypotonen Volumenregulation beteiligt sind. Da SLC-Transporter als wichtige Transportsysteme für Therapeutika angesehen werden und die Mechanismen der Volumenregulation bereits in zahlreichen biotechnologischen Anwendungen implementiert sind, könnte der hier aufgedeckte Zusammenhang einen Erkenntnisgewinn für zahlreiche biomedizinische Forschungsgebiete darstellen.
Staphylococcus aureus is a major threat to public health systems all over the globe. This second most cause of nosocomial infections is able to provoke a wide variety of different types of infection in humans and animals, ranging from superficial skin and skin structure infections to invasive disease like sepsis or pneumonia. But not enough, this pathogen is also notorious in acquiring and/or developing resistance to antimicrobial compounds, thus limiting available treatment options severely. Therefore, development of new compounds and strategies to fight S. aureus is of paramount importance. But since only 1 out of 5 compounds, which entered clinical trials, becomes a drug, the preclinical evaluation of promising compounds has to be reconsidered, too. The aim of this thesis was to address both sides of this problem: first, to improve preclinical testing by incorporating in vivo imaging technologies to the preclinical testing procedure in order to acquire additional and clearer data about efficacy of promising compounds and second, by evaluating lysostaphin, which is a promising, new option to fight S. aureus infections.
The first aim of this thesis focused on the establishment of a dual modality in vivo imaging platform, consisting of Bioluminescence Imaging (BLI) and Magnetic Resonance Imaging (MRI), to offer detailed insights into the course and gravity of S. aureus infection in the murine thigh infection model. Since luciferase-expressing S. aureus strains were generated in former studies and enabled thus bioluminescence imaging of bacterial infection, this technology should be implemented into the compound evaluation platform in order to non-invasively track the bacterial burden over time. MRI, in contrast, was only rarely used in earlier studies to visualize and measure the course of infection or efficacy of anti-bacterial therapy. Thus, the first set of experiments was performed to identify benefits and drawbacks of visualizing S. aureus infections in the mouse model by different MR methods. Native, proton-based MR imaging showed in this regard increased T2 relaxation times in the infected thigh muscles, but it was not possible to define a clear border between infected and uninfected tissue. Iron oxide nanoparticles and perfluorocarbon emulsions, two MR contrast agents or tracer, in contrast, offered this distinction. Iron oxide particles were detected in this regard by their distortion of 1H signal in proton-based MRI, while perfluorocarbon emulsion was identified by 19F MRI. Mammals do not harbor sufficient intrinsic amounts of 19F to deliver specific signal and therefore, 19F MR imaging visualizes only the signal of administered perfluorocarbon emulsion. The in vivo accumulation of perfluorocarbon emulsion can be imaged by 19F MRI and overlayed on a simultaneously acquired 1H MR image, which shows the anatomical context in clear detail. Since this is advantageous compared to contrast agent based MR methods like iron oxide particle-based MRI, further experiments were performed with perfluorocarbon emulsions and 19F MRI.
Experimental studies to elucidate the accumulation of perfluorocarbon emulsion at the site of infection showed robust 19F MR signals after administration between day 2 and at least day 8 p.i.. Perfluorocarbon emulsion accumulated in all investigated mice in the shape of a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and the signal remained stable as long as the infection prevailed. In order to identify the mechanism of accumulation, flow cytometry, cell sorting and histology studies were performed. Flow cytometry and cell sorting analysis of immune cells at the site of infection showed that neutrophils, monocytes, macrophages and dendritic cells carried contrast media at the site of infection with neutrophils accounting for the overwhelming portion of perfluorocarbon signal. In general, most of the signal was associated with immune cells, thus indicating specific immune cell dependent accumulation. Histology supported this observation since perfluorocarbon emulsion related fluorescence could only be visualized in close proximity to immune cell nuclei.
After establishing and testing of 19F MRI with perfluorocarbon emulsions as infection imaging modality, the effects of antibiotic therapy upon MR signal was investigated in order to evaluate the capability of this modality for preclinical testing procedure. Thus, the efficacy of vancomycin and linezolid, two clinically highly relevant anti - S. aureus compounds, were tested in the murine thigh infection model. Both of them showed reduction of the colony forming units and bioluminescence signal, but also of perfluorocarbon emulsion accumulation strength and volume at the site of infection, which was visualized and quantified by 19F MRI. The efficacy pattern with linezolid being more efficient in clearing bacterial infection was shown similarly by all three methods. In consequence, 19F MRI with perfluorocarbon emulsion as MR tracer proved to be capable to visualize antibacterial therapy in preclinical testing models.
The next step was consequently to evaluate a promising new compound against S. aureus infections. Thus, lysostaphin, an endo-peptidase that cleaves the cell wall of S. aureus, was tested in different concentrations alone or in combination with oxacillin for efficacy in murine thigh and catheter associated infection models. Lysostaphin only in the concentration of 5 mg/kg body weight or combined with oxacillin in the concentration of 2 mg/kg showed strong reduction of bacterial burden by colony forming unit determination and bioluminescence imaging in both models. The perfluorocarbon accumulation was investigated in the thigh infection model by 19F MRI and was strongly reduced in terms of volume and signal strength in both above-mentioned groups. In general, lysostaphin showed comparable or superior efficacy than vancomycin or oxacillin alone. Therefore, further development of lysostaphin for the treatment of S. aureus infections is recommended by these experiments. Overall, the antibiotic efficacy pattern of all applied antibiotic regimens was similar with all three applied methods, demonstrating the usefulness of MRI for antibiotic efficacy testing. Importantly, treatment with oxacillin either alone or in combination with lysostaphin resulted in stronger perfluorocarbon emulsion accumulation at the site of infection than expected compared to the results from bioluminescence imaging and colony forming unit determination. This might be an indication for immunomodulatory properties of oxacillin.
Further murine infection experiments demonstrated in this context a differential release of cytokine and chemokines in the infected thigh muscle in dependence of the applied antibacterial therapy. Especially treatment with oxacillin, but to a less degree with minocycline or linezolid, too, exhibited high levels of various cytokines and chemokines, although they reduced the bacterial burden efficiently. In consequence, possible immunomodulatory effects of antibacterial compounds have to be taken into account for future applications of imaging platforms relying on the visualization of the immune response. However, this observation opens a new field for these imaging modalities since it might be extraordinary interesting to study the immunomodulatory effects of compounds or even bacterial factors in vivo. And finally, a two modality imaging platform which combines methods to visualize on the one hand the bacterial burden and on the other hand the immune response offers an innovative, new platform to study host-pathogen interaction in vivo in a non-invasive fashion.
In summary, it could be shown that perfluorocarbon emulsions accumulate in immune cells at the site of infection in the murine S. aureus thigh infection model. The accumulation pattern shapes a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and its size and perfluorocarbon content is dependent on the severity of disease and/or efficacy of antibiotic therapy. Thus, 19F MRI with perfluorocarbon emulsions is a useful imaging modality to visualize sites and course of infection as well as to evaluate promising antibacterial drug candidates. Furthermore, since the accumulation of tracer depends on immune cells, it might be additionally interesting for studies regarding the immune response to infections, auto-immune diseases or cancer, but also to investigate the efficacy of immunomodulatory compounds and immunization.
Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen.
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen.
Die primordialen Keimzellen (PGCs) sind die einzigen Zellen des Embryos, die die genetische Information von einer Generation an die nächste weiter geben können. Es wurde gezeigt, dass in allen bislang untersuchten Knochenfischen die Anzahl der Urgeschlechtszellen während der Embryonalentwicklung der erste sichtbare Unterschied zwischen Männchen und Weibchen ist. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Anzahl der primordialen Keimzellen das Geschlecht bestimmt, oder ob die somatischen Zellen je nach sexueller Identität die Urgeschlechtszellen zur Proliferation anregen. Um zu untersuchen, wie die Anzahl der
Urgeschlechtszellen mit der Geschlechtsdetermination zusammenhängt, habe ich in dieser Arbeit die Anzahl der Urgeschlechtszellen manipuliert und deren Schicksal im Verlauf der Embryonalentwicklung verfolgt. Weiterhin untersuchte ich, in wieweit die Temperatur einen Einfluss auf die Geschlechtsbestimmung hat und ob sie Auswirkungen auf die Anzahl
und die Wanderung der Urgeschlechtszellen hat beim Medaka hat.
Durch meine Experimente, in denen ich die Fische während der Embryonalentwicklung bei verschiedenen Temperaturen hielt, konnte ich zeigen, dass beim Medaka der genetische Geschlechtsbestimmungsmechanismus durch erhöhte Temperatur überschrieben werden kann. Die Temperaturerhöhung in der Embryonalentwicklung führt zu einer Weibchen‐zu‐Männchen
Geschlechtsumkehr. Dabei wird die Anzahl der primordialen Keimzellen im Vergleich zu den Kontrollen reduziert. Zudem wird durch die höhere Temperatur das autosomale dmrt1a viel früher angeschaltet, wa sauf einen alternativenSignalweg deutet, der die männliche Geschlechtsentwicklung in XX geschlechtsumgewandelten Tieren steuert.
Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminosäuren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilität an Aminosäuresequenzen ermöglichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schlüsselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorgänge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindomänen durch die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht.
Der entfaltete Zustand der Bindungsdomäne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten übereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingefügten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindomäne von β-Strängen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben könnten.
Die N-terminale Domäne (NTD), der für die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist für die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser für die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs
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mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erhöhung der Ionenstärke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verhält: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der übrigen protonierbaren Aminosäureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen.
Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdomäne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abhängigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich verändern. Dies könnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben.
Die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die Möglichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen eröffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so möglich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abhängigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuolären Protonen-ATPase durchgeführt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation ermöglichten. Zusätzlich gestattete die Anwendung von intrazellulären Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuolären Membranleitfähigkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium.
Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabhängigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molekül bei gleichzeitigem Anstieg der vakuolären Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zusätzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abhängige Regulation der V-ATPase-Aktivität erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuolären pH-Wertes wesentlich stärker auf die ATP-Bindungsaffinität und Transportkapazität des Enzyms wirkt, als Änderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-Änderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zusätzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) für die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen Rückkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinität (Km) und schlägt eine pH-abhängige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ungünstigen intrazellulären Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universität Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivität durch den Wegfall von Disulfidbrücken innerhalb des Pumpproteins erfassen und mögliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen.
Mit Hilfe von intrazellulären Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuoläre Leitfähigkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren – verursacht durch den Einstich von intrazellulären Mikroelektroden – deutliche Veränderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calciumänderungen und elektrischen Membranleitfähigkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterführenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Ströme von vakuolären Membranleitfähigkeiten führt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss.
The rapid appearance of resistant malarial parasites after introduction of atovaquone (ATQ) drug has prompted the search for new drugs as even single point mutations in the active site of Cytochrome b protein can rapidly render ATQ ineffective. The presence of Y268 mutations in the Cytochrome b (Cyt b) protein is previously suggested to be responsible for the ATQ resistance in Plasmodium falciparum (P. falciparum). In this study, we examined the resistance mechanism against ATQ in P. falciparum through computational methods. Here, we reported a reliable protein model of Cyt bc1 complex containing Cyt b and the Iron-Sulphur Protein (ISP) of P. falciparum using composite modeling method by combining threading, ab initio modeling and atomic-level structure refinement approaches. The molecular dynamics simulations suggest that Y268S mutation causes ATQ resistance by reducing hydrophobic interactions between Cyt bc1 protein complex and ATQ. Moreover, the important histidine contact of ATQ with the ISP chain is also lost due to Y268S mutation. We noticed the induced mutation alters the arrangement of active site residues in a fashion that enforces ATQ to find its new stable binding site far away from the wild-type binding pocket. The MM-PBSA calculations also shows that the binding affinity of ATQ with Cyt bc1 complex is enough to hold it at this new site that ultimately leads to the ATQ resistance.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellulär vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits während der Embryonalentwicklung zahlreiche Abläufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der Körperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Später steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus für deren Homöostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden können. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade auslöst.
Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu können, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die Möglichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verstärkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivitätssteigernde Co-Rezeptoren.
Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, löslichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine üben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazelluläres Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen ternären Komplexes verstärkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP fördern und so eine BMP-Aktivität vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine äußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu können, ist die Aufklärung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien für die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro ermöglichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Präparation stabiler ternärer Proteinkomplexe für weiterführende Kristallisationsansätze. Hochdurchsatzverfahren für die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminosäuren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies ermöglichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation für die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist.
Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation für die detaillierte Aufklärung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. Für eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile ternäre Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsansätze.