610 Medizin und Gesundheit
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Retiniert und verlagerte Zähne und deren Behandlung sind schon seit langem ein sehr interessantes und viel diskutiertes Thema in der Zahnmedizin. Häufig erfordert die Behandlung des verlagerten Zahnes ein koordiniertes und nicht selten interdisziplinäres Vorgehen. Die Zielsetzung dieser vorliegenden Studie lag in einer Erfolgsbewertung der unterschiedlichen Freilegungsmethoden (offene bzw. geschlossene Elongation) im Rahmen einer kieferchirurgisch-kieferorthopädischen Behandlung retinierter und verlagerter Zähne. Zur Klärung der Fragestellung wurden die Unterlagen von 124 Patienten, die zwischen November 1995 und Februar 2001 kieferchirurgisch auf Grund einer Freilegung eines oder mehrerer Zähne behandelt wurden, herangezogen. Das Patientenkollektiv bestand aus 57 männlichen und 67 weiblichen Patienten mit insgesamt 160 retinierten und verlagerten Zähnen. 41 Patienten konnten nachuntersucht werden. Die Patienten waren zum Zeitpunkt der chirurgischen Freilegung durchschnittlich 14 Jahre und zwei Monate alt und befanden sich bereits im Schnitt ein Jahr und zehn Monate in kieferorthopädischer Behandlung. Zusätzlich zur Verlagerung konnten Platzmangel (52,3%), enge Keimlage (15.6%) und Nichtanlagen (11,3%; exkl. Weisheitszähne) am häufigsten als Nebenbefunde diagnostiziert werden. Die Achsenneigung der retinierten und verlagerten Zähne lag zu 65,6% im „schräg“ definierten Bereich zwischen 30 und 75 Grad bzw. über 105 Grad. Das Wurzelwachstum war bei 51,9% zu 2/3 bzw. bei 42.5% komplett abgeschlossen. Die kieferorthopädische Behandlung wurde nach dem operativen Eingriff durchschnittlich nach 15 Tagen fortgesetzt und im Schnitt nach zwei Jahren abgeschlossen. 90% der Zähne wurden mit ausschließlich festsitzenden Apparaturen eingestellt. Sechs Zähne mussten vor Abschluss der Behandlung extrahiert werden, da sie sich als nicht einstellbar erwiesen. Die Ergebnisse wurden hinsichtlich der dentalen Ausgangslage, der Behandlungsergebnisse, der zeitlichen Parameter und der parodontalen Verhältnisse betrachtet. Die wesentlichen Aussagen dieser retrospektiven Studie lassen sich wie folgt darstellen: Zähne, deren Achsenneigungen stärker als 45 Grad von der Durchbruchsrichtung abweichen, können erfolgreich eingeordnet werden, auch wenn dies mit einer evtl. längeren Einstellzeit verbunden ist. Die Behandlungsergebnisse, bezogen auf Einstellung in den Zahnbogen und physiologischen Kontakt zum Antagonisten, ergaben keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der beiden Freilegungsmethoden. Somit kann mit beiden Freilegungsmethoden ein funktionell gutes Ergebnis erzielt werden. Ein Zahn lässt sich, hinsichtlich der Zeit, umso schneller in den Zahnbogen einordnen, je senkrechter er zur Okklusionsebene steht. Molaren weisen in der Regel die kürzesten Einstellungszeiten nach chirurgischer Freilegung auf. 17,5% der operierten Zähne mussten revidiert werden. Es konnten keine Wurzelverkürzungen im Vergleich zur Ausgangssituation festgestellt werden. In 22,3% der Fälle kam es zu einer Resorption der behandelten Zähne bzw. in 31,3% zu einer Resorption der benachbarten Zähne. Die parodontalen Verhältnisse nach geschlossener Elongation stellen sich geringfügig, statistisch aber nicht signifikant besser dar als nach offener Elongation. Die Einordnung retinierter und verlagerter Zähne ist bis heute eine komplexe interdisziplinäre Behandlungsaufgabe und stellt für den Behandler eine Herausforderung dar, deren Ergebnis erheblich von der Ausgangslage bei Behandlungsbeginn abhängt Mit den Ergebnissen dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die geschlossene Elongation gegenüber anderen Behandlungsmethoden einen geringen Vorteil im Hinblick auf die posttherapeutischen parodontalen Verhältnisse hat. Die vorliegende Arbeit bestätigt in wesentlichen Teilen die Aussagen der themenbezogenen wissenschaftlichen Literatur, die überwiegend der geschlossenen Methode zur Einstellung retinierter und verlagerter Zähne den Vorzug gibt.
Gegenstand dieser Doktorarbeit war die Beschreibung des Urokinaseplaminaktivators uPA im C6-Sphäroidmodell der Ratte und dessen Lokalisation in Bezug auf den Primärtumor. Das hierbei verwendete Tiermodell basiert auf der C6-Tumorzellreihe, welche durch Transfektion von Rattengliomzellen mit dem Vaskularisierungsfaktor VEGF entwickelt wurde. Die gesteigerte Expression von VEGF resultiert in einer stärkeren Vaskularisierung und einer erhöhten Wachstumsrate des Tumors. Im Vorfeld der Tumorimplantation konnte die Expression von uPA durch die C6-Tumorzellen mittels reverser RNA-Transkription und Polymerasekettenreaktion nachgewiesen werden. In vitro gelang der Nachweis von uPA im C6-Sphäroiden mittels Fluoreszenz-Färbung. Im Rahmen des Tierversuches wurden aus den Tumorzellen ca. 300µm große Sphäroide hergestellt, welche den Ratten in den Kortex des linken Frontallappens implantiert wurden und dort solide Hirntumoren bildeten. Die Versuchstiere wurden anschließend in zwei Gruppen aufgeteilt. Der Positivgruppe wurde täglich über einen Zeitraum von 19 bzw. 21 Tagen der Proteasehemmer WX-UK1 in die Bauchhöhle injiziert, die Kontrollgruppe erhielt ein Placebo. Nach Ablauf des Behandlungszeitraumes konnte an den explantierten Gehirnen mittels histochemischer Peroxidasefärbung die Protease uPA im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die Konzentration von uPA war besonders im invasionsaktiven Bereich des Tumors erhöht. Dieser entspricht der Randzone des soliden Tumors, sowie den distanzierten Zellnestern im gesunden Hirngewebe, welche als so genannte Invasionszone zusammengefasst werden. Die tragende Rolle von uPA bei der Invasion der Tumorzellen in das gesunde Hirngewebe konnte somit bestätigt werden. Die Messung von erhöhten uPA-Konzentrationen an der Basalmembran von Hirngefäßen korreliert mit Beobachtungen, dass die Tumorzellen entlang von Gefäßen und Plexus migrieren, aber nicht in der Lage sind, in das Gefäßlumen einzudringen. Der Nachweis der erfolgreichen orthotopen Sphäroidimplantation mittels MRT-Bildgebung der Hirntumoren unterstreicht den Vorteil der offenen Implantationstechnik gegenüber der Zellinjektion. Die peritoneale Verabreichung des Proteasehemmers WX-UK1 führte im Rahmen dieser Untersuchungen zu keiner signifikanten Reduktion des Tumorwachstums, welches mittels Volumenmessung im MRT dokumentiert wurde. Des Weiteren konnte keine Minderung der uPA-Konzentration in den Tumoren der Positivgruppe gegenüber der Kontrollgruppe gemessen werden. Neben der fehlenden Biodistribution des Wirkstoffes kommt hierfür auch eine mangelnde Spezifität von WX-UK1 für uPA oder ein alternativer Aktivierungsweg der Proteolyse innerhalb der Tumorzellen in Betracht. Diese Arbeit führt zur Weiterentwicklung des C6-Sphäroidmodells und unterstützt die zukünftige Entwicklung von Wirkstoffen gegen das Tumorwachstum auf Basis der anti-invasiven Therapie.
Die Identität von verschiedenen Stamm-und Vorläuferzellen wird durch zellspezifisches Genexpressionsmuster bestimmt128. Ähnlich einem Fingerabdruck ist eine Zelle durch ihr Expressionsprofil charakterisiert. In dieser Arbeit wurde die Expression der Transkritionsfaktoren PU.1 und Gabp-alpha und der Proteinkinase HPK 1 im murinen hämatopoetischen System mittels RT-PCR-Analysen betrachtet. Neben Gesamtknochenmark, hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen, ES-Zellen und NSZs wurden sowohl differenzierte Zellen des myeloischen Systems als auch des lymphatischen Systems analysiert. Die untersuchten Transkriptionsfaktoren PU.1 und Gabp-alpha konnten dabei ubiquitär in den untersuchten hämatopoetischen Zellpopulationen nachgewiesen werden. In NSCs konnte Gabp-alpha, jedoch nicht PU.1 nachgewiesen werden. HPK 1 wurde im Einklang mit früheren Ergebnissen in Gesamtknochenmark in T-und B-Zellen in hämatopoetischen Vorläuferzellen und zu geringem Umfang in embryonalen Stammzellen gefunden. Tiefere Einblicke in Veränderung des Expressionsprofils während der Differenzierung von unreifen Vorläuferzellen zu reifen Effektorzellen würden die Kenntnisse über die molekularen Mechanismen der Differenzierung erweitern. Diese Erkenntnisse sind die Voraussetzung um in den Differenzierungsvorgang regulativ einzugreifen.
Die Interaktion von CD4+ T-Zellen mit antigenpräsentierenden dendritischen Zellen (DC) verläuft in statischen und dynamischen Phasen, die jeweils zur Ausbildung einer immunologischen Synapse und T-Zell-Aktivierung führen. Um die Signalgebung in den stabilen wie auch dynamischen Phasen näher zu charakterisieren, wurde der Kalziumeinstrom während der T-Zell-Aktivierung zeitaufgelöst untersucht. Dies wurde in 3D Kollagenmatrices und zusätzlich in 3D Zellclustern durchgeführt, um zu klären, ob sich dynamische produktive Kontakte auch in kollagenfreien, räumlich komplexen Mikromileus ausbilden. Kokulturen aus murinen, naiven CD4+ T-Zellen (DO 11.10) und Ova-Peptid beladenen DC (BALB/c) in 3D Kollagenmatrix sowie die T-Zell/DC Cluster in Flüssigkultur wurden mittels Konfokalmikroskopie gefilmt. Die Zelldynamik wurde digital analysiert. Der Ca2+-Einstrom der T-Zellen wurde mittels zeitaufgelöster Fluo 3-Detektion semiquantitativ analysiert. Sowohl im Kollagengel wie auch in Flüssigkulturen erfolgte wenige Sekunden nach der initialen Kontaktaufnahme über die Vorderfront der T-Zelle ein starker Ca2+-Einstrom in die T-Zelle. Das Signal blieb während der gesamten Interaktion und der Ablöse-Phase, solange der Uropod der T-Zelle mit der DC verbunden war, kontinuierlich erhöht. In den sich spontan bildenden multizellulären Clustern erbrachte die morphodynamische Analyse von Kontakten Ca2+-positiver T-Zellen je 50% dynamische bzw. stabil-statische Kontakte, zu deren Dynamik sowohl die T-Zellen als auch die DC beitrugen. Die Geschwindigkeit der dynamischen Kontakte betrug ca. 4 μm/min (1-6 μm/min) und lag damit ca. 50-90% unterhalb der Geschwindigkeit der freien Migration im Kollagen. Analog zu Interaktionen im 3D Kollagengel wurden für Ca2+-positive T-Zellen produktive serielle und teils simultane Kontakte mit mehreren DC nachgewiesen. Der Nachweis dynamischer produktiver Kontakte in kollagenfreien Zellclustern legt einen promigratorischen Effekt der umgebenden räumlichen Komplexität selbst nahe. Das Spektrum von statischen und dynamischen Interaktionsphasen in Abhängigkeit von der räumlichen Komplexität repräsentiert so eine inhärente Eigenschaft der Zelldynamik von T-Zellen und bildet Teilaspekte des in vivo Verhaltens von T-Zellen in Lymphknoten ab. Zukünftige Studien sind notwendig, um zu klären, wie Interaktionscharakteristika auch zur Differenzierung, Effektorfunktion und/oder Anergie von T-Zellen beitragen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sämtliche histologischen Schnittpräparate mit Naevus sebaceus der Universitäts-Hautklinik Würzburg des Zeitraums 1996 bis 2005 auf die Ausprägung histologischer Merkmale sowie die Entstehung von Sekundärproloferationen untersucht. Klinische Daten wurden den Patientenakten entnommen. In der Einleitung wird eine genaue Beschreibung der Entität Naevus sebaceus sowie eine historische Abhandlung gegeben. Im Folgenden werden Material und Methoden des Vorgehens sowie die Ergebnisse beschrieben. Von klinischer Seite werden Lokalisation, Manifestationsalter, klinische Veränderung, Farbe, Größe, Linearität, etc. sowie von histologischer Seite die Ausprägung der Merkmale des Naevus sebaceus in Abhängigkeit vom Alter des Patienten und v.a. die genauen Daten zu Sekundärtumoren beleuchtet. Diese Ergebnisse werden in der Diskussion mit denen früherer Arbeiten verglichen. Eine Zusammenfassung sowie ein ausführlicher Bildanhang schließen sich an.
Der menschliche Organismus muss sich permanent mit pathogenen und nicht pathogenen Krankheitserregern auseinandersetzen. Hierzu stehen ihm verschiedene Systeme der Immunabwehr zur Verfügung, zu denen auch antimikrobielle Peptide (AMP) gehören, deren Wirkungsspektrum sich von Bakterien über Pilze bis hin zu Viren erstreckt. Die AMP sind nicht nur in der Lage Krankheitserreger direkt abzutöten, sondern darüber hinaus auch konzentrationsabhängig modulierend auf das adaptive Immunsystem einzuwirken, wie zum Beispiel über chemotaktische Effekte auf Lymphozyten. Den AMP, von denen beim Menschen bisher 6 alpha- und 4 betha Defensine sowie ein Cathelicidin (LL-37/hCAP-18) bekannt sind, kommt somit eine potentielle Schlüsselrolle in der Regulation der Immunabwehr zu. Bislang ist wenig über die Regulation der AMP bekannt, von denen einige konstitutiv expremiert werden, andere wiederum erst nach Stimulation, wie zum Beispiel Besiedlung mit bestimmten Keimen, vom jeweiligen Organ produziert und freigesetzt werden. Das Verständnis über die Wirkungsweise und die Regulation der AMP könnte möglicherweise der Klärung der Pathogenese von Erkrankungen dienen., bei denen eine bakterielle Mitbeteiligung nachgewiesen wurde, wie etwa den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Des Weiteren kommt den AMP aufgrund der komplexen Wirkung gegen Krankheitserreger auch eine potentielle therapeutische Rolle zu, welche auch in der vorliegenden Dissertation untersucht werden sollte. Hierzu wurden die Effekte von Liganden des peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) auf die Expression von LL-37 untersucht, da bei einigen dieser Liganden, insbesondere den aus der oralen Therapie des Diabetes mellitus Typ II bekannten Thiazolidindionen sowohl in der klinischen Beobachtung als auch im Tiermodell eine entzündungshemmende Wirkung nachgewiesen wurde. Die Gruppe der PPAR gehört zur Familie der Kernrezeptoren und wird in drei Subtypen alpha, betha und gamma unterteilt, wobei das größte Forschungsinteresse PPAR gamma zukommt. In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass Agonisten für PPAR gamma, wie Ciglitazone oder Rosiglitazone, und auch Antagonisten, wie das eingesetzte BADGE, einen modulierenden Effekt auf die Expression von LL-37 in Coloncarcinomzelllinien und Prämonozyten haben. Es zeigte sich, dass es unter Einwirkung von PPAR gamma- Agonisten zu einer signifikanten Reduktion der LL-37 Expression kam. Dieser Effekt konnte ebenfalls in der Koinkubation mit Butyrat, einer kurzkettigen Fettsäure, die einen bekannten Induktor für LL-37 darstellt, beobachtet werden, wobei die Butyrat- induzierte LL-37 Expression durch beide Thiazolidindione signifikant gehemmt wurde. Darüber hinaus wurde auch die durch Butyrat bedingte Steigerung der Differenzierungsrate der Versuchszellen durch PPARg- Agonisten signifikant reduziert. Analog zu diesen Ergebnissen führte der Einsatz von BADGE zu einer signifikanten Steigerung der LL-37 Expression, wobei dieses Ergebnis mit einem anderen PPAR gamma- Antagonisten nicht bestätigt werden konnte und somit auch eine BADGE spezifische Wirkung darstellen könnte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Modulation der LL-37 Expression nicht eindeutig mit der PPARg- Aktivität im Zellkern der Versuchszellen korreliert, was somit eher dafür spricht, dass der modulierende Effekt von PPAR gamma- Liganden auf die LL-37 Expression über einen von PPAR gamma unabhängigen Signalweg zustande kommt. Zusammenfassend hemmen die Thiazolidindione jedoch die LL-37 Expression in vitro, was eine entzündungs-hemmende Wirkung dieser Medikamente vermitteln könnte, da es über die Konzentrationsänderung von LL-37 zu einem Eingriff in die Modulation des spezifischen Immunsystems kommen kann. Um eine sichere Aussage darüber treffen zu können, ob die beobachtete antiinflamatorische Wirkung der Thiazolidindione über eine Expressionsänderung der AMP zustande kommt, müssen weiterführende Studien durchgeführt werden.
Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF gehört neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle für Überleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich für die Regulation synaptischer Plastizität. Besonders im Hippocampus, dem Ort der höchsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorgängen von Lernen und Gedächtnis mit, welches als Phänomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-Techniken im Gehirn der Maus oder Ratte nur sehr schwer gelungen. In den meisten Arbeiten gelang die Lokalisation von BDNF über den Nachweis von mRNA oder im Western Blot, die Gruppe von Conner et al. konnte einen qualitativen Nachweis von BDNF-Protein mittels eines eigens hergestellten Antiserums erbringen (Conner et al. 1997). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Antiserums gegen BDNF zur subzellulären Lokalisation mittels Immunhistochemie. Durch die Verwendung von Immunfluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörpern sollte zum einen eine quantitative Bestimmung von BDNF möglich sein, zum anderen sollte durch die Möglichkeit einer nahezu dreidimensionalen Darstellung des Gewebes mittels Vibratomschnitten auch eine Aussage über eine genauere Lokalisation von BDNF gemacht werden können. Um den immunhistochemischen Nachweis von BDNF-Protein im Hippocampus der Maus mittels Immunfluoreszenz führen zu können, wurde zunächst ein geeignetes Anti-serum benötigt. Zwei zu Vergleichszwecken ausgetestete kommerzielle Antikörper zeigten keine Färbung. Nach dem Vorbild zweier Arbeitsgruppen (Yan et al. 1997b und Conner et al. 1996, 1997) wurde ein Antiserum gegen humanes rekombinantes BDNF in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum erhielt den Namen „BDNF RabbitB“. Die Spezifität des Antiserums wurde mittels Western Blot und in der Zellkultur anhand von Hühnchen-DRGs überprüft. Im Western Blot zeigte das Antiserum eine spezifische Anfärbung von rekombinantem BDNF sowie im Hippocampus-Proteinextrakt. In der Kontrolle mit Präimmunserum zeigte sich keine Anfärbung. In der Zellkultur mit Hühnchen-DRGs konnte eine blockierende Wirkung des Antiserums in Gegenwart von BDNF als neurotrophem Wachstumsfaktor im Zellkulturmedium nachgewiesen werden, es zeigte sich eine signifikante Reduktion des Überlebens von Zellen bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:1.000. Das Präimmunserum zeigte keine Wirkung. Eine Kreuzreaktivität mit NGF als strukturähnlichem Protein konnte ausgeschlossen werden, da das Antiserum in Gegenwart von NGF im Kulturmedium keine Wirkung zeigte. Anschließend galt es, die Methoden für die Immunhistochemie mit diesem Antiserum zu optimieren, da es Hinweise gab, daß gerade die Immunhistochemie neurotropher Faktoren sehr sensibel auf verschiedene Methoden reagiert. Daher wurden sowohl die Fixierungsmethode, unterschiedliche Gewebeschnitte, verschiedene Puffersysteme und immunhistochemische Färbemethoden untersucht und verglichen. Die Standard-Fixierungsmethode mit Phosphat-Puffer, modifiziert nach der Methode nach Yan et al. 1997b mit maximal 2 h Nachfixierung stellte sich als beste Methode heraus. Eine Kombination zweier verschiedener Puffer (TBS und PB) innerhalb der Fixierung ist ungünstig. Daher sollte innerhalb einer Methode immer bei einem Puffersystem geblieben werden, wobei hier insgesamt bei dem Vergleich von PBS, TBS und TRIS-Puffer sowohl in der Fixierung als auch in der Färbemethode dem Phosphat-Puffer der Vorzug gegeben wird, welches auch das Standard-System darstellt. Bei den Gewebeschnitten sind, wie ursprünglich geplant Vibratomschnitte zu bevorzugen. Insgesamt konnten jedoch mögliche Ursachen für die Anfälligkeit der BDNF-Immunreaktivität bei Fixierungs- und Färbemethoden hier nicht abschließend erklärt werden. Problematisch war die ausgeprägte Hintergrundfärbung des Antiserums v.a. in der Immunhistochemie, die nicht ausreichend behoben werden konnte. Insofern sollte das Antiserum für die Verwendung bei immunhistochemischen Färbungen noch weiter optimiert werden. Für die Verwendung in der Zellkultur ist das Antiserum auf Grund seiner BDNF-blockierenden Eigenschaften gut einsetzbar. Im Western Blot sollte „BDNF RabbitB“ in einer Verdünnung von 1:5.000, in Zellkultur mit 1:1.000 und in der Immunhistochemie mit Vibratomschnitten mit 1:2.000 eingesetzt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die kardial differenzierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mittels der von Wobus et al. entwickelten Tröpfchentechnik gewonnen. Eine Optimierung der kardialen Ausbeute konnte durch eine Selektionsmethode erreicht werden, die auf der Expression eines Resistenzgens in den kardial differenzierten ES-Zellen beruht. Hierdurch wurde eine reproduzierbar hohe Anreicherung von ES-Kardiomyozyten erzielt. Die erstmalig durchgeführte quantitative Bestimmung der endogenen β-adrenergen Rezeptorexpression in ES-Kardiomyozyten zeigte eine Subtyp-Verteilung, die mit derjenigen in adulten Maus-Kardiomyozyten übereinstimmt, wobei eine höhere endogene Expression in ES-Kardiomyozyten vorlag. Ferner konnte durch eine β-adrenerge Stimulation in 16 Tage alten ES-Kardiomyozyten eine positive chronotrope Reaktion sowie eine Aktivierung der Adenylatzyklase-Aktivität hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass ES-Kardiomyozyten am 16. Differenzierungstag einen vollständig ausgereiften β-adrenergen Signalweg aufweisen und hinsichtlich der physiologischen Effekte vergleichbare Merkmale mit adulten Maus-Kardiomyoyzten haben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit eines adenoviralen Gentransfers in ES-Kardiomoyzten zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass der Gentransfer mittels rekombinanten Adenoviren eine sehr effiziente und durchführbare Methode zur Expression von Transgenen in ES-Kardiomyozyten ist. Weiterhin konnte die funktionelle Kopplung der adenoviral überexprimierten β1-adrenergen Rezeptoren nachgewiesen werden. Die Überexpression hatte eine ausgeprägte Sensitivierung der Rezeptorantwort zur Folge, während die maximale Isoprenalin-induzierte cAMP-Produktion nur wenig erhöht wurde. Dies entspricht Befunden an transgenen Mausmodellen mit einer β1-adrenergen Rezeptor-überexpression. Eine Sensitivierung des chronotropen Effektes konnte dagegen nicht gezeigt werden. Möglicherweise führte die Transfektion der ES-Kardiomyozyten-Zellverbände nur zu einem oberflächlich begrenzten Gentransfer, der keinen Einfluss auf die Gesamtheit des funktionellen Synzytiums hatte. Außerdem wurde in dieser Arbeit der Einfluss einer unterschiedlichen Phosducin-Expression auf die kardiale Differenzierungsfähigkeit in transgenen ES-Zellen untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied in der kardialen Differenzierung sowie in der Basalfrequenz von homozygoten und heterozygoten Phosducin Knock-out Klonen beziehungsweise von Phosducin überexprimierenden Zellklonen festgestellt werden.
Eine der Hauptaufgaben der Niere besteht in der Ausscheidung körpereigener und körperfremder Abfallstoffe und Stoffwechselmetabolite. Eine Reihe dieser Substanzen gehört zur Gruppe der organischen Anionen, diese werden mit Hilfe eines eigenen Transportsystems aus dem Blut durch die Nierenepithelzelle in den Urin transportiert. Eines der wichtigsten Transportproteine dieses Ausscheidungssystems ist der organische Anionentransporter hOAT1 der basolateralen Zellmembran. Es ist bekannt, dass die an der Stoffausscheidung beteiligten Transportproteine modulatorischen Einflüssen unterliegen können. Kürzlich fanden sich an OK (opossum kidney)-Zellen Hinweise, dass der Wachstumsfaktor EGF das Transportsystem für organische Anionen stimulieren kann, ohne dass die genaue Identität der beteiligten Transportproteine aufgeklärt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der akute, modulatorische Einfluß des Wachstumsfaktors EGF auf ein definiertes menschliches Transportprotein für organische Anionen, den hOAT1, untersucht. Die menschliche Nierenepithelzelllinie IHKE1 wurde zu diesem Zweck mit dem hOAT1-Transportprotein stabil transfiziert. Die Versuchsergebnisse zeigten eine hohe basolaterale Transportaktivität der transfizierten Zellen für organische Anionen, und nach einer zehnminütigen Vorinkubation mit EGF eine deutliche Stimulation der basolateralen Aufnahmeaktivität. Durch EGF wird also in menschlichen Nierenepithelien der organische Anionentransport akut über das hOAT1-Protein in der basolateralen Zellmembran stimuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Signaltransduktion dieses stimulierenden Effektes durch die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt wird. In der Absicht, mehr Aufschluss über die Mechanismen der intrazellulären Signaltransduktion vom EGF-Rezeptor an den hOAT1 zu gewinnen, etablierten wir das System aus EGF-Rezeptor HER1 und Anionentransporter hOAT1 für weitere Versuche in der CHO-Zelllinie. In CHO-HER1-Zellen führte eine Vorinkubation mit EGF zu einer Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, und CHO-hOAT1-Zellen zeigten im Gegensatz zum CHO-Wildtyp eine deutliche Transportaktivität für Fluorescein. In ko-transfizierten CHO-HER1-hOAT1-Zellen konnte in IHKE1-hOAT1-Zellen ein modulatorischer Effekt des Wachstumsfaktors auf die Aktivität des Anionentransporters nachgewiesen werden. EGF bewirkte jedoch hier keine Stimulation, sondern eine (ebenfalls über die Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2 vermittelte) Hemmung des hOAT1-Transportproteins. EGF wirkt also in den unpolaren CHO-Zellen genau gegensätzlich auf das hOAT1-Transportprotein wie an der basolateralen Membran der polaren, epithelialen IHKE1-Zellen, in beiden Fällen wird jedoch die Wirkung über die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt. Wie reagieren nun in polaren IHKE1-Zellen hOAT1-Proteine, die sich nicht in der basolateralen Membran befinden? Zur Klärung dieser Frage nutzten wir den Umstand, dass der hOAT1 in transfizierten IHKE1-hOAT1-Zellen stark überexprimiert wird, und untersuchten die Wirkung von EGF auf die apikale Fluoresceinaufnahme. Im Transportversuch zeigte sich in IHKE1-hOAT1-Zellen ohne EGF eine gegenüber dem Wildtyp signifikante Fluoresceinaufnahme an der apikalen Membran. Auf eine Vorinkubation mit EGF reagierten IHKE1-hOAT1-Zellen mit einer Hemmung dieser apikalen Fluoresceinaufnahme. Die hOAT1-Transportproteine in der apikalen Membran der IHKE1-hOAT1-Zellen reagierten somit genauso auf EGF wie Transportproteine in unpolaren CHO-Zellen: In beiden Versuchsaufbauen fand sich eine Hemmung der Fluoresceinaufnahme. In CHO-Zellen wurde diese Hemmung vermittelt über eine Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, in IHKE1-Zellen jedoch erfolgte die Hemmung unabhängig davon. Ein stimulierender Effekt von EGF auf den hOAT1, den die Ergebnisse an OK-Zellen nahegelegt hatten, fand sich nur an der basolateralen Membran von IHKE1-hOAT1-Zellen. Ob die unterschiedliche Wirkung von EGF auf hOAT1-Transportproteine in der basolateralen und der apikalen Nierenepithelmembran eine physiologische Bedeutung hat, lässt sich nur vermuten. Denkbar wäre jedoch, dass durch gleichzeitige Stimulation der basolateralen Aufnahme und Hemmung des Rücktransportes durch die apikale Membran eine ausreichende Sekretion organischer Anionen über EGF vermittelt auch bei entzündlicher Schädigung des Nierencortex oder im Falle einer Ischämie gewährleistet bleibt.