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Zusammenfassung
Hintergrund: Das saure Gliafaserprotein (GFAP) kommt im ZNS vor allem in Astrozyten vor und spielt eine Rolle bei der Astrozytose, die wiederum ist ein pathogenetisches Merkmal von HIV-assoziierten neurologischen Erkrankungen (HAND). In dieser Arbeit wird das Vorkommen von GFAP-Autoantikörpern bei PLWH und deren Bedeutung bei der Entstehung von HAND untersucht. Außerdem wird eruiert, ob GFAP-Autoantikörper als Marker eines neurokognitiven Defizites bei HAND in Frage kommen.
Methoden: Homogenisiert Gewebeschnitte von verschiedenen Gehirnareale wurden mittels SDS-Gelelektrophorese und Western Blot auf Membranen übertragen. Diese Membranen wurden mit Blutproben aus der HAND-1 Studie inkubiert. Der Nachweis von GFAP-Antikörpern erfolgte indirekt mittels eines IgG-Antikörpers. Die Anti-GFAP Signalintensitäten wurden semiquantitativ ausgewertet und mit den Daten der neurokognitiven Test der HAND-1 Studie korreliert.
Egebnisse: Die GFAP-Autoantikörper Signalintensität unterscheidet sich je nach Gehirnareal (p < 0,0001). Insbesondere die DM-Signale sind signifikant stärker als die der anderen Areale (p < 0,01). Es lässt sich insgesamt kein signifikanter Unterschied in der Signalstärke zwischen Menschen mit HIV und Kontrollen feststellen (p = 0,1742). Bei der HIV-Gruppe zeigt das Gesamtergebnis des MMS einen signifikanten, negativen und starken Zusammenhang mit der GFAP- Antikörpersignalintensität der Areale DM (p = 0,004), ST (p = 0,011), MC (p = 0,007) und FC (p = 0,002). Es konnten keine signifikanten Korrelationen zwischen den CD4-Zellzahlen und den Anti-GFAP Signalintensitäten festgestellt werden. Bei der Kontrollgruppe fanden sich lediglich vereinzelt signifikante Korrelationen.
Diskussion: Diese Promotion ist die bis dato erste Veröffentlichung, in der GFAP-Autoantikörper bei Menschen mit HIV gemessen wurden. Dass kein Unterschied im Vorkommen von GFAP-Ak bei PLWH und der Kontrollgruppe gefunden wurde, könnte an der geringen Teilnehmendenzahl oder am Mangel von Teilnehmenden mit HAD liegen. Andererseits könnte es auch dafür sprechen, dass anti-GFAP nicht obligat pathogen ist, sondern erst nach Übertritt über die Blut-Hirn-Schranke pathologische Folgen hat. Für diese Hypothese spricht die Erkenntnis, dass eine höhere Menge von GFAP-Ak mit einem schlechteren Abschneiden bei neurokognitiven Tests korreliert. Demnach könnten sich GFAP-Autoantikörper als diagnostische und möglicherweise prognostische Marker eines neurokognitiven Defizites bei HAND eignen.
Hintergrund: Um eine optimale Einstellung einer HIV-Therapie gewährleisten zu können, sind die regelmäßige Kontrolle der Viruslast und der CD4-Zellzahl notwendig. Die hohen Kosten, die das Monitoring der Viruslast bei einer steigenden Anzahl von Patienten, die eine HIV-Therapie erhalten, hervorruft, sind jedoch für viele Länder nicht zu bewältigen. Pooling-Strategien konnten bei einem festgesetzten und klinisch sinnvollen Viruslast-Grenzwert die Kosten des Monitorings effizient reduzieren. Dies galt jedoch bei einer niedrigen Rate an Patienten, die über dem Viruslast-Grenzwert lagen. In ärmeren Ländern ist die HIV-Infektionsrate oft besonders hoch und die Rate an Patienten mit hohen Viruslasten erscheint höher.
Methoden: Es wurden Informationen von Testanforderungsbögen ausgewertet, um Selektionskriterien zu finden, die die Wahrscheinlichkeit erhöhten, eventuelle Therapieversager zu erkennen. Anschließend wurde Blutplasma von 300 Patientenproben, die die gefundenen Selektionskriterien erfüllten, in drei 10x10 Matrices gepoolt. Zur Auswertung der Pools wurde ein bereits vorher entwickelter Algorithmus verwendet.
Ergebnisse: Als Selektionskriterien wurden gefunden, dass nur Patienten, die mindestens 16 Jahre alt waren und eine auf einem nicht-nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitor beruhende Therapie erhielten (first-line Therapie), für das Pooling geeignet waren. Die Rate an Patienten mit einer Viruslast von mindestens 1.000 HIV-1 RNA Kopien pro Milliliter unter den 300 Patientenproben betrug 11,0%. Durch die Anwendung der Matrix-Pooling-Methode konnten insgesamt 41% der Tests eingespart werden, was in einer durchschnittlichen Kostenreduktion von 1.640 US$ pro 100 Patientenproben resultierte. Dabei lag der negative prädiktive Wert bei 98% und der positive prädiktive Wert bei 100% bei einer Sensitivität von 81% und einer Spezifität von 100%.
Diskussion: Pooling-Methoden sind eine Möglichkeit, bei den bisher zur Verfügung stehenden kommerziell angebotenen Viruslasttestungen Kosten einzusparen und somit die Viruslasttestung in Ländern zu ermöglichen, die bisher die Kosten dafür nicht tragen konnten.
Hintergrund:
Die weltweit höchsten HIV-Prävalenzen finden sich im südlichen Afrika. In den letzten Jahren gelang in dieser Region die massive Ausweitung der Verfügbarkeit antiretroviraler Medikamente – ein großer Erfolg im Kampf gegen HIV und AIDS. Doch nur durch regelmäßiges Viruslastmonitoring können die Therapieerfolge nachhaltig gesichert werden. In vielen Ländern des südlichen Afrikas ist die Verfügbarkeit von Viruslasttests noch unzureichend. Gründe dafür sind die hohen Kosten und die Komplexität kommerzieller Testsysteme. Als Alternative für ressourcenknappe Regionen wurde eine qualitative PCR-Minipool-Strategie zum kombinierten Nachweis von virologischem Versagen und Medikamentenresistenzen vorgeschlagen. In dieser Arbeit sollte diese Methode an die Gegebenheiten des südlichen Afrikas adaptiert und im Rahmen einer Studie validiert werden.
Methoden:
Die qualitative PCR wurde zunächst für HIV-1 Subtyp C optimiert. Dafür wurden Primer designt und in eine Nested-PCR integriert. Das Detektionslimit der optimierten Methode wurde bestimmt, um den HIV-1 RNA-Eintrag in die RT-PCR so abstimmen zu können, dass trotz der qualitativen Natur der PCR eine Unterscheidung zwischen hoch- und niedrigpositiven Proben möglich war. Im Rahmen einer Studie an 50 südafrikanischen Patientenproben wurde die qualitative PCR-Minipool-Strategie mit der Referenzmethode verglichen. An einigen positiv getesteten Proben wurde eine genotypische Resistenztestung durchgeführt.
Ergebnisse:
Das Detektionslimit der Nested-PCR betrug 20 RNA-Kopien. Daraus wurde der optimale RNA-Eintrag in die RT-PCR abgeleitet. 50 Patientenproben wurden in 10 Minipools à 5 Proben getestet, anschließend erfolgte die Dekonvolution der 7 positiven Pools. Die qualitative PCR-Minipool-Strategie detektierte 10 der 11 Patientenproben mit einer Viruslast über 1.000 Kopien/ml. Die Übereinstimmung mit der Referenzmethode betrug 98 %, die diagnostische Sensitivität für die Detektion von Therapieversagern betrug 91 %, der negative prädiktive Wert 98 %. Die Spezifität und der positive prädiktive Wert betrugen jeweils 100 %. Durch die Minipool-Methode konnten 10 % der Tests eingespart werden. Vier positiv getestete Patientenproben wurden der genotypischen Resistenztestung zugeführt. Alle wurden erfolgreich sequenziert und resistenzassoziierte Mutationen wurden identifiziert.
Schlussfolgerung:
Die konsequente Virussuppression verbessert die Gesundheit der Patienten unter ART und ist eine Schlüsselmaßnahme auf dem Weg zur Beendigung der HIV-Pandemie. Viele Länder des südlichen Afrikas verfügen jedoch noch nicht über angepasste Technologien zum Monitoring der Viruslast. Die in dieser Arbeit optimierte Methode zeigte bei der qualitativen Viruslastbestimmung von 50 südafrikanischen Patientenproben eine hervorragende Übereinstimmung mit der Referenzmethode. Durch die Kombination mit einer genotypischen Resistenztestung bietet sie darüber hinaus wichtige Informationen über die Ätiologie des Therapieversagens. Dem behandelnden Arzt hilft das bei der Entscheidung über die Notwendigkeit einer Therapieumstellung. Durch ihr anpassungsfähiges und simples Testdesign ist die qualitative PCR-Minipool-Strategie für die Anwendung in ressourcenknappen Regionen des südlichen Afrikas geeignet.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen unter besonderem Fokus auf Prävalenz und Ausmaß der Erkrankung in Tansania.
In der CTC-Klinik des Bugando Medical Centres wurde eine neurokognitive Testbatterie implementiert. Diese wurde nach internationalen Standards entworfen und fragte u.a. Konzentrations- und Erinnerungsvermögen, Aufmerksamkeit sowie motorische Fähigkeiten ab. Die Teilnehmer wurden in drei Gruppen eingeteilt, eine HIV positive Gruppe unter antiviraler Therapie (n=101), eine HIV positive Gruppe ohne Therapie (n=88) und einer HIV negative Kontrollgruppe (n=62). Das Personal der CTC wurde geschult die Test durchzuführen.
55 (54,5%) der Teilnehmer der ersten Gruppe leiden an asymptomatischen neurokognitiven Einschränkungen. 38,6% weisen bereits milde Einschränkungen auf. In der Therapie-naiven Gruppe sind es deutlich weniger. Betrachtet man alle HIV positiven Teilnehmer der Studie, haben 67,2% bereits neurokognitive Einschränkungen.
Es war noch keiner der Teilnehmer an einer HIV assoziierten Demenz erkrankt.
Diese Zahlen demonstrieren, wie wichtig die Diagnostik zur Erkennung neurokognitiver Erkrankungen in Länder mit eingeschränkten Ressourcen ist. Die Studie hat gezeigt, dass das Integrieren einer solchen Testbatterie in den klinischen Alltag nicht schwierig ist. Im Bereich HIV/AIDS gibt es ein gut ausgebautes Netz an speziellen Kliniken, Hilfsgruppen, Aufklärungsprogrammen, Beratung und vielem mehr, das eventuell in Zukunft dazu beitragen könnte das Bewusstsein für diese Form von HIV-assoziierten Erkrankungen zu stärken (Freeman et. al. 2005) und neurokognitive Testbatterien als Routineuntersuchungen zu installieren, um Therapie und Betreuungsmöglichkeiten zu verbessern.
A 21 year old MSM patient with newly diagnosed HIV infection was hospitalized in our department after ingestion of an overdose of his antiretroviral therapy (ART) comprising dolutegravir (DTG - Tivicay\(^{®}\)) and tenofovir disaproxil fumarate/emtricitabine (Truvada\(^{®}\)) in suicidal intention. On admission, the patient did not show any clinical signs of intoxication and laboratory findings were unremarkable. After 6 hours of intensive care monitoring, the patient was referred to a psychiatric clinic. 5 days after the day of intoxication, serum creatinine levels increased to high normal values (1.2 mg/dl). However, levels never exceeded the upper threshold. 8 and 12 weeks later, serum creatinine normalized to levels measured prior to the intoxication. No other adverse events occurred, and the patient does not suffer from permanent impairments.
Zusammenfassung
Im Rahmen einer HIV-Infektion treten bei etwa der Hälfte aller Infizierten im Verlauf der Erkrankung neurokognitive Störungen auf. Zwar ist seit der Einführung der ART die Prävalenz der schweren HIV-Demenz zurückgegangen, aber vor allem mildere Formen sprechen nicht zufriedenstellend auf diese Therapie an und spielen auf Grund der insgesamt verbesserten Lebenserwartung von HIV-Patienten eine immer größere werdende Rolle. Um eine wirksame Therapie gegen HAND entwickeln zu können, sind detaillierte Kenntnisse über die Pathogenese und die Identifizierung von Risikofaktoren notwendig. In der vorliegenden Arbeit sollten daher drei unterschiedliche Faktoren auf ihren Zusammenhang mit HAND überprüft werden: der HIV-Protease Subtyp, die Höhe der Immunaktivierung und der DAT-Polymorphismus.
Hierfür standen Blut- und Plasmaproben von 112 HIV-Patienten und 30 Kontrollpersonen aus Tansania zur Verfügung, bei denen zuvor im Rahmen einer anderen medizinischen Doktorarbeit verschiedene neuropsychologische Tests durchgeführt worden waren. Zur Bestimmung des HIV-Protease Subtyps wurde die Virus-RNA aus dem Patienten-Plasma isoliert, in DNA umgeschrieben, gereinigt und anschließend sequenziert. Die Sequenz wurde mit Hilfe der Stanford University Database in Hinblick auf den HIV-Subtyp analysiert. Die Höhe der Immunaktivierung wurde durch Konzentrationsbestimmung der Immunaktivierungsmarker suPAR und human LBP mittels ELISA erfasst. Die Bestimmung des DAT-Polymorphismus erfolgte durch Isolation der Patienten-DNA aus den Blutproben, nachfolgender PCR und anschließender Agarosegelelektrophorese.
Die Untersuchung dieser drei Faktoren auf ihren Zusammenhang mit der neuropsychologischen Performance ergaben folgende Ergebnisse: 1. Der HIV-Protease Subtyp A und rekombinante Formen, die Subtyp A enthalten, gehen mit signifikant schlechteren Testergebnissen einher als die anderen HIV-Protease Subtypen. 2. Eine höhere Immunaktivierung korreliert ebenfalls mit schlechteren Testergebnissen. 3. Der DAT-Polymorphismus zeigt keine signifikanten Zusammenhänge mit HAND. Des Weiteren geht der HIV-Protease Subtyp C mit einer niedrigeren Immunaktivierung einher als die anderen Subtypen.
Diese Beobachtungen führen zu der Überlegung, dass der HIV-Protease Subtyp A sowie eine hohe periphere Immunaktivierung Risikofaktoren für die Entwicklung von HAND darstellen könnten und eventuell für die Pathogenese von Bedeutung sind. Der DAT-Polymorphismus scheint hierbei hingegen keine Rolle zu spielen. Bei dem Vorliegen des Subtyps A bzw. einer hohen Immunaktivierung sollte demnach über einen früheren Zeitpunkt für den Therapiebeginn mit ART nachgedacht werden, um die Entstehung von HAND zu verzögern oder sogar zu verhindern. Auf Grund der hohen Immunaktivierung als Risikofaktor für neuropsychologische Beeinträchtigungen sollte auch der Einsatz von immunmodulierenden Substanzen diskutiert werden. Die niedrigere Immunaktivierung, die bei einer Infektion mit dem HIV-Protease Subtyp C nachgewiesen werden konnte, könnte ein Hinweis auf eine niedrigere Pathogenität infolge einer Anpassung dieses Subtyps an den Menschen sein.
Da es sich bei all den durchgeführten Untersuchungen um Post-hoc-Analysen handelt, sind dringend weitere Studien zur Überprüfung der gefundenen Zusammenhänge notwendig.
HIV verursacht eine progressive Zerstörung des Immunsystems und führt zusätzlich durch Veränderungen im ZNS zu neurokognitiven Störungen (HIV-associated neurocognitive disorders, HAND). Die HIV-Infektion geht mit einer Dysfunktion von dopaminergen Signalwegen einher, die sich unter anderem in einer erhöhten Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor von Therapie-naiven HIV-Patienten äußert. Der Grund für die Dysregulation der dopaminergen Signalwege in HIV-Patienten ist nicht geklärt. Aufgrund dessen war das Hauptziel dieser Arbeit die Identifizierung des pathogenetischen Mechanismus, der zu einer erhöhten Dopamin-Konzentration im Liquor von HIV-Patienten führt. Die primäre Hypothese war, dass die erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nicht durch das Virus selbst, sondern vielmehr durch die genetische Konstitution der HIV-Patienten hervorgerufen wird. Deshalb wurden Polymorphismen untersucht, die die dopaminerge Neurotransmission beeinflussen. Es wurde vermutet, dass a) verschiedene Genotypen dieser Polymorphismen in nicht-infizierten und HIV-infizierten Personen mit anderen Häufigkeiten auftreten, b) verschiedene Genotypen mit veränderten Dopamin-Verfügbarkeiten assoziiert sind, c) unterschiedliche Genotypen Auswirkungen auf Marker der Progression der HIV-Infektion haben und d) verschiedene Genotypen die Immunaktivierung beeinflussen. Dazu wurden in 190 HIV-infizierten und nicht-infizierten Teilnehmern unterschiedlicher Ethnien die Polymorphismen BDNF Val66Met, COMT Val108/158Met, DAT 3‘-UTR VNTR, DRD2 TaqIα, DRD3 Ser9Gly und DRD4 VNRT mit PCR, ggf. Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese analysiert und die Expression des Dopamin-Transporters mit real time PCR bestimmt. Darüber hinaus wurden zur weiteren klinischen Charakterisierung die Immunmarker MCP-1, sCD14, suPAR und RANTES mit ELISA analysiert, da eine Erhöhung dieser Parameter mit einer beschleunigten HIV-Progression assoziiert ist. Die Bestimmung der T-Zell-Aktivierung (CD3/CD8/CD38/HLA-DR) wurde mit einer durchflusszytometrischen Analyse durchgeführt. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass HIV-Patienten hochsignifikant häufiger homozygot für das 10-repeat Allel des Dopamin-Transporter-Polymorphismus sind als nicht-infizierte Personen (57,1 % bzw. 26,8 %, p = 0,001, OR = 3,93, 95 % CI 1,72 – 8,96, direkte logistische Regression). HIV-Patienten und nicht-infizierte Personen mit diesem Genotyp weisen eine signifikant höhere Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor auf als Personen mit dem 9/10-Genotyp (p = 0,03) und eine signifikant geringere Expression des Dopamin-Transporters auf PBMCs (p = 0,05). Der DAT 10/10-Genotyp ist im Gegensatz zu anderen Genotypen in HIV-Patienten jedoch weder mit unterschiedlichen CD4+-Zellzahlen und Viruslasten noch mit einer veränderten Häufigkeit von HAND verbunden.
Zusätzlich weisen deutsche und südafrikanische nicht-infizierte und HIV-infizierte Personen mit dem DAT 10/10-Genotyp eine signifikant höhere MCP-1-Konzentration im Plasma auf als Personen mit anderen DAT-Genotypen (p = 0,0076). Keiner der Immunmarker ist mit der Dopamin-Verfügbarkeit assoziiert. Dennoch ist die Immunaktivierung in südafrikanischen HIV-Patienten im Vergleich zu nicht-infizierten Südafrikanern signifikant erhöht: HIV-Patienten zeigen im Vergleich zu nicht-infizierten Personen eine stärkere T-Zell-Aktivierung (p = 0,0001), eine erhöhte Plasma-Konzentration von MCP-1 (p = 0,0014), eine gesteigerte sCD14-Konzentration (p = 0,0004) und eine vermehrte suPAR-Konzentration im Plasma (p = 0,006). In der vorliegenden Arbeit konnte kein Nachweis erbracht werden, dass die erhöhte Immunaktivierung in den südafrikanischen HIV-Patienten durch die Koinfektion mit Echinoccocus oder durch genetische Polymorphismen bei Chemokinen hervorgerufen wird. Eine chronisch erhöhte Immunaktivierung stellt eine treibende Kraft für die Virusreplikation dar und kann letztendlich zu einer Erschöpfung des Immunsystems führen.
Der 10/10-Genotyp des DAT VNTR könnte einen Risiko-Faktor für die HIV-Infektion darstellen, da dieser eine erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nach sich zieht. Dopamin aktiviert HIV in chronisch infizierten T-Lymphoblasten und führt zudem zu einer erhöhten Expression und Sezernierung von TNF-α, das wiederum die Expression von HIV induziert. Diese Ergebnisse untermauern den Zusammenhang von Dopamin und HIV. Es ist jedoch nicht völlig geklärt, ob die erhöhte Dopamin-Konzentration ausschließlich durch den Genotyp hervorgerufen oder auch durch die HIV-Infektion begünstigt wird.
Dysfunction of dopaminergic neurotransmission has been implicated in HIV infection. We showed previously increased dopamine (DA) levels in CSF of therapy-naïve HIV patients and an inverse correlation between CSF DA and CD4 counts in the periphery, suggesting adverse effects of high levels of DA on HIV infection. In the current study including a total of 167 HIV-positive and negative donors from Germany and South Africa (SA), we investigated the mechanistic background for the increase of CSF DA in HIV individuals. Interestingly, we found that the DAT 10/10-repeat allele is present more frequently within HIV individuals than in uninfected subjects. Logistic regression analysis adjusted for gender and ethnicity showed an odds ratio for HIV infection in DAT 10/10 allele carriers of 3.93 (95 % CI 1.72–8.96; p = 0.001, Fishers exact test). 42.6 % HIV-infected patients harbored the DAT 10/10 allele compared to only 10.5 % uninfected DAT 10/10 carriers in SA (odds ratio 6.31), whereas 68.1 versus 40.9 %, respectively, in Germany (odds ratio 3.08). Subjects homozygous for the 10-repeat allele had higher amounts of CSF DA and reduced DAT mRNA expression but similar disease severity compared with those carrying other DAT genotypes. These intriguing and novel findings show the mutual interaction between DA and HIV, suggesting caution in the interpretation of CNS DA alterations in HIV infection solely as a secondary phenomenon to the virus and open the door for larger studies investigating consequences of the DAT functional polymorphism on HIV epidemiology and progression of disease.