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Zur Bestimmung von geringen Wirkstoffkonzentrationen in biologischen, speziell human-biologischen Matrizes wie Blut, Urin oder Mikrodialysat bedarf es einer Analysentechnik, die den Wirkstoff mit einem Höchstmaß an Selektivität, Spezifität und Präzision bestimmen kann. Daneben muß die verwendetete Methode eine hohe Geschwindigkeit aufweisen und sehr robust sein, da bei der heutigen marktwirtschaftlichen Lage Analysensysteme eine optimale Auslastung erfahren müssen. Aus diesem Grund ist der Umbau oder die Umstellung der Methode von einem zum anderen Wirkstoff ohne nennenswerten Zeitverlust ein maßgeblicher Faktor. Als Technik, die diese Anforderungen optimal erfüllt, hat sich in den letzten Jahren die LC-MS/MS-Technik etabliert. Sie ist den bislang überwiegenden Methoden, wie GC-MS-Techniken oder HPLC-UV-Detektion bzw. Fluoreszenztechniken in Bezug auf die oben genannten Parameter deutlich überlegen. In der vorliegenden Arbeit wurden für die Wirkstoffe Cisaprid, SC-72393, Haloperidol, Linezolid, Methotrexat und Ketoprofen LC-MS/MS-Methoden entwickelt oder via unabhängiger Laborvalidierung auf die lokalen Gegebenheiten transferiert und zur Bestimmung pharmakokinetischer Parameter zur Anwendung gebracht. Ziel der Methodenentwicklung war es die hohe Selektivität und Empfindlichkeit des Detektors zu nutzten, um bei geringen Probenvolumina eine Bestimmungsgrenze zu erreichen, die es ermöglichte ausreichend viele Meßwerte zu bestimmen, um die pharmakokinetischen Parameter der Wirkstoffe zu berechnen. Zusätzlich wurde eine Maximierung des Probendurchsatzes und eine Minimierung des personellen und materiellen Aufwandes angestrebt ohne dabei einen Qualitätsverlust der Methode zu erleiden. Eine gelungene Methoden-entwicklung bedurfte daher der Optimierung der Probenaufarbeitung, die sich neben den chemisch-physikalischen Eigenschaften des Wirkstoffes hauptsächlich an der Menge der zur Verfügung stehenden Probe orientierte. Das chromato-graphische System hingegen hing weitestgehend von den chemischen Eigenschaften des Analyten und von den massenspektroskopischen Bedingungen ab, die verdampfbare Puffer im Fließmittel erforderten. Diese drei zu optimierenden Teilbereiche, die miteinander interagieren, wurden jeweils sorgsam aufeinander abgestimmt, um eine Methode zu entwickeln, die die zu erwartenden Wirkstoffkonzentrationen in der jeweiligen Matrix sicher und robust bis hin zum Quantifizierungslimit bestimmen konnte.
Isolierung des Sp1-verwandten Transkriptionsfaktors Knopfkopf mittels eines PCR-basierten Homologie-Screens in der Maus. Das Gen Knopfkopf wurde anschließend hinsichtlich der evolutiven Verwandtschaftsbeziehungen zum Drosophila-Gen buttonhead eingeordnet. Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mit Hilfe einer gezielten Geninaktivierung durch homologe Rekombination (knock out). Es konnte gezeigt werden, dass das Gen in der Embryogenese der Maus essentiell ist für die Entwicklung der Extremitäten, der Nase und des Zentralen Nervensystems sowie der sekundären Gastrulation.
Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein übergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunität im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB für eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abhängige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erhöht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose während einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, nämlich Kaspase-3 zu interferieren. Überraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP überexprimiert wurde, rückläufig waren. Gegengleich führte Überexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erklärung dürfte in der Aktivität von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs ermöglichen dürfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese über die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus.
Delaire (1978) stellt in seiner kraniofazialen Analysemethode die Balance des neuro- und viszerokranialen Schädels in den Mittelpunkt. Er mißt der Ausgewogenheit der Proportionen eine zentrale Bedeutung bei der Beurteilung viszero- und neurokranialer Strukturen zu. In dieser Arbeit konnte ein Kollektiv von 81 Patienten mit prämaturen Kraniosynostosen nach der Delaire-Analyse untersucht werden. Von diesen 81 erfaßten Patienten (30 Saethre-Chotzen-, 24 Crouzon-, 13 Apert-, 6 Pfeiffer-, 3 Cohen- und 5 Muenke-Syndrom-Patienten) lagen insgesamt 183 auswertbare hochqualitative Fernröntgenbilder vor. Bedingung für die Aufnahme in diese Arbeit war das Mindestalter der Patienten von 3 Jahren, da während der ersten 3 Lebensjahre die Proportionen zwischen Kranium und Gesichtsschädel nicht mit denjenigen eines Erwachsenen vergleichbar sind. Erst ab dem Alter von 3 Jahren wächst der Gesichtsschädel in gleichem Maße wie das Neurokranium und erst dadurch wird die kraniofaziale Analyse nach Delaire aussagekräftig (Delaire et al. 1981). Um eine Vergleichsmöglichkeit der Meßwerte der Patienten mit syndromalen Kraniosynostosen zu erhalten, wurden die modifizierten Bolton-Standard-Werte herangezogen, die für die Delaire-Analyse mit einem Kalottendach versehen werden mußten. In dieser Arbeit wurden die Bolton-Standards von Broadbent et al. (1975) mit Werten von Dekaban (1977) ergänzt und ein Schädeldach hinzugefügt. Das Ergebnis wurde nach der Delaire-Analyse für den Zeitraum 1-18 Jahre ausgemessen und in einer Tabelle aufgeführt. Bei den Kindern mit Saethre-Chotzen-Syndrom zeigte sich, daß die anterior-posteriore Schädelausdehnung (C1, C3 und CF4) signifikant kürzer und „brachyzephaler“ war als bei den Crouzon- und Apert-Syndrom-Patienten. Besonders stellte sich heraus, daß dieser Längenunterschied primär Aufgrund der mangelhaften Ausformung des Os occipitale (CP-OI) und nicht etwa durch die Mittelgesichtshypoplasie bedingt ist. Weiterhin konnte festgestellt werden, daß die anteriore Schädelhöhe (CF1) der Saethre- Chotzen-Patienten durch das „frontal bossing“ signifikant größer ausgeprägt war als bei den Kindern mit Crouzon-Syndrom. Die Crouzon-Syndrom-Patienten waren vor allem durch die fliehende Stirn (CF1) und die verkürzte anteriore Schädelbasis (C1, M-Pts bzw. Pts-CP) charakterisiert. Hier konnte im Vergleich zu den Bolton-Standard-Werten hinsichtlich der Längeneinbuße der S-N-Strecke eine wesentlich genauere Aussage getroffen werden. Die Längeneinbuße liegt im zentralen Anteil der Schädelbasis in der Region um die Sella turcica. Alle untersuchten Apert-Syndrom-Patienten wiesen eine deutliche Turrizephalie auf. Die kraniale Höhe (C2) sowie die kraniofazialen Linien CF1, CF2 und CF3 zeigten eine in Relation zu den übrigen Syndromen signifikant größere Länge. Die Teilstrecke ANS-Na´ der „theoretischen Gesichtshöhe“ CF5 war bei den Kindern mit Apert-Syndrom signifikant verkürzt, übereinstimmend mit der vorliegenden Mittelgesichtshypoplasie. Die Untersuchung der Teilstrecke ANS-Me´ von CF5 ergab eine im Vergleich zu den Saethre-Chotzen- und Crouzon-Syndrom-Patienten längere Strecke. Dies bestätigt das längere Untergesicht und den häufig anterior offenen Biß bei Apert-Patienten. Die kephalometrische Analyse nach Delaire ermöglicht es, mit relativ einfachen Mitteln eine signifikante Aussage hinsichtlich der Unterschiede zwischen den einzelnen syndromalen Kraniosynostosen zu treffen. Dies beinhaltet die Möglichkeit, die folgende Diagnostik zu erleichtern. Das erforderliche laterale Fernröntgenbild wird generell zur eingehenderen Untersuchung erstellt und die spezifischen Strecken der Analyse nach Delaire sind schnell und bei entsprechender Bildqualität, eindeutig zu ermitteln. Die präoperativ spezifisch zuzuordnenden Strecken sind: C1 und insbesondere die Teilstrecke CP-OI, die beim Saethre-Chotzen-Syndrom signifikant kürzer als beim Crouzon- und beim Apert-Syndrom gemessen wurde; C3, die ebenfalls beim Saethre-Chotzen-Syndrom signifikant kürzer ist; CF1, CF2 und CF3, die v.a. beim Apert-Syndrom verlängert auftreten; CF4, die beim Saethre-Chotzen-Syndrom kürzer ist als bei Crouzon; Die präoperative Vermessung der Strecke C1 ergab bei den Saethre-Chotzen-Patienten einen Mittelwert MW von 12,60 cm, bei den Crouzon-Patienten einen Mittelwert MW von 14,90 cm (p=0,0032**), wobei sich für die Teilstrecke CP-OI beim Saethre- Chotzen-Syndrom ein MW von 5,60 cm und beim Crouzon-Syndrom ein MW von 7,30 cm (p=0,0038**) herausstellte. Bei der präoperativen Strecke C3 lag MW für die Saethre-Chotzen-Patienten bei 13,90 cm und für die Crouzon-Patienten bei 16,00 cm (p=0,0016**). Die Strecke CF1 zeigte präoperativ zwischen dem Saethre-Chotzen-Syndrom (mit dem MW von 18,90 cm), und dem Crouzon-Syndrom (mit dem MW von 16,10 cm) einen signifikanten Unterschied (p=0,020*). Auch bei CF4 waren präoperativ signifikante Unterschiede feststellbar. Die Saethre- Chotzen-Patienten wiesen einen MW von 12,40 cm auf, wohingegen die Crouzon- Patienten einen MW von 14,10 cm erreichten (p=0,030*). Die „Architekturelle und Strukturelle Kraniofaziale Analyse“ nach Delaire sollte als eine echte Alternative im Vergleich zur herkömmlichen Kephalometrie gesehen werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen und Messungen bestätigen das, was Delaire 1981 postulierte: „Die architekturelle und strukturelle kraniofaziale Analyse stellt die Balance zwischen Neuro- und Viszerokranium dar und birgt so die Möglichkeit die Schädelbasis und das Schädeldach, und dann auch das Gesicht mit dem gesamten Schädel und der kraniospinalen Artikulation in Relation zu setzen. Unabhängig von statistischen Durchschnitten werden die individuellen Merkmale und Proportionen des Skelettes untersucht. Diese Analyse-Methode ist besonders für den Chirurgen interessant, da sie alle maxillofazialen Deformitäten und pathologischen Balancen die korrigiert werden müssen, klar darstellt. Gerade bei gravierenden kraniofazialen Malformationen bietet sie eine bessere Möglichkeit die verschiedenen kranialen und fazialen Anomalien aufzuzeigen, die gerade diese Situation charakterisieren“ (Delaire et al. 1981).
In dieser retrospektiven Studie werden die Möglichkeiten und die Vor- bzw. Nachteile der palliativen Laserchirurgie bei fortgeschrittenen Tumoren des Hypopharynx, Larynx und der Trachea untersucht. Dabei wird unter anderem besonders auf die Lebensqualität, die Wiederholbarkeit des Eingriffs, die Hospitalitationsdauer und die onkologischen Ergebnisse geachtet.
Das kolorektale Karzinom ist in der westlichen Welt die zweithäufigste Todesursache bei Männer und Frauen. Wichtige Pathomechanismen der kolorektalen Karzinome konnten in den letzten Jahren aufgedeckt werden. Die Anhäufung von genetischen Alterationen spielen sowohl bei sporadischen, als auch bei den hereditären Formen eine wichtige Rolle. Zwei molekulargenetische Hauptwege sind bei der kolorektalen Karzinogenese identifiziert worden: erstens der Tumorsuppressor-Pathway, bei dem es zu Alterationen in Tumorsuppresor- und Onkogenen kommt und zweitens der Mutatior-Pathway, der auf genetischen Alterationen in DNA-mismatch-Reparatur-Genen beruht, die zu einer genetischen Instabilität führen mit einer hohen Mutationsrate in repetitiven DNA-Sequenzen (sog. Mikrosatelliten). Es konnte gezeigt werden, dass oxidativer Stress, der durch die Bildung von H2O2 und anderen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufen wird, zur Entstehung von zellulären und DNA-Schäden wie z.B. oxidative Basenschäden, die ihrerseits u.a. die Entstehung von fixen Punktmutationen, Fragmentation der Desoxiribose und DNA-Strangbrüche initiieren, führen kann. Diese Veränderungen und auch die Mismatch-Reparatur-Defizienz begünstigen die Tumorprogression im Kolon. Es wird geschätzt, dass durch ROS täglich ca.20 000 hits pro Zelle verursacht werden. Es existieren sowohl extrazelluläre, als auch zelluläre antioxidative Abwhrsysteme, die Biomoleküle wie u.a. die DNA vor dem oxidativen Stress schützen. Unter diesen protektiven Enzymen gibt es neben der Superoxidismutase und der Katalase auch zahlreiche Selenoproteine, die Selenocystein in ihrem aktiven Zentrum tragen. Zu diesen Enzymen, die antioxidative Funktionen wahrnehmen gehören u.a. die Glutathionperoxidase, die Thioredoxinreduktase und das Selenoprotein P. Die Glutathionperoxidase-Familie besteht aus der cytosolischen Glutathioperoxidase (cGPx), der plasmatischen Glutathionperoxidase (pGPx), der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) und der Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathionperoxidase (PH-GPx). Diese Enzymfamilie ist an der Reduktion von Hydroperoxiden beteiligt, wobei sie Glutathion als Cofaktor benutzt. Die Thioredoxinreduktase-Familie (TrxR-alpha und Trxr-beta) regeneriert oxidiertes Thioresoxin, das in die DNA-Synthese involviert ist und auch in zelluläre Redox-Regulationssysteme eingreift und Transkriptionsfaktoren beeinflusst. Das Selenoprotein P, das bis zu 10 Seleocysteinreste pro Molekül enthält, baut Peroxinitrit ab, das seinerseits ein starkes Agens bei der Nitrosylation von Biomolekülen ist. Zusätzlich reduziert Selenoprotein P auch Phospholipid-Hydroperoxide, wenn auch weniger effektiv als PH-GPx. Es konnte in Vorarbeiten gezeigt werden, dass Selenoproteine im Gastrointestinaltrakt eine differentielle Expression aufweisen. Kürzlich konnte in unserer Arbeitsgruppe die inverse mRNA-Expression selnocysteinhaltigen Proteine GI-GPx und Selenoprotein P in kolorektalen Adenomen im Vergleich zur Normalmukosa charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine dramatische Abnahme der Selenoprotein P-Expression, während die Expression der GI-GPx signifikant erhöht war. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Expression der GI-GPx in kolorektalen Karzinomen und Kolonkarzinom-Zelllinien, um auf Ebene der Selenoprotein-kodierenden Gene nach Alterationen zu suchen, die die veränderte Expression mit verursachen könnten.
Versuch einer Standardisierung der Exhalationskondensation Die Atemkondensatmessung ist eine ein nichtinvasives Verfahren zur Sammlung von Material aus den unteren Atemwegen, welches in den letzten Jahren immer mehr Beachtung gefunden hat. Mit dieser Methode können nicht flüchtige Subastanzen wie Entzündungsmediatoren, DNA-Sequenzen oder Tumormarker analysiert werden. Die Sammlung von Atemkonsat wird durch ein spezielles konstruiertes Rohr (Eco Screen, Firma Jäger, Würzburg, Deutschland), in dem die exhalierte Luft gefroren wird, möglich. Das Ziel der Studie war herauszufinden, ob sich das Volumen oder die Proteinmenge des Atemkondendats durch die Inhalation von Kochsalz (3 %) steigern läßt und ob sich die gemessenen Werte von Rauchern und Nichtrauchern unterscheiden. Es wurden Kondensatproben von 30 gesunden Probanden über verschiedene Zeiträume (5 bis 15 min) gemessen, im ersten Duchgang ohne, im zweiten Durchgang mit Kochsalzinhalation. Wir fanden eine eine strenge Korrelation der Atemzeit (und dem geatmeten Volumen) mit dem gemessenen Atemkondensatvolumen (r = 0,99, p = 0,0004). Nach der Inhalation von Kochsalz fand sich keine signifikante Steigerung der Kondensatmenge. In einer zweiten Versuchsreihe wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten das Kondensat von 10 Rauchern und 20 Nichtrauchern an 3 aufeinanderfolgenden Tagen bezüglich Volumen und Proteinmenge gemessen. Hier fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern, eine Korrelation zwischen Kondensatvolumen und Proteinmenge fand sich ebenfalls nicht. Die Tag-zu-Tag-Variabilität war nicht signifikant. Wir schlußfolgern, daß das Atemkondensatvolumen von der Atemzeit und dem hierbei geatmeten Luftvolumen abhängt, es ist nicht notwendig vor Beginn der Messung zur Steigerung der Probenmenge Kochsalz zu inhalieren. Rauchen hat keinen Einfluß auf das Kondensatvolumen und die Proteinmenge des Atemkondensats.
Magnetresonanzspektroskopie (MRS) erlaubt die nicht- invasive Untersuchung der Konzentrationen von Stoffwechselprodukten und Ionen im Herzen. Der Gesamtnatrium (Na)-Gehalt könnte für die Untersuchung der Vitalität von Myokardgewebe verwendet werden jedoch gibt es keine Berichte über die Entwicklung des Na-Gehalts während der Narbenentwicklung nach einem Myokardinfarkt (MI) am Modell der Koronarligatur in der Ratte. Ratten wurden einer Ligatur des Ramus interventricularis anterior unterzogen. Myokardgewebe von Kontrolltieren sowie infarziertes Gewebe wurde 1, 3, 7, 28 und 56 Tage postoperativ entnommen und der Na-Gehalt mittels 23Na-MRS und Ionenchromatographie bestimmt. Der Na-Gehalt nach MI war zu allen Zeitpunkten bei beiden Bestimmungsmethoden auf Werte zwischen 306 und 160% des Kontrollwertes erhöht (n= 6-8) je Gruppe, p<0.01 vs. Kontrolle). Der Na-Gehalt ist im chronisch infarzierten Myokardgewebe zu allen Zeitpunkten erhöht. Damit kann überlebendes Myokard von Infarktnarbe anhand des Na-Gehalts unterschieden werden. Diese Information könnte in der 23Na-Magnetresonanzbildgebung (MRI) zur Bestimmung der Infarktnarbe eine klinische Anwendung finden.
In der vorliegenden retrospektiven Studie werden Ergebnisse der Operation nach Keller und Brandes analysiert. 83 (17%) der zwischen 1980 und 1995 operierten Patienten wurden klinisch bzw. mittels Fragebogen, 49 davon klinisch und radiologisch erfaßt. Bei der Auswertung des Gesamtergebnisses nach Kitaoka-Score erreichen die meisten Patienten ein "befriedigendes" Ergebnis. Am schlechtesten schließen die Patienten im Teilbereich "Funktion" ab. Postoperative Schmerzfreiheit und langfristige Beschwerdefreiheit sind wichtige Kriterien für die Zufriedenheit der Patienten. Die Arbeit kommt zu dem Schluß, daß die Operation nach Keller und Brandes im Vergleich zu anderen operativen Verfahren zu schlechteren Ergebnissen führt, und daß die gelenkzerstörende Art dieses Operationsverfahrens heute nicht mehr vertretbar ist.