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Zusammenfassung Im Zuge der Säugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gewährleistet. Während der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, während der adulte Körper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterhält. Als kennzeichnend für die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tatsächlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschränkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine hämatopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Präimplantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich präferentiell in den fötalen hämatopoetischen Geweben befinden. Für humane hämatopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese hämatopoetische Vorläufer in hämatopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chimärer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und hämatopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen lässt sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der frühen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden können. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegenüber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab.
Hinweise auf eine maßgebliche Beteiligung von O2- an Erkrankungen des Gefäßsystems erhärten sich. Angiotensin II und oxidiertes LDL (oxLDL)induzieren eine verstärkte Bildung von O2- in vaskulären Zellen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich in vergleichenden Untersuchungen mit der Detektion möglicher O2--Bildung durch arterielle Gefäßringe, glatte Muskelzellen, Mesangialzellen und Endothelzellen nach Stimulierung durch oxLDL und Angiotensin II. Der in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Lucigenin-Assay mit isolierten Rattenaorten zeigte sowohl in Anwesenheit von Angiotensin II als auch oxLDL eine vertsärkte O2--Freisetzung. Bei simultaner Gabe beider Stimulanzien übertraf die quantitative O2--Freisetzung die Summe derjenigen bei getrennter Donation der Stimulanzien, was entscheidende Hinweise auf der Suche nach möglichen Modellen der bereits bekannten Interaktionen von Angiotensin II und oxLDL gibt. So wurde in der vorliegenden Arbeit eine Interaktion auf der Ebene der Induktion verstäkter O2--Bildung vaskulärer Zellen belegt. Diese Ergebnisse können neue Möglichkeiten der Tharapie zur Prävention der Atherosklerose und Folgeerkrankungen ergeben. Als neben dem Lucigenin-Assay alternative Methodik zur Messung von O2- wurde der Cytochrom C-Assay etabliert. Nach Gabe von oxLDL konnte eine Verstärkung der O2--Bildung durch HUVECs nachgewiesen werden. Somit konnte der Cytochrom C-Assay als Methodik zur Messung von O2- erfolgreich durchgeführt werden. Die Validität des Lucigenin-Assays wird sowohl von der relativen Rate der Produktion von Luc+ als auch von O2- durch biologische Ein-Elektron-Reduktionssysteme bestimmt. Ist die Rate des gebildeten O2- ausreichend hoch und die Rate des gebildeten Luc+ adäquat, spiegelt das im Lucigenin-Assay freigesetzte Licht ausschließlich biologisch freigesetztes O2- wieder. Ist die Rate des gebildeten O2- im Verhältnis zum gebildeten Luc+ zu niedrig, spiegelt das freigesetzte Licht gleichzeitig biologisch freigesetztes O2- und durch Autooxidation Lucigenins gebildetes O2- wieder. Die Rate der Produktion von Luc+ und die von verschiedenen Autoren beschriebene Autooxidation Lucigenins hängt von der Konzentration Lucigenins, dem pH-Wert des Milieus und der Art des Redox-Systems ab. Bei der Durchführung von Lucigenin-Assays sollten daher Versuchsbedingungen geschafft werden., bei denen kein Redox-Kreisprozess Lucigenins stattfindet. Unter dieser Voraussetzung bleibt der Lucigenin-Assay eine verlässlich und sinnvoll durchzuführende Methodik zur Bestimmung der Bildung von O2-. Auch der Cytochrom C-Assay kann zu Fehlinterpretationen über das Ausmaß von in biologischen Systemen gebildetem O2- führen. Bis heute ist nicht verlässlich geklärt, welche Bedeutung die spontane Weiterreaktion von O2- vor der Reduktion von Cytochrom C hat, was zu einer Unterschätzung der quantitativen Bildung von O2- führen kann. Ebenfalls zu einer Unterschätzung der O2--Bildung führen die potentielle Absorption von Cytochrom C an Zellen während des Versuchsablaufs und die mögliche Reoxidation von bereits reduziertem Cytochrom C durch H2O2 und OH-. Dies kann zumindest partiell durch die Gabe von Katalase verhindert werden. Der Cytochrom C-Assay kann somit nur dann als Methode zur Messung von O2- herangezogen werden, wenn er durch SOD hemmbar ist und der den Assay durch Reoxidation von Cytochrom C beeinflussenden Anwesenheit von H2O2 durch Gabe von Katalase begegnet wird.
Einleitung: Die BERAphon® Untersuchung ist ein geeignetes Messverfahren für das universelle Hörscreening bei Neugeborenen. Ziel der vorliegenden Studie war es zu beurteilen, inwiefern die nichtpathologischen Faktoren die Messergebnisse der BERAphon®-Untersuchung beeinflussen. Methode: Der Zeitgangreiz besteht aus jeweils 6, in 5ms Abstand aufeinanderfolgenden Klicks, mit in 10dB Schritten aufsteigender Intensität. [Finkenzeller, 1984]. Im Rahmen eines universellen Hörscreening bei Neugeborenen wurden die Ergebnisse der BERAphon®-Untersuchung an 415 gesunden Neugeborenen analysiert. Gesucht wurde nach möglichen Korrelationen zwischen der Latenz der Welle V, dem Geschlecht, der Schwangerschafts-dauer, dem Alter des Kindes, des Apgar-Score, dem Kopfumfang und des Nabelschnur-pH. Ergebnisse: Die Schwangerschaftsdauer und der Kopfumfang korrelierten signifikant mit der Latenzzeit der Welle V. Im Gegensatz zu vorausgegangenen Studien korrelierte auch der Nabelschnur-pH signifikant mit der absoluten Latenz der Welle V. Keine Korrelation fand sich zwischen der Latenz der Welle V und Faktoren wie Geschlecht, Alter des Kindes und dem Apgar-Score . Schlussfolgerung: Die Latenz der Welle V, gemessen mit dem die BERAphon®, wird nur in sehr geringem Maß von der Schwangerschaftsdauer und dem Kopfumfang beeinflusst. Darüber hinaus kann aus dem Messergebnis im Rahmen des Neugeborenen Hörscreening zusätzlich Information über den Reifungsgrad der Hörbahn gewonnen werden.
Die maligne Hyperthermie ist eine metabolische Muskelerkrankung, die durch eine unkontrollierte Kalzium-Freisetzung in das Zytosol der Muskelzelle zu einer Aktivierung des kontraktilen Apparates und zu einer Beschleunigung des Zellstoffwechsels führen kann. Der in-vitro-Kontraktur-Test am Skelettmuskel ist zur Zeit das einzige zuverlässige Verfahren zur Erkennung einer MH-Veranlagung. In dieser Arbeit sollte untersucht werden inwieweit die lokale Laktatkonzentration durch die Applikation von Kalzium und Koffein mit Hilfe einer Mikrodialysesonde beziehungsweise durch die systemische Infusion von Ryanodin und Dantrolen beeinflusst wird. Mit Tierschutz-Genehmigung wurden 61 Sprague-Dawley Ratten anästhesiert und post exitum über die Aorta die Hinterbeine mit Ringer-, Ryanodin- (0,25 µM, 1 µM) oder Dantrolenlösung (1 µM) perfundiert (30 ml h-1, 19-20oC). Über Mikrodialysesonden (1 µl min-1) in den Mm. adductores wurde Ringer, Sorbitol (80 mM), Kalzium (20 mM, 40 mM, 80 mM) oder Koffein (40 mM, 80 mM) appliziert und im Dialysat Laktat spektrometrisch gemessen. Bei einer relativen recovery von 77 ± 2% für Laktat in-vitro stieg die Laktatkonzentration unter Perfusion mit 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalziumlösung auf 466 ± 31%, 632 ± 48% beziehungsweise 635 ± 81%, während unter Perfusion mit 40 mM und 80 mM Koffein eine relative Zunahme auf 270 ± 21% und 377 ± 21% beobachtet wurde. Unter systemischer Organperfusion mit 0,25 µM und 1 µM Ryanodinlösung und lokaler Applikation von 40 mM Koffein wurden relative Laktatanstiege von 279 ± 23% und 331 ± 19% gemessen. Dagegen stieg die relative Laktatkonzentration bei systemischer Infusion von 1 µM Dantrolenlösung und lokaler Perfusion mit 40 mM Koffein nur bis auf 193 ± 13% an. Diese methodische Untersuchung beweist, dass durch die lokale Perfusion von Kalzium und Koffein sowie die systemische Infusion von Ryanodin ein Anstieg der lokalen Laktatkonzentration induziert, beziehungsweise durch systemische Applikation von Dantrolen dieser Anstieg inhibiert werden kann. Systemische Effekte müssen allerdings im in-vivo Tierversuch ausgeschlossen werden, um die Mikrodialysetechnik für die Entwicklung eines minimal-invasiven Verfahrens zur Diagnostik der malignen Hyperthermie nutzbar machen zu können.
Hochleistungssportler verschiedener Sportarten (Sprinter, Marathonläufer, Radrennfahrer) und Nichtsportler wurden mittels Ergospirometrie miteinander verglichen. Dabei wurde v.a. der Quotient aus maximaler Sauerstoffaufnahme und maximalem Laktatwert genauer betrachtet. Dabei fanden wir Ergebnisse, um die Sportler verschiedener Sportarten voneinander zu unterscheiden.
Die Ultraschallbiomikroskopie ist ein neues diagnostisches Verfahren, das die Abbildung der vorderen Augenabschnitte in mikroskopischer Auflösung in vivo ermöglicht. Erstmals lassen sich Strukturen auch der hinteren Augenkammer darstellen und quantitativ beurteilen, die andere Untersuchungsmethoden bisher nur unzureichend abbilden konnten. In der vorliegenden Arbeit erfolgen die Untersuchungen an 40 Probanden ohne pathologische Augenveränderungen. Um reproduzierbare Meßergebnisse zu erhalten, müssen Einflußgrößen wie die Meßausgangspunkte, die Lichtexposition, der Akkommodationszustand des Patienten, die Position des Schallkopfes und die verwendete Frequenz möglichst konstant gehalten werden. Die Resultate wurden in einer Stichprobe einem Vergleich unterzogen und auf Korrelationen überprüft. Hierbei ließen sich gute Korrelationen hinsichtlich der zentralen Hornhautdicke, der Ziliarkörperbreite und der zentralen Vorderkammertiefe feststellen. Im Vergleich mit anderen, klinisch gebräuchlichen Untersuchungsmethoden wie der Diaphanoskopie und der Messung an der Spaltlampe fand sich eine gute Übereinstimmung. Auch die bereits publizierten Meßergebnisse – sowohl intravital als auch post mortem gewonnen – wurden zum Vergleich herangezogen. Zusätzlich untersuchte man einen Zusammenhang der gewonnenen Meßdaten mit der jeweils biometrisch gemessenen Bulbuslänge und den anamnestisch ermittelten sphärischen Refraktionswerten. Desweiteren ließen sich Messungen an Augenstrukturen durchführen, die bisher nur anhand histologischer Präparate gewonnen werden konnten, wie z.B. die Hornhautepitheldicke und die Irismessungen. Besondere Vorteile hat die Methode bei getrübten Medien, da hier die Spaltlampenuntersuchung nur eingeschränkt brauchbar ist. Diese Vorzüge begründen den Einsatz des UBM zur Diagnostik der vorderen Augenabschnitte und des Kammerwinkels. Den Vorzügen dieser Methode stehen auch Nachteile gegenüber; so ist bei guter Intraobserver-Reproduzierbarkeit eine deutliche Schwäche bezüglich der Interobserver-Reproduzierbarkeit festzustellen, dies ließe sich durch eine exaktere Meßpunktdefinition sicherlich noch verbessern. Dies ist auch erforderlich zur Verlaufsbeurteilung pathologischer Prozesse. Auch der Akkomodationszustand stellt eine Fehlerquelle dar, so daß eine exakt definierte Methodik Voraussetzung für die Validität der gewonnenen Ergebnisse ist. Nicht zuletzt erschweren Kosten und die geringe Verfügbarkeit des UBM die breite klinische Anwendung.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit Mbt, einem hochkonservierten Signalmolekül aus der Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK) aus Drosophila, während der Augen- und Pilzkörperentwicklung. Mbt wird aufgrund von Sequenzhomologien der PAK Unterfamilie II (PAK4-6) zugeordnet. PAK4-6 binden präferentiell die aktivierten Rho-GTPasen Cdc42 und schwächer Rac, werden durch diese Bindung jedoch nicht aktiviert, sondern an bestimmte Zellkompartimente rekrutiert. In Struktur- Funktionsanalysen in vitro und in vivo konnte gezeigt werden, dass Mbt ebenfalls fast ausschließlich mit aktiviertem Cdc42 und kaum mit aktiviertem Rac interagiert. Diese Interaktion führt nicht zur Aktivierung von Mbt, sondern eher zu einer Verringerung der Kinaseaktivität. Eine weitere Funktion der Interaktion von Cdc42 und Mbt ist die Rekrutierung von Mbt an die Adhärenzverbindungen (AV) in sich entwickelnden Photorezeptorzellen. Außerdem kann katalytisch inaktives Mbt im Gegensatz zu Cdc42-bindungsdefizientem Mbt partiell die Mbt-Funktion in mbtP1-Fliegen übernehmen. Mbt hat also auch kinaseunabhängige Funktionen. Während der Pilzkörperentwicklung sind sind die Cdc42-Bindungsdomäne und die Kinasedomäne von Mbt ebenfalls essentiell, ob subzelluläre Lokalisation hier eine ähnlich wichtige Rolle spielt, wurde nicht untersucht. Als Mbt-Interaktionspartner wurden in einem Yeast-two-Hybrid Screen drei neuartige Proteine identifiziert. Zwei davon, CG8818 und CG14880, können als Substrat von Mbt fungieren. Allerdings kann nur für CG8818 eine direkte Bindung spezifisch mit aktiviertem Mbt nachgewiesen werden. Die Interaktion mit CG14880 scheint transient zu sein und nur für die Zeit der Phosphorylierungsreaktion anzudauern. Gegen CG8818 wurde ein Antiserum hergestellt, das nach seiner Charakterisierung in biochemischen und histologischen Ansätzen zum Einsatz kommen soll. In einem genetischen Screen wurden Mutationen in canoe als Verstärker und Mutationen in eip75b als Suppressor des mbtP3-Augenphänotyps gefunden. Eip75B ist ein putativer Steroidhormonrezeptor und wird während der Verpuppung exprimiert, also zu dem Zeitpunkt, wenn sich der mbt-Phänotyp ausbildet. Interessanterweise haben Mutationen in eip75b keinen Effekt auf den mbtP3-Pilzkörperphänotyp. Canoe ist wie Mbt an den AV von sich entwickelnden Photorezeptorzellen lokalisiert und spielt ebenfalls während deren Morphogenese eine Rolle. Canoe ist ein aktinbindendes Protein und könnte eine Verbindung von Mbt zum Cytoskelett darstellen, das der dynamischen Regulation bedarf, um morphogenetische Prozesse voranzutreiben. Eine direkte Interaktion kann nicht nachgewiesen werden. Auch während der Pilzkörperentwicklung scheinen Mbt und Canoe im gleichen Signalweg aktiv zu sein. Genetische Interaktion mit mbtP3 während der Augenentwicklung konnte außerdem für Mutationen in slingshot und twinstar gezeigt werden, die beide in die Regulation des Cytoskeletts involviert sind. Das Transmembranprotein Crumbs scheint ebenfalls zusammen mit Mbt in der Photorezeptorzellmorphogenese eine Rolle zu spielen. Außerdem weißen erste Experimente darauf hin, dass Mbt im ERK-MAP Kinase-Signalweg eine Rolle spielt. Durch die Entdeckung der direkten und indirekten Interaktionspartner bietet sich nun die Gelegenheit, die Funktion und Wirkungsweise von Mbt weiter zu entschlüsseln. Damit kann ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung der Rolle von PAK-Proteinen während morphogenetischer Prozesse und der Regulation der Zellzahl in der Entwicklung geleistet werden.
Zwischenruf aus Patmos
(2002)
Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is a multifunctional cytokine that is engaged in regulating versatile cellular processes that are pivotal for development and homeostasis of most tissues in multicellular organisms. TGF-ß signal transduction is initially propagated by binding of TGF-ß to transmembrane serine/threonine kinase receptors, designated TßRI and TßRII. Upon activation, the receptors phosphorylate Smad proteins which serve as downstream mediators that enter the nucleus and finally trigger transcriptional responses of specific genes. During the past years, it became evident that signaling cascades do not proceed in a linear fashion but rather represent a complex network of numerous pathways that mutually influence each other. Along these lines, members of the TGF-ß superfamily are attributed to synergize with neurotrophins. Together, they mediate neurotrophic effects in different populations of the nervous system, suggesting that an interdependence exists between TGF-ßs on the one hand and neurotrophins on the other. In the present work, the crosstalk of NGF and TGF-ß/Smad signaling pathways is characterized in rat pheochromocytoma cells (PC12) which are frequently used as a model system for neuronal differentiation. PC12 cells were found to be unresponsive to TGF-ß due to limiting levels of TßRII. However, stimulation with NGF results in initiation of Smad-mediated transcription independent of TGF-ß. Binding of NGF to functional TrkA receptors triggers activation of Smad3. This NGF-dependent Smad activation occurs by a mechanism which is different from being induced by TGF-ß receptors in that it provokes a different phosphorylation pattern of R-Smads. Together with an inferior role of TßRI, Smad3 is proposed to serve as a substrate for cellular kinases other than TßRI. Based on the presented involvement of components of both, the MAPK/Erk and the TAK1/MKK6 cascade, signal mediators of these pathways rank as candidates to mediate direct activation of Smad3. Smad3 is subsequently translocated to the nucleus and activates transcription in a Smad4-dependent manner. Negative regulation is provided by Smad7 which was found to act as a potent inhibitor of Smad signaling not only in TGF-ß- but also in NGF-mediated cascades. The potential of NGF to activate the Smad pathway independent of TGF-ß might be of special importance in regulating expression of genes that are essential for the development and function of neuronal cells or of other NGF-sensitive cells, in particular those which are TGF-ß-resistant.
This theses deals with the syntheses and the coordination behaviour of polyimidosulfur anions like S(NR)32–, S(NR)42–, RS(NR)2– or RS(NR)3–, the nitrogen analogues of the well known oxo-anions SO32–, SO42–, RSO2– and RSO3–. The first aim was the synthesis of a triimidosulfite with three different NR-substituents, a so called asymmetrical triimidosulfite. In all reactions, that have been carried out to obtain a triimidosulfite with three (or two) different residues at nitrogen, the final product was always the dilithium sulfide adduct. The syntheses of chiral alkylenediimidosulfites was successful. Similar to Corey’s S-ylides (R2(O)S+––CR2) and Wittig’s phosphonium ylides (R3P+––CR2) these molecules contain a positively charged sulfur atom next to a carbanionic centre. The structures of the alkylenediimidosulfites are not influenced by the different substituents at nitrogen and carbon, respectively. In each case a doublecubic structure is received. The first members of a completely new class of compounds were synthesised: the aryl-bis-(diimidosulfinates). In this compounds two SN2 units are connected via a heteroaromatic linker, containing a potential donor centre in metal coordination. They represent, like the known alkyldiimidosulfinates, dipodal monoanionic ligands. In the field of sulfur (VI) chemistry the syntheses of aryltriimidosulfonates were successful. Hitherto it was believed, that only spatial less demanding lithium organics could be added to a S=N double bond in S(NtBu)3. This assumption was confirmed by the fact that methyl- and phenylacetylene-triimidosulfonate were the only known alkylsulfonates. Nevertheless, the addition of several lithiumheteroarenes to sulfurtriimide worked without difficulties. If the shape of the nucleophile permits to slot in between the NtBu substituents and to approach the electrophilic sulfur in the sulfurtriimide from the side rather than in an orthogonal angle, the addition reaction works smoothly. Although the steric demand of the tris(tert.-butyl)triimidosulfonate unit is very high, the synthesis of thiophene-bis-(triimidosulfonate) worked. The sulfonate moieties function as dipodal ligands.