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Die Entwicklung hochauflösender Fluoreszenzmikroskopiemethoden hat die Lichtmikroskopie revolutioniert. Einerseits ermöglicht die höhere erzielte räumliche Auflösung die Abbildung von Strukturen, die deutlich unterhalb der beugungsbedingten Auflösungsgrenze liegen. Andererseits erhält man durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopiemethoden
wie dSTORM (Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Informationen, welche man für quantitative Analysen heranziehen kann. Aufgrund der sich dadurch bietenden neuen Möglichkeiten, hat sich die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie rasant entwickelt und kommt mittlerweile zur Untersuchung einer Vielzahl biologischer und medizinischer Fragestellungen zum Einsatz. Trotz dieses Erfolgs ist jedoch nicht zu verleugnen, dass auch diese neuen Methoden ihre Nachteile haben. Dazu zählt die Notwendigkeit relativ hoher Laserleistungen, welche Voraussetzung für hohe Auflösung ist und bei lebenden Proben zur Photoschädigung führen kann.
Diese Arbeit widmet sich sowohl dem Thema der Photoschädigung durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie,
als auch der Anwendung von dSTORM und SIM (Structured Illumination Microscopy) zur Untersuchung neurobiologischer Fragestellungen auf Proteinebene.
Zur Ermittlung der Photoschädigung wurden lebende Zellen unter typischen Bedingungen bestrahlt und anschließend für 20−24 h beobachtet. Als quantitatives Maß für den Grad der Photoschädigung wurde der Anteil sterbender Zellen bestimmt. Neben der zu erwartenden Intensitäts- und Wellenlängenabhängigkeit, zeigte sich, dass die Schwere der Photoschädigung auch von vielen weiteren Faktoren abhängt und dass sich Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie bei Berücksichtigung der gewonnenen Erkenntnisse durchaus mit Lebendzellexperimenten vereinbaren lässt.
Ein weiteres Projekt diente der Untersuchung der A- und B-Typ-Glutamatrezeptoren an der neuromuskulären Synapse von Drosophila melanogaster mittels dSTORM. Dabei konnte eine veränderte Anordnung beider Rezeptortypen infolge synaptischer Plastizität beobachtet, sowie eine absolute Quantifizierung des A-Typ-Rezeptors durchgeführt werden.
Im Mittelpunkt eines dritten Projekts standen Cadherin-13 (CDH13) sowie der Glucosetransporter Typ 3 (GluT3), welche beide mit der Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung in Verbindung gebracht werden. CDH13 konnte mittels SIM in serotonergen Neuronen, sowie radiären Gliazellen der dorsalen Raphekerne des embryonalen Mausgehirns nachgewiesen werden. Die Rolle von GluT3 wurde in aus induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierten Neuronen analysiert, welche verschiedene Kopienzahlvariation des für GluT3-codierenden SLC2A3-Gens aufwiesen. Die Proteine GluT3, Bassoon und Homer wurden mittels dSTORM relativ quantifiziert. Während die Deletion des Gens zu einer erwartenden Verminderung von GluT3 auf Proteinebene führte, hatte die Duplikation keinen Effekt auf die GluT3-Menge. Für Bassoon und Homer zeigte sich weder durch die Deletion noch die Duplikation eine signifikante Veränderung.
Ziel dieser Dissertation war es zu einem besseren Verständnis hinsichtlich folgender Themen beizutragen und Möglichkeiten aufzuzeigen, mit welchen die Voraussetzungen für Anwendungen von einzelnen, funktionalisierten Kohlenstoffnanoröhren, wie u.a. Einzelphotonenquellen, erfüllt werden können.
Eine wesentliche Voraussetzung für die Funktionalisierung von einzelnen Kohlenstoffnanoröhren ist zunächst eine Probenpräparation, welche SWNT-Suspensionen mit einem hohen Anteil an vereinzelten SWNTs hoher PL-Intensität bereitstellen kann. Um solche SWNT-Suspensionen herstellen zu können, wurden drei verschiedene Rohmaterialien und Dispergiermittel auf deren Entbündelungseffizienz- und relativer Photolumineszenzquantenausbeute untersucht. Anhand von photolumineszenzspektroskopischen Untersuchungen und Messungen der Extinktion stellte sich heraus, dass in Kombination des unaufbereiteten CVD-Kohlenstoffnanorohrrußes mit dem Copolymer PFO:BPy als Dispergiermittel und einem speziell in dieser Dissertation entwickelten Herstellungsverfahren für die Mikroskopieproben, stabile (6,5)-SWNT-Suspensionen mit einem großen Anteil an einzelnen SWNTs hoher PL-Intensität, hergestellt werden können.
Letztere Suspension diente als Ausgangsmaterial für die, in dieser Dissertation neuartige, entwickelte Methodik zur Differenzierung zwischen einzelnen SWNTs und Aggregaten mittels PL- und Ramanmessungen an einem PL-Mikroskopie-Aufbau, welche eine weitere Voraussetzung für Einzelpartikelstudien darstellt. Hierbei wurden im Rahmen einer statistischen Messreihe PL- und Ramanspektren von 150 SWNT-Objekten aufgenommen und hieraus resultierend die Parameter FWHM, Energie des S1-Emissions-Zustands und relative Photolumineszenzquantenausbeute ermittelt. Schließlich konnten die zwischen einer einzelnen SWNT und einem Aggregat charakteristischen Differenzen anhand der Korrelationen zwischen den drei Parametern dargestellt werden. Zudem erfolgte eine statistische Analyse zur Bestimmung der statistischen Signifikanz dieser Korrelationen. Hierbei wurde anhand der nicht-parametrischen Spearman-Korrelationskoeffizienten und der p-Werte gezeigt, dass in Kombination dieser drei Messparameter mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zwischen einer einzelnen SWNT und einem Aggregat differenziert werden kann. Demnach konnte eine neuartige, im Vergleich zur Literatur, praktikable Methodik zur Differenzierung zwischen einzelnen SWNTs und Aggregaten, etabliert werden, welche die Voraussetzung für Einzelrohrstudien ist.
Der Fokus dieser Dissertation ist die Entschlüsselung der Reaktionsmechanismen der Arylierung und reduktiven Alkylierung von (6,5)-SWNTs im Ensemble und auf Einzelrohrbasis. Durch diese kovalenten Funktionalisierungsverfahren entstehen neue fluoreszierende Defekt-Zustände, deren zeitabhängiges Intensitätsverhalten in der vorliegenden Arbeit näher untersucht wurde. Hinsichtlich der Arylierung von SWNTs mit Diazoniumsalzen postulieren Studien einen zweistufigen Reaktionsmechanismus, welcher durch eine kombinatorische, spektroskopische Gesamtbetrachtung im Rahmen dieser Dissertation bestätigt werden konnte. Auch konnte erstmalig in der Literatur gezeigt werden, dass die Reaktion in hohem Maße reproduzierbar ist.
Reproduzierbarkeitsstudien wurden auch im Falle der reduktiven Alkylierung unternommen, wobei erstmalig festgestellt wurde, dass diese Reaktion lediglich im hohen Maße reproduzierbar ist, sofern die Reduktionslösung mindestens 17 Stunden vor Reaktionsstart angesetzt wird. Basierend auf diesem Resultat, wurden reproduzierbare Messreihen zur Untersuchung der Reaktionsbedingungen und des Reaktionsmechanismus unternommen, da diesbezüglich unzureichend Kenntnis in der Literatur vorhanden ist.
Zur Klärung des Reaktionsmechanismus, von welchem lediglich Annahmen existieren, wurde zum einen der Einfluss der Laseranregung auf die Reaktion untersucht. Da lediglich für den Falle des Ansetzens der Reduktionslösung unmittelbar vor Messbeginn, wobei die reaktiven SO2- -Radikale erzeugt werden, ein Einfluss der Laseranregung festgestellt werden konnte, nicht jedoch im weiteren Reaktionsverlauf, ist von keiner radikalischen Reaktion im Funktionalisierungsschritt auszugehen. Dies konnte durch den Einsatz von Konstitutionsisomeren des Iodbutans bestätigt werden, wobei das Iodbutanisomer, welches im Fall einer radikalischen Reaktion die höchste Reaktivität zeigen sollte, zu keiner Funktionalisierung der SWNTs führte. Im Gegensatz hierzu, konnte durch das 1-Iodbutan, mit dem primären C-Atom, eine hohe PL-Intensität der defekt-induzierten Zustände E11- und T- verzeichnet werden, was die weitere Annahme einer SN2-Reaktion stützt.
Im Rahmen dieser Dissertation konnte zudem erstmalig entdeckt werden, dass unter deren alkalischen, reduktiven Bedingungen, eine Funktionalisierung mit Acetonitril erfolgen kann, was durch die Durchstimmung der PL-Intensität des Defektzustands bei Variation des Volumenanteils von Acetonitril bestätigt werden konnte. Hierbei gilt es jedoch weiter zu analysieren, auf welche Art die Koordination bzw. Funktionalisierung von Acetonitril an den SWNTs erfolgt, was u.a. durch Ramanmessungen untersucht werden könnte.
Auch konnten neuartige Kenntnisse bezüglich der Reaktionskinetik basierend auf den Studien dieser Dissertation erhalten werden, wobei festgestellt wurde, dass das Reaktionsprofil mit dem einer komplexen Folgereaktion angenähert werden kann.
Zudem konnten neuartige Kenntnisse aus der Thermodynamik, wie die Ermittlung der Aktivierungsenergie der Adsorption von DOC-Molekülen auf der SWNT-Oberfläche, durch die Zugabe des Tensids DOC zum Reaktionsansatz und dem hieraus resultierenden Reaktionsabbruch, erhalten werden.
Schließlich fand eine Übertragung der Ergebnisse aus den Ensemblestudien der reduktiven Alkylierung auf Einzelpartikeluntersuchungen statt, wobei letztere erstmalig im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden. Aus der statistischen Analyse, welche von Martina Wederhake durchgeführt wurde, resultierte durch Erhöhung des Stoffmengenverhältnisses von 1-Iodbutan zu Kohlenstoff eine inhomogene Steigerung des Funktionalisierungsgrades. Ausblickend gilt es nun zu prüfen, ob die zeitlichen Reaktionsverläufe der photolumineszierenden Zustände, welche aus den Ensemble-Studien erhalten wurden, auf Einzelrohrbasis reproduziert werden können.
Es lässt sich demnach festhalten, dass mithilfe der Studien dieser Dissertation ein Probenherstellungsverfahren, welches stabile SWNT-Suspensionen mit einem großen Anteil an einzelnen Kohlenstoffnanoröhren, hoher PL-Intensität ermöglicht, etabliert werden konnte. Zudem wurde eine neuartige, praktikable und statistisch signifikante Methodik zur Differenzierung zwischen einzelnen Kohlenstoffnanoröhren und Aggregaten entwickelt. Schließlich konnten neue, essentielle Informationen bezüglich des Reaktionsmechanismus und den Reaktionsbedingungen der Arylierung und reduktiven Alkylierung von halbleitenden (6,5)-SWNTs erhalten werden. Wie in der Einleitung bereits erwähnt, sind sowohl der Erhalt einer stabilen SWNT-Suspension mit einem großen Anteil an einzelnen Nanoröhren hoher PL-Intensität, die Möglichkeit der Identifizierung einzelner SWNTs, als auch ein ausgiebiges Verständnis der Reaktionsmechanismen der Funktionalisierungsreaktionen, essentielle Voraussetzungen für die Verwirklichung von Einzelphotonenquellen auf Basis einzelner, funktionalisierter Kohlenstoffnanoröhren. Diese können aufgrund derer geeigneter Emissionseigenschaften als vielversprechende Kandidaten für das Ausgangsmaterial von Einzelphotonenquellen in der Quanteninformationstechnologie angesehen werden.
Single molecule localization microscopy has seen a remarkable growth since its first
experimental implementations about a decade ago. Despite its technical challenges,
it is already widely used in medicine and biology and is valued as a unique tool
to gain molecular information with high specificity. However, common illumination techniques do not allow the use of single molecule sensitive super-resolution
microscopy techniques such as direct stochastic optical reconstruction microscopy
(dSTORM) for whole cell imaging. In addition, they can potentially alter the
quantitative information.
In this thesis, I combine dSTORM imaging in three dimensions with lattice lightsheet illumination to gain quantitative molecular information from cells unperturbed by the illumination and cover slip effects. Lattice light-sheet illumination
uses optical lattices for beam shaping to restrict the illumination to the detectable
volume. I describe the theoretical background needed for both techniques and detail
the experimental realization of the system as well as the software that I developed
to efficiently evaluate the data.
Eventually, I will present key datasets that demonstrate the capabilities of the
developed microscope system with and without dSTORM. My main goal here was
to use these techniques for imaging the neural cell adhesion molecule (NCAM, also
known as CD56) in whole cells. NCAM is a plasma membrane receptor known to
play a key role in biological processes such as memory and learning. Combining
dSTORM and lattice light-sheet illumination enables the collection of quantitative
data of the distribution of molecules across the whole plasma membrane, and shows
an accumulation of NCAM at cell-cell interfaces. The low phototoxicity of lattice
light-sheet illumination further allows for tracking individual NCAM dimers in living cells, showing a significant dependence of its mobility on the actin skeleton of
the cell.
The molecular chaperone Hsp90 facilitates the folding and activation of a wide array of structurally and functionally diverse client proteins. Hsp90 presents a central node of protein homeostasis and is frequently involved in the development of many human diseases. Although Hsp90 is a promising target for disease treatment, the mechanism by which Hsp90 facilitates client recognition and maturation is poorly understood.
The shape of the homodimeric protein resembles a molecular clamp that opens and closes in response to binding and hydrolysis of ATP. Structural studies reveal a network of distinct local conformational rearrangements that coordinate the slow transition into the hydrolysis-active, closed state configuration (time order of minutes). However, the kinetics of local conformational changes remain elusive because spectroscopic tools that can detect them have been missing so far.
Fluorescence quenching of extrinsic fluorophores by the natural amino acid Tryptophan is based on a photoinduced electron transfer (PET) reaction, which requires sub-nanometer contact between fluorophore and Tryptophan. This quenching mechanism has been developed into a 1-nm spectroscopic tool for the detection of rapid protein folding dynamics. Within the scope of this doctoral thesis, PET-reporter systems were designed to investigate the kinetics of local conformational motions that are part of the mechanistic core of the Hsp90 chaperone cycle. ATP-triggered kinetics of closure of the ATP-lid as well as swapping of the N-terminal ß-strand across subunits and association of the N-terminal and middle-domain were estimated in solution. Bulk experiments revealed that local motions occur on similar timescales and are in good agreement with the ATP-hydrolysis rate. Functional mutations demonstrated that local motions act cooperatively. Furthermore, the lid was shown to close via a two-step process consisting of a rapid lid-reconfiguration in direct response to ATP-binding, followed by slow closure of the lid. The co-chaperone Aha1 seems to act early in the chaperone cycle by remodelling of the lid and by stabilization of apo Hsp90 in a NM-domain pre-associated conformation.
A two-colour single-molecule PET microscopy method was developed to observe local motions at remote positions simultaneously and in real-time. Thus, directionality within the network of local conformational changes could be revealed. In a first attempt, the feasibility of detecting PET-complexes on the single-molecule surface was tested on Hsp90 constructs that report on only one motion (one-colour single-molecule PET microscopy). PET-quenched complexes could be distinguished from photobleached fluorophores through oxidation by molecular oxygen, resulting in fluorescence recovery. In two-colour experiments, a dimmed state was identified for PET-quenched complexes, but not for all of the used PET-reporter systems. Results suggest that local motions occur simultaneously within the time-resolution of the experiment (0.3 sec). Furthermore, bi-exponential kinetics of transition into the closed clamp configuration indicate a more complex mechanism of clamp-closure than of clamp-opening, which could be well described by a mono-exponential function.
Sharpening super-resolution by single molecule localization microscopy in front of a tuned mirror
(2020)
The „Resolution Revolution" in fluorescence microscopy over the last decade has given rise to a variety of techniques that allow imaging beyond the diffraction limit with a resolution power down into the nanometer range. With this, the field of so-called super-resolution microscopy was born. It allows to visualize cellular architecture at a molecular level and thereby achieve a resolution level that had been previously only accessible by electron microscopy approaches.
One of these promising techniques is single molecule localization microscopy (SMLM) in its most varied forms such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) which are based on the temporal separation of the emission of individual fluorophores. Localization analysis of the subsequently taken images of single emitters eventually allows to reconstruct an image containing super-resolution information down to typically 20 nm in a cellular setting. The key point here is the localization precision, which mainly depends on the image contrast generated the by the individual fluorophore’s emission. Thus, measures to enhance the signal intensity or reduce the signal background allow to increase the image resolution achieved by dSTORM. In my thesis, this is achieved by simply adding a reflective metal-dielectric nano-coating to the microscopy coverslip that serves as a tunable nano-mirror.
I have demonstrated that such metal-dielectric coatings provide higher photon yield at lower background and thus substantially improve SMLM performance by a significantly increased localization precision, and thus ultimately higher image resolution. The strength of this approach is that ─ except for the coated cover glass ─ no specialized setup is required. The biocompatible metal-dielectric nano-coatings are fabricated directly on microscopy coverslips and have a simple three-ply design permitting straightforward implementation into a conventional fluorescence microscope. The introduced improved lateral resolution with such mirror-enhanced STORM (meSTORM) not only allows to exceed Widefield and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM performance, but also offers the possibility to measure in a simplified setup as it does not require a special TIRF objective lens.
The resolution improvement achieved with meSTORM is both spectrally and spatially tunable and thus allows for dual-color approaches on the one hand, and selectively highlighting region above the cover glass on the other hand, as demonstrated here.
Beyond lateral resolution enhancement, the clear-cut profile of the highlighted region provides additional access to the axial dimension. As shown in my thesis, this allows for example to assess the three-dimensional architecture of the intracellular microtubule network by translating the local localization uncertainty to a relative axial position. Even beyond meSTORM, a wide range of membrane or surface imaging applications may benefit from the selective highlighting and fluorescence enhancing provided by the metal-dielectric nano-coatings. This includes for example, among others, live-cell Fluorescence Correlation Spectroscopy and Fluorescence Resonance Energy Transfer studies as recently demonstrated.
Over the last decade life sciences have made an enormous leap forward. The development of complex analytical instruments, in particular in fluorescence microscopy, has played a decisive role in this. Scientist can now rely on a wide range of imaging techniques that offer different advantages in terms of optical resolution, recording speed or living cell compatibility. With the help of these modern microscopy techniques, multi-protein complexes can be resolved, membrane receptors can be counted, cellular pathways analysed or the internalisation of receptors can be tracked. However, there is currently no universal technique for comprehensive experiment execution that includes dynamic process capture and super resolution imaging on the same target object. In this work, I built a microscope that combines two complementary imaging techniques and enables correlative experiments in living and fixed cells. With an image scanning based laser spot confocal microscope, fast dynamics in several colors with low photodamage of the cells can be recorded. This novel system also has an improved resolution of 170 nm and was thoroughly characterized in this work. The complementary technique is based on single molecule localization microscopy, which can achieve a structural resolution down to 20-30 nm. Furthermore I implemented a microfluidic pump that allows direct interaction with the sample placed on the microscope. Numerous processes such as living cell staining, living cell fixation, immunostaining and buffer exchange can be observed and performed directly on the same cell. Thus, dynamic processes of a cell can be frozen and the structures of interest can be stained and analysed with high-resolution microscopy. Furthermore, I have equipped the detection path of the single molecule technique with an adaptive optical element. With the help of a deformable mirror, imaging functions can be shaped and information on the 3D position of the individual molecules can be extracted.