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Institute
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- Fraunhofer Institute for Integrierte Schaltungen (IIS) (1)
- Hans-Knöll-Institut Jena (1)
- IZKF Research Laboratory Dept. Medicine II & Pediatrics (1)
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- Lehrstuhl für Physiologische Chemie (1)
- Microarray Core Unit, Universität Würzburg (1)
- Orthopädische Klinik König-Ludwig-Haus Würzburg (1)
- Translationale soziale Neurowissenschaften (1)
ß-Arrestin/Rezeptor-Interaktionen - Ein endogenes "Werkzeug" ligandenspezifischer Signaltransduktion
(2010)
Die Bedeutung der β-Arrestine als multifunktionelle Adapterproteine GPCR-vermittelter Signaltransduktion hat in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. In der vorliegenden Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der molekularen Basis und der Ligandenabhängigkeit sowohl der β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion als auch β-Arrestin- (un-)abhängiger Signaltransduktionsmechanismen. Im ersten Teil wurde der Einfluß potentieller Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des β2AR bzw. im C-Terminus und der TM3 des P2Y1R auf die agonisteninduzierte β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, Internalisierung und Desensibilisierung untersucht. Durch Mutationsanalysen konnten Ser 352/Thr 358 im distalen C-Terminus des P2Y1R als Schlüsselstellen der β-Arrestin-Translokation und Internalisierung identifiziert werden, während ein oder mehrere Phosphorylierungsstellen im proximalen P2Y1R C-Terminus die molekulare Grundlage der Rezeptordesensibilisierung darstellen. Darüber hinaus machte die Anwendung verschiedener PKC- oder CaMK-Inhibitoren sowie der Einsatz des PKC-Aktivators PMA deutlich, dass die P2Y1R-Desensibilisierung und β-Arrestin-Translokation durch unterschiedliche Kinasen kontrolliert werden. Zudem konnte mit Hilfe der FRET-Technik gezeigt werden, dass die Phosphorylierungsstellen zwischen den Positionen 355 und 364 im proximalen β2AR C-Terminus essentielle Bereiche der β-Arrestin-Translokation darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Agonisten am β2-adrenergen Rezeptor bzw. dem P2Y2R auf ihre Fähigkeit hin untersucht verschiedene mit dem jeweiligen Rezeptor verknüpfte G-Protein- bzw. β-Arrestin-Funktionen in unterschiedlichem Ausmaß zu aktivieren („biased agonism“). Da eine solche ligandenselektive Aktivierung rezeptorvermittelter Signalwege bis dato nur mit synthetischen Liganden detailliert untersucht wurde, galt das besondere Interesse der Analyse der durch die endogenen Substanzen induzierten Signalmuster. Die Betrachtung der Noradrenalin- bzw. Adrenalin-induzierten β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, β-Arrestin2-Translokation, Rezeptorinternalisierung, G-Protein-Aktivierung sowie cAMP-Produktion am β2AR machte deutlich, dass es sich beim Phänomen des „biased agonism“ um einen endogenen Mechanismus handelt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch zur Tokolyse eingesetzte β2AR-Agonisten spezifische Signalmuster induzieren. Die Beobachtung, dass UTP und ATP sowohl unterschiedliche β-Arrestin1/2-Translokationsals auch ERK-Aktivierungsmuster am P2Y2R induzieren bestärkte das Konzept des „biased agonism“ als endogenes Phänomen. Das ligandenabhängige β-Arrestin-Translokationsverhalten des P2Y2R ließ zudem die agonistenbedingte Zuteilung des Rezeptors zu den „Klasse A“ oder „Klasse B“ Rezeptoren zu. Die detaillierte Untersuchung agonisteninduzierter Rezeptor/Effektor-Interaktionen und Signalmuster dürfte helfen die Anwendung klinisch relevanter Substanzen zu optimieren.
Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekundären Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erhöht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-überexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Domäne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten übereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem stärker ausgeprägt war als bei der ANP-abhängigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivität und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivität des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle trägt zum Verständnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zusätzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen möglich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben können.
Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden.
Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener β-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne β-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes.
Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden.