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- D-1221-2009 (1)
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Insects living in temperate latitudes need to adjust their life-history to a seasonally variable environment. Reproduction, growth, and development have to be completed within the limited period where environmental conditions are favourable while climatically adverse conditions have to be spent in a state of diapause. Consequently, questions how individuals adapt their life-history to seasonality and which mechanisms underlie the responses to seasonal cues, like photoperiod, are important issues in the study of life-history strategies. This thesis focuses on the life-history adaptation to seasonality in the wing-dimorphic common pond skater Gerris lacustris L. (Heteroptera: Gerridae). Using a combination of field and laboratory studies as well as mathematical modelling, it is adressed how variation in the availability of thermal energy impacts on various aspects of larval development such as accumulated thermal energy (i.e. physiological development time), developmental pathway (direct reproduction vs. diapause) and wing dimorphism.
In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine….
In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo.
Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung und eine erhöhte Prädisposition gegenüber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Das Fehlen von Nibrin führt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erklärt die verschiedenen klinischen und zellulären Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. Für die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen Fällen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich höher sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erhöhten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß für Strahlensensitivität, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erhöht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 Fällen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese für beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 Fällen ergab sich ein positives Ergebnis mit erhöhtem Anteil nichtproliferierender Zellen und erhöhter Strahlensensitivität. Unter den positiven Fällen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse bestätigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erhöhter Strahlensensitivität keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erhöhten Strahlensensitivität eindeutig nachweisen kann. Eine erhöhte Strahlensensitivität ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivität bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifität des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl für die Primärdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein.
Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln.
Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab.
This work was aimed at experimentally studying whether climatic variables act as environmental cues for workers’ building behaviour in leaf-cutting ants of the genus Acromyrmex, and to what extent building responses account for the maintenance of nest climate in a proper range for the inhabiting colony. Specifically, this work presents independent analysis in different Acromyrmex species with disparate ecology and nesting habits, aimed at understanding to what extent: i) temperature and humidity act as cues for workers’ building behaviour, ii) inter- and intraspecific differences in the nesting habits observed in South American Acromyrmex are based on distinct building behaviours and on the variation in regional climate across continent, iii) differences in nest architecture account for the maintenance of nest climate in a proper range for colony members and, iv) climatic variables trigger building responses aimed at controlling short-term changes in nest climate. It is first experimentally shown that soil temperature acts as a cue for workers’ digging behaviour. Acromyrmex lundi workers were observed to respond to both soil temperature as well as its changes, and to decide accordingly where to start or whether to stop digging. The soil temperature range preferred by workers to dig, between 20°C and maximally 30.6°C, matches the range at which colony growth is expected to be maximized. Temperature-sensitive digging might therefore lead to the establishment of the fungus chambers in soil layers with a proper range of temperatures for colony growth. Based on that, it was hypothesized that nest depth in Acromyrmex largely depends on the depth at which this temperature range is located across the soil profile, i.e., the higher the temperature in the superficial soil layers, the deeper the nest location, since soil temperature decreases with increasing depth. A bibliographic survey on nesting habits of 21 South American Acromyrmex species confirmed that the warmer the soil temperature at 50 cm depth throughout the South American continent, the higher the number of species presenting subterranean nests, compared with those inhabiting superficial nests. Temperature-sensitive digging in Acromyrmex would therefore explain the geographical distribution of nesting habits observed for this genus in the South American continent, i.e., subterranean in the northern tropical regions, and superficial in the southern temperate ones. In addition, results showed that Acromyrmex colonies from temperate regions indeed achieve thermoregulatory benefits through the determination of nest depth based on thermoregulatory needs. In sympatrically-occurring colonies of the grass-cutting ant A. heyeri, temperature inside superficial thatched nests was higher, and more suitable for colony growth, than that inside subterranean nests. This temperature surplus was even higher in spring, at the time of production of sexual brood, than in winter or summer. It was demonstrated that such temperature surplus was brought about by the low thermal diffusivity of the nest thatch, which prevents diurnal nest overheating by the incoming solar radiation, and avoids losses of the accumulated daily heat into the cold air during night, thus leading to high average nest temperatures. Although highly advantageous for colonies in terms of nest temperature, the determination of nest depth based on thermoregulatory needs may differentially affect nest ventilation and humidity depending on how nest exposition influences the exchange of nest air with the outside air. For instance, colonies with a superficial nesting habit might benefit from improved nest ventilation, but be at risk of desiccation due to their exposition and the consequent humidity losses into the dry outside air. Results demonstrated that in two Acromyrmex species, short-term regulatory building responses triggered and spatially organized by climatic variables occur, and may counteract undesired changes in internal nest humidity. Workers of the thatching grass-cutting ant A. heyeri, for instance, closed a number of nest-thatch openings as a response to desiccation of the outside air, even at a nest temperature that otherwise triggered the response of opening them so as to reduce nest temperature. In the leaf-cutting ant A. ambiguus, the direction of the airflow inside nest tunnels was shown to act as a cue for spatially guiding the building behaviour of plugging nest entrances. However, workers only responded if the humidity content of the circulating air was low, trading therefore nest ventilation for humidity maintenance.
Background: The frequency of the most observed cancer, Non Hodgkin Lymphoma (NHL), is further rising. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common of the NHLs. There are two subgroups of DLBCL with different gene expression patterns: ABC (“Activated B-like DLBCL”) and GCB (“Germinal Center B-like DLBCL”). Without therapy the patients often die within a few months, the ABC type exhibits the more aggressive behaviour. A further B-cell lymphoma is the Mantle cell lymphoma (MCL). It is rare and shows very poor prognosis. There is no cure yet. Methods: In this project these B-cell lymphomas were examined with methods from bioinformatics, to find new characteristics or undiscovered events on the molecular level. This would improve understanding and therapy of lymphomas. For this purpose we used survival, gene expression and comparative genomic hybridization (CGH) data. In some clinical studies, you get large data sets, from which one can reveal yet unknown trends. Results (MCL): The published proliferation signature correlates directly with survival. Exploratory analyses of gene expression and CGH data of MCL samples (n=71) revealed a valid grouping according to the median of the proliferation signature values. The second axis of correspondence analysis distinguishes between good and bad prognosis. Statistical testing (moderate t-test, Wilcoxon rank-sum test) showed differences in the cell cycle and delivered a network of kinases, which are responsible for the difference between good and bad prognosis. A set of seven genes (CENPE, CDC20, HPRT1, CDC2, BIRC5, ASPM, IGF2BP3) predicted, similarly well, survival patterns as proliferation signature with 20 genes. Furthermore, some bands could be associated with prognosis in the explorative analysis (chromosome 9: 9p24, 9p23, 9p22, 9p21, 9q33 and 9q34). Results (DLBCL): New normalization of gene expression data of DLBCL patients revealed better separation of risk groups by the 2002 published signature based predictor. We could achieve, similarly well, a separation with six genes. Exploratory analysis of gene expression data could confirm the subgroups ABC and GCB. We recognized a clear difference in early and late cell cycle stages of cell cycle genes, which can separate ABC and GCB. Classical lymphoma and best separating genes form a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups. Together with gene sets which identify ABC and GCB we get a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups (ASB13, BCL2, BCL6, BCL7A, CCND2, COL3A1, CTGF, FN1, FOXP1, IGHM, IRF4, LMO2, LRMP, MAPK10, MME, MYBL1, NEIL1 and SH3BP5; Altogether these findings are useful for diagnosis, prognosis and therapy (cytostatic drugs).
Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex.
1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.