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Das Fettgewebshormon Leptin hemmt in Beta-Zellen des endokrinen Pankreas die Insulinbiosynthese und –sekretion. Insulin dagegen als adipogenes Hormon fördert die Leptinproduktion, so dass ein Regelkreis, die so genannte “Adipoinsuläre Achse“ entsteht. Fehlregulationen dieser Achse werden vor allem bei übergewichtigen Menschen mit einer Hyperleptinämie im Rahmen der Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 diskutiert. Die genauen molekularen Mechanismen über die die transkriptionellen Effekte von Leptin auf die Proinsulingen Expression erfolgen sind bis dato nicht ausreichend verstanden. Die Signalübertragung von Leptin erfolgt über den JAK-STAT-Signalübertragungsweg. Dieser Signalübertragungsweg kann durch Moleküle aus der Familie der Suppressors of Cytokine Signalling (SOCS) gehemmt werden. Ziel dieser Arbeit war die Leptin vermittelte Signaltransduktion in Beta-Zellen des endokrinen Pankreas sowie die Insulingen Expression näher zu charakterisieren. Stimulation mit Leptin führt zu einer JAK2 abhängigen Phosphorylierung und zeitabhängigen nukleären Translokation von STAT3 und STAT5b in INS-1 Zellen. Sowohl STAT3 als auch STAT5b aktivieren den Proinsulingen Promotor in INS-1 Zellen. Für STAT5b konnte in INS-1 Zellen gezeigt werden, dass diese Aktivierung durch Interaktion mit PDX-1, dem zentralen Regulator der -Zelldifferenzierung und –funktion, und Koaktivator CBP/p300 erfolgt. Diese synergistische Aktivierung ist abhängig von der PDX-1 Bindungsstelle, dem A3/A4 Element im Ratten-Insulingenpromotor 1. Weiterhin konnte in INS-1 Zellen in vitro gezeigt werden, dass Leptin die mRNA Expression von SOCS3 induziert. Eine Aktivierung des Ratten SOCS3 Promotors konnte sowohl durch Leptin, als auch durch STAT3 und STAT5b nachgewiesen werden. Diese Aktivierung erfolgt über spezifische Bindung von STAT3 und STAT5b an bekannte STAT-Bindungsstellen im SOCS3 Promotor, was durch EMSAs mit Kernextrakten von INS-1 Zellen demonstriert werden konnte. SOCS3 wiederum hemmt sowohl die basale als auch die STAT3 und STAT5b vermittelte Aktivierung des Ratten-Insulinpromotors 1 in INS-1 Zellen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass SOCS3 ein Leptin induzierter Inhibitor der Proinsulingen Expression in pankreatischen Beta-Zellen ist, im Sinne einer negativen Rückkoppelung. SOCS3 ist somit ein direkter Vermittler der Leptin Signalübertragung distal von JAK-STAT in Beta-Zellen des endokrinen Pankreas.
1) Der Melanocortin - Rezeptor Typ 4 (im Hypothalamus) ist Bestandteil des Regulationskreislaufes der Nahrungsaufnahme. Ein Kollektiv von Patienten mit extremer Adipositas wurde auf Mutationen im Gen des Rezeptors hin untersucht. Neben bekannten Polymorphismen fand sich eine bisher noch nicht beschriebene Mutation (V166I). 2) PPARg ist ein nukleärer Transkriptionsfaktor, der unter anderem die Genexpression im Rahmen der Adipozytendifferenzierung und Nährstoffspeicherung reguliert. In einem Kollektiv von Patienten mit extremer Adipositas wurde die Häufigkeit eines bekannten Polymorphismus (Pro12 Ala) im Gen des Rezeptors untersucht sowie Adipositasgrad, Erfolg einer Magenbandimplantation, Hypertonieprävalenz und Parameter des Glukose- und Lipidhaushaltes zwischen den Genotypen verglichen. Ein signifikanter Zusammenhang von Genotyp und den genannten Parametern fand sich nicht.
Leptin reguliert die Sättigungszentren in den Kerngebieten des Hypothalamus. Zusätzlich hemmt es die Insulinsekretion der Beta-Zelle des endokrinen Pankreas. Umgekehrt fördert Insulin die Leptinsekretion des Fettgewebes. Dieser Regelkreis wird als adipoinsuläre Achse beschrieben. Fehlregulationen dieses Regelkreises werden bei übergewichtigen Patienten mit Leptinresistenz als Mechanismus bei der Ausbildung eines Diabetes mellitus Typ 2 diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Leptin auf die Beta-Zelle des endokrinen Pankreas untersucht. Ziel dieser Arbeit war die Identifikation neuer Leptin regulierter Gene. Dafür wurde unter anderem die Insulinom-Zelllinie INS-1 verwandt. In den vorliegenden Untersuchungen hemmte Leptin die mRNA-Expression von Insulin und dem Transkriptionsfaktor NeuoD1 in INS-1 Zellen. Darüber hinaus hemmte Leptin die mRNA- und Proteinexpression von Secretogranin II (Scg II) in INS-1 Zellen. Scg II wurde mit immunzytochemischen Färbungen in den Vesikeln von INS-1 Zellen nachgewiesen. Leptin hemmte des Weiteren die mRNA- und Proteinexpression sowie die Enzymaktivität der katalytischen Untereinheit der Protein Phosphatase 1 alpha (PP-1alpha) in INS-1 Zellen. In humanen Pankreasinseln wurde eine Kolokalisation von PP-1alpha und Insulin nachgewiesen. Eine Hemmung von PP-1alpha durch Calyculin A (Cal A) führte zu einer Reduktion der Insulinsekretion von INS-1 Zellen und humanen Pankreasinseln, sowie zu einer Reduktion des Kalzium-Influxes in INS-1 Beta-Zellen. Anhand dieser Ergebnisse könnte die hemmende Wirkung von Leptin auf die Insulinsekretion durch eine Regulation von PP-1alpha erklärt werden. Dabei führt die Inhibition von PP-1alpha zu einer Hemmung der Kalzium Kanäle, die wiederum eine Reduktion der Insulinsekretion bewirkt. In dieser Arbeit wurden neue Leptin regulierte Gene in INS-1 Beta-Zellen identifiziert und charakterisiert. Diese Ergebnisse zeigen neue Einblicke in die Regulation der Insulinsekretion. Darüber hinaus ergeben sich für die Zukunft mögliche Ansatzpunkte bei der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2.
Traditioneller Parameter zur Festlegung der Herzfrequenzen für die verschiedenen Trainingsbereiche in Ausdauersportarten ist die Laktatkonzentration des Athleten in einem Stufenleistungstest. Nur wenige Autoren beschreiben bisher das Verhalten physiologischer Parameter während längerer Belastung. Daher untersuchten wir über eine Dauer von 100 Minuten sowohl metabolische als auch spirometrische Daten von 18 Probanden (13 "gut-trainierte" Radrennfahrer und 5 "trainierte" Tourenfahrer) auf einem Radergometer (Vita-maxima-Stufenleistungstest (Test 1) zur Festlegung der Intensitäten, Test 2 bei konstanter Herzfrequenz-, Test 3 bei konstanter Leistungsvorgabe). Die individuellen Vorgaben für die beiden 100-minütigen Tests wurden ausgehend von einer Laktatkonzentration von 3,0 mmol/l im Stufenleistungstest festgelegt, der nach dem Protokoll des Bundes Deutscher Radfahrer (BDR, Beginn mit 100 W, Steigerung 20 W, Stufendauer 3 Minuten) durchgeführt wurde. Ergebnis der vorliegenden Untersuchung ist, dass 1. Stufenleistungstests mit einer Stufendauer von 3 Minuten weder eine verlässliche Schätzung eines Laktat-Steady-States noch eine Voraussage über die Leistung des Athleten während längerer Belastung mit konstanter Intensität zulassen, 2. Sauerstoffaufnahme, Leistung und Herzfrequenz zwischen Stufenleistungstest und Belastungen bei konstanter Herzfrequenz- bzw. Leistungsvorgabe auch bei Gruppen von Athleten mit unterschiedlichem Trainingshintergrund viel besser korrespondieren als der metabolische Parameter Laktat, 3. basierend hierauf Leistung in Verbindung mit Herzfrequenz eine ideale Möglichkeit zur Vorgabe von Trainingsintensitäten und somit zur Trainingssteuerung im Radsport darstellen könnte.
p8 ist ein vor einigen Jahren erstmals im Zusammenhang mit Pankreatitis beschriebenes 80 Aminosäuren langes Protein, das im exokrinen Pankreas mit vermehrtem Zellwachstum assoziiert ist. Wir konnten p8 auch in beta-Zellen des endokrinen Pankreas nachweisen. Um Informationen über die subzelluläre Lokalisation zu erhalten, wurde ein Plasmid, das für ein Fusionsprotein aus p8 und GFP (grün fluoreszierendes Protein) kodiert, kloniert und in verschiedene Ziellinien transfiziert. Die Ergebnisse dieser Versuche sprechen dafür, dass p8 ein nukleäres Protein ist. Durch ein Deletionskonstrukt des Fusionsproteins wurde ein nukleäres Lokalisationssignal (NLS) am C-terminalen Ende des Proteins identifiziert. Um weitere Informationen über Funktion und Wirkungsweise von p8 zu erhalten, wurden induzierbar stabile INS-1-Zellen (beta-Zelllinie) etabliert. Stimulation dieser Zellen mit IPTG führte zu einer 5fachen Überexpression von p8. Die Zellzahl der p8-überexprimierenden Zellen und die der nicht-p8-überexprimierenden Zellen wurde zeitabhängig verglichen. Je nach Versuchsaufbau wurden nach 96 Stunden Zellwachstum unter p8-Überexpression 31% bis 37% mehr Zellen als in dem Vergleichskollektiv ohne p8-Überexpression ermittelt. Von Seufert et al. wurden in den Zellmedien der p8 überexprimierenden stabilen INS-1-Zellen kumulativ erhöhte Insulin-Spiegel gemessen. Dieses spricht dafür, dass Überexpression von p8 in beta-Zellen Proliferation ausloest, nicht aber zu einem Differenzierungsverlust führt. Unsere Untersuchungen nähren die Hoffnung, dass in Zukunft mit Hilfe von p8 Spender-beta-Zellen in vitro vermehrt und im Rahmen einer Zelltherapie einem Diabetiker transplantiert werden könnten.