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In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden Sphäroide aus mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe oder dem Knochenmark mittels der Micromold-Methode hergestellt. Den Sphäroiden wurden entweder Calciumphosphat- oder Calcium-Magnesium-Phosphat-Partikel hinzugefügt. Zum einen sollte überprüft werden, ob die Zugabe von Partikeln die osteogene Differenzierung der Sphäroide fördert und somit zur weiteren Entwicklung von körpereigenem Knochenersatzmaterial in der regenerativen Medizin beiträgt. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob eine der beiden Biokeramiken hinsichtlich der osteogenen Differenzierung überlegen ist.
Der steigende Bedarf an Knochenersatzmaterialien (KEM) in Medizin und Zahnmedizin verdeutlicht die Notwendigkeit der Etablierung weiterer alloplastischer, also synthetisch hergestellter, KEMs. Additive Fertigung ermöglicht die Herstellung patientenspezifischer Implantate. Hierfür wird auf Basis von 3D Bildgebung eines Knochendefekts, ein Implantat mittels CAD geplant und anschließend mittels additiver Fertigung, zum Beispiel durch 3D Pulverdruck hergestellt.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des osteogenen Potentials in vitro von Calciummagnesiumphosphatkeramiken mit der allgemeinen Strukturformel CaxMg(3-x)(PO4)2 mit x = 0; 0,25; 0,75; 1,5; 3 aus additiver Fertigung. Hierfür wurden Prüfkörper mittels 3D Pulverdruck gedruckt, anschließend durch Hochtemperatursinterung verfestigt und durch Behandlung mit reaktiven Lösungen nachgehärtet. Abhängig von der reaktiven Lösung wandelte sich die Keramik teilweise in Struvit, Bruschit und Newberyit um. Die biologische Testung in vitro erfolgte mit hFOB 1.19 Zellen und ergab eine gute Biokompatibilität sowie die Ausdifferenzierung osteogener Progenitorzellen für fast alle Keramikphasen, wobei die newberyithaltigen Keramiken tendenziell bessere Ergebnisse erzielten.
In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche zementbasierte Knochenersatzmaterialien hinsichtlich ihres Potentials zur Behandlung knöcherner Defekte in vivo untersucht. Zwei verschiedene Calcium-dotierten Magnesiumphosphat Zementformulierungen (CMPC) wurden mit einem Referenzmaterial aus Calciumphosphat Zement (CPC) verglichen. Dazu wurden auf Basis von CMPC präfabrizierte, injizierbare Pasten bzw. sphärische Granulate hergestellt und anhand von orthotopen, potenziell kraftbelasteten Defekten in Kaninchenfemora getestet. Zentrales Ziel hierbei war es, herauszufinden, wie sich die Materialien in Defektsituationen mit Hartgewebekontakt biologisch verhalten und degradieren bzw. in Knochen umbauen. Nach einer Liegedauer von 6 bzw. 12 Wochen wurden die Knochenneubildung und die Degradation der Materialien mittels Histomorphometrie analysiert.
Alle Materialien waren biokompatibel und führten zur Bildung von neuem Knochen. Der CMPC-Zement zeigte im Vergleich zu CPC einen beschleunigten Abbau, während sich am Referenzmaterial mehr mineralisierter Knochen bildete. Die untersuchten Calcium-dotierten Struvit-bildenden Magnesiumphosphatzemente erwiesen sich als biokompatibel, gut resorbierbar und stellen mit ihrer Fähigkeit zur Knochenbildung ein vielversprechendes Knochenersatzmaterial dar.
Tibiakopfimpressionsfrakturen (AO 41-B2.2 – Schatzker III), welche aufgrund der demographischen Entwicklung in ihrer klinischen Relevanz zunehmen, erfordern zur bestmöglichen Frakturstabilisierung eine Schraubenosteosynthese sowie eine stabile metaphysäre Defektauffüllung mittels Knochenersatzmaterial, da anderenfalls ein sekundärer Repositionsverlust mit konsekutiver Gonarthrose droht. Die hierbei eingesetzten Kalziumphosphatzemente bringen klinische Probleme wie geringe mechanische Stabilität, fehlende Bohrbarkeit, welche eine unvollständige Defektauffüllung bedingt, ungewisse Resorption und unüberprüfte Herstellerangaben mit sich.
Diese Studie hatte daher zum Ziel, einen bohrbaren Kalziumphosphatzement und einen Magnesiumphosphatzement, welche als vielversprechende Alternativen aufgrund der klinischen Schwierigkeiten erscheinen, gegen Graftys® Quickset und ChronOS™ Inject biomechanisch einzuordnen und somit langfristig zu einer verbesserten Frakturversorgung beizutragen.
Der erste Teil der Studie bestand aus einer reinen Materialprüfung, in der mittels Zementquader Druckversuche und mittels Ausrisskörper Zugversuche durchgeführt wurden. Im zweiten Teil wurde ein Frakturmodell für Impressionsfrakturen an Kunstknochen benutzt, um die Zemente hierbei zur Defektauffüllung zu verwenden und alleine sowie in Kombination mit einer Osteosynthese in der Jail-Technik zu testen. Es erfolgte eine zyklische Belastung mit 3000 Zyklen zu je 250 N sowie anschließend eine Maximalkrafttestung (Load-To-Failure) mit Hilfe einer Materialprüfmaschine.
Der Magnesiumphosphatzement zeigte die signifikant höchste Kompressionsfestigkeit von 100,50 MPa ± 15,97 MPa und Ausrisskraft sowie im Verbund mit Knochen das geringste Displacement, höchste Maximalkraft und Steifigkeit. Kalziumphosphat bohrbar wies aufgrund seines pseudoplastischen Verhaltens eine geringe biomechanische Stabilität und ein hohes Displacement auf, konnte aber durch seine Bohrbarkeit gegenüber Graftys® Quickset bei Einsatz mit Schrauben einen Vorteil im Displacement erreichen und somit die Vorzüge eines bohrbaren Knochenzements aufzeigen. ChronOS™ zeigte nach Aushärtung im Wasserbad mit einer Kompressionsfestigkeit von 0,58 MPa ± 0,14 MPa eine niedrige biomechanische Stabilität und wurde daher nicht weiter untersucht. Da die Viskosität eines Zements neben anderen Faktoren für die Interdigitation mit den Spongiosahohlräumen im Knochen verantwortlich ist, lässt sich, sofern diese angemessen ist, Rückschlüsse von der Materialprüfung auf das Verhalten im Knochen ziehen.
Magnesiumphosphatzemente erscheinen aufgrund ihrer hohen biomechanischen Stabilität und vermutlich guten Resorptionsrate als vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Kalziumphosphatzementen und bedürfen daher einer weiteren Überprüfung im Tierversuch.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression unterschiedlicher Marker für die Vaskularisation in verschiedenen Modifikationen zur Unterkieferaugmentation mit autologem kortikospongiösen Beckenkammtransplantaten in-vivo am Schafmodell untersucht. Wie schon aus Voruntersuchungen bekannt, zeigte vor allem die Modifikation des Transplantatlagers in der Kombination einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran mit dem Knochenersatzmaterial (KEM) Bio-Oss® und einem kortikospongiösen Transplantat die geringsten Resorptionsraten. Dieser Konditionierung wurden verschiedene andere Modikifationen des Transplantatlagers gegenübergestellt und jeweils die Expression der Vaskularisationsmarker untersucht und verglichen. Sowohl die Untersuchungen zur Expression von Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und seinen Rezeptor-Isoformen VEGF-Rezeptor 1 und VEGF-Rezeptor 2, sowie den NOS-Isoformen eNOS und iNOS zeigen alle eine signifikant vermehrte Expression in der Konditionierung mit Bio-Oss® als KEM und einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran. Lediglich die Expression des von-Willebrand-Faktors (vWF) als Marker des Endothels zeigte keine signifikant vermehrte Expression in der mit Bio-Oss® und Bio-Gide® modifizierten Gruppe. Hier wäre die Tatsache, dass der vWF auch als Marker der endothelialen Dysfunktion beschrieben wird und in den klinisch stärker atrophierten Modifikation vermehrt exprimiert wird, eine Erklärungsmöglichkeit. Die Untersuchungen zur Expression der Vaskularisationsmarker hinsichtlich der Regionen im Augmentat zeigen sowohl bei BMP-2 wie auch bei VEGF und seinen Rezeptorisoformen VEGF-R1 und VEGF-R2 eine signifikant vermehrte Expression im Bereich des Transplantates in der Bio-Oss® Modifikation. Diese Ergebnisse stützen den klinischen Aspekt der guten Vaskularisierung des Transplantates und unterstreichen die Bedeutung der Wachstumsfaktoren für die Vaskularisierung im Transplantat. Bei den Färbungen auf NOS findet sich eine signifikant vermehrte Expression im Transplantatlager. Diese Ergebnisse stellen die Bedeutung von NOS für die Regulation der Osteogenese und die direkten Wirkungen auf Osteoblasten und Osteoklasten. Die Tatsache, dass gerade in der Bio-Oss® Modifikation, in der klinisch die geringste Resorption zu beobachten war, signifikant mehr Vaskularisationsmarker exprimiert wurden, ist Nachweis der besseren Vaskularisation dieser Konditionierung und unterstreicht sowohl den Nutzen von KEM wie Bio-Oss® bei Transplantationen autologen Knochens, wie auch die Möglichkeiten der therapeutischen Verwendung einzelner Wachstumsfaktoren wie z. B. BMP-2.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die grundsätzliche Eignung von verschiedenen Magne-siumammoniumphosphat-Zementen für den eventuellen späteren Einsatz beim Men-schen zu bewerten; dafür wurden diverse in vitro Versuchsreihen zur Prüfung der Biokompatibilität dieser Verbindungen durchgeführt. Als Referenz diente bei diesen Versuchsreihen ein beim Menschen bereits erfolgreich eingesetzter nanokristalliner, kalziumarmer Hydroxylapatit-Zement. Für diese Biokompatibilitätsprüfungen wurde auf den verschiedenen Testoberflä-chen (Mg0,75Ca2,25(PO4)2 –, Mg1,5Ca1,5(PO4)2 –, Mg2,25Ca0,75(PO4)2 –, Mg3(PO4)2 –, Ca3(PO4)2–Zement) eine jeweils definierte Menge an humanen Osteoblasten der Zelllinie MG-63 aufgebracht und diese Zellen wurden danach über einen 14-tägigen Zeitraum kultiviert. Die Biokompatibilitätsüberprüfungen erfolgten mittels bestimmten Zellproliferations- und Zellaktivitätsmessungen; anhand der ermittelten Ergebnisse hinsichtlich Zellzahl und Zellaktivität sollte danach die Eignung dieser neuartigen Magnesiumammoniumphosphat-Zemente zur Verwendung im menschlichen Körper beurteilt werden. Mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden die jeweiligen Oberflächenstrukturen der einzelnen Zemente genauer untersucht; außer-dem konnte mit diesen Fotografien das Wachstum und die zelluläre Morphologie von humanen Osteoblasten auf den unterschiedlichen Oberflächen analysiert werden. Bei der Auswertung des Zellwachstums wurden die jeweils höchsten Werte in beiden Versuchsreihen auf dem Hydroxylapatit-Zement gemessen; bei den vier Magnesi-umammoniumphosphat-Zementen waren dagegen weitaus geringere Zellprolifera-tionsvorgänge innerhalb der Versuchsreihen zu beobachten. Auch bei der gesamten mitochondrialen Zellaktivität aller Osteoblasten erreichte der Hydroxylapatit-Zement in beiden Versuchen den maximalen Wert; der Unterschied zu den Werten bei den Magnesiumammoniumphosphat-Zementen war hier allerdings deutlich geringer als bei der Gesamtzellzahl. Vor allem beim Mg3(PO4)2 -Zement konnten in beiden Ver-suchen fast ähnlich hohe Werte beobachtet werden wie beim Hydroxylapatit-Zement. Untersuchte man dagegen die mitochondriale Aktivität der jeweiligen Einzelzelle auf den Oberflächen, unabhängig vom Gesamtwachstum, so konnte für den Hydroxyl-apatit-Zement die niedrigste Aktivität nachgewiesen werden. Die höchste mitochon-driale Einzelzellaktivität hatten in beiden Versuchsreihen die Osteoblasten auf dem Mg3(PO4)2 –Zement; auch die anderen Magnesiumammoniumphosphat-Verbindun-gen konnten trotz des insgesamt geringen Zellwachstums auf diesen Oberflächen re-lativ hohe Werte bei der Einzelzellaktivität erreichen. Insgesamt betrachtet war somit das Zellwachstum auf dem Hydroxylapatit-Zement signifikant stärker ausgebildet als auf allen Magnesiumammoniumphosphat-Verbin-dungen; trotz des im Vergleich geringen Zellwachstums konnte auf den Magnesium-ammoniumphosphat-Zementen aber ein hohes Maß an mitochondrialer Zellaktivität festgestellt werden. Die Auswertung der Oberflächenstruktur der verschiedenen Zemente mittels raster-elektronenmikroskopischer Bilder ergab für den Hydroxylapatit-Zement eine sehr ho-mogene und wenig poröse Oberfläche. Im Gegensatz dazu konnte bei den Magne-siumammoniumphosphat-Zementen (mit Ausnahme des Mg0,75Ca2,25(PO4)2 –Ze-ments) eine sehr raue Oberfläche mit einer starken Porosität nachgewiesen werden. Bei der Analyse der Zellmorphologie der Osteoblasten konnten keine deutlichen Unterschiede auf den verschiedenen Oberflächen beobachtet werden. Es zeigten sich vor allem ähnliche Formen der Zellkörper und auch die Anzahl der Zellen war re-lativ einheitlich; bei den zytoplasmatischen Zellfortsätzen konnten Unterschiede be-züglich ihrer Länge dargestellt werden. Auch die Auswertung der massenspektrometrischen Versuchsreihe ergab für die ver-schiedenen Magnesiumammoniumphosphat-Verbindungen ein sehr einheitliches Bild; beim Vergleich mit der Referenzoberfläche des Hydroxylapatit–Zements zeigte sich jedoch eine deutliche Diskrepanz bezüglich der Freisetzung von den verschie-denen Substanzen. Für die letztendliche Bewertung der Biokompatibilität von Magnesiumammonium-phosphat-Zementen und den eventuellen Einsatz als Knochenersatzmaterial bedarf es allerdings nicht nur zusätzlicher in vitro Versuchsreihen wie in der vorliegender Ar-beit, sondern auch vieler weiterführender Forschungsarbeiten, um die hier erzielten Ergebnisse zu verifizieren.
Ziel der Arbeit war die Herstellung und materialwissenschaftliche Untersuchung verschiedener Calciumphosphat-Zemente. Zwei unterschiedliche Zementtypen wurden dargestellt: eine Matrix bestand aus thermomechanisch aktiviertem Hydroxylapatit, die bei basischen pH-Werten zu nanokristallinem HA abbindet; eine zweite Matrix aus magnesiumsubstituierten ß-Tricalciumphosphaten und saurem Calcium-bis-dihydrogenphosphat reagiert zu sekundärem Calcium- bzw. Magnesiumhydrogenphosphat als Endprodukt. Die Werkstoffe wurden hinsichtlich ihrer Druckfestigkeit als abgebundener Zement, der Abbindezeit, des pH-Wert-Verlaufs während des Abbindens, mittels XRD-Analyse auf ihre Zusammensetzung, die durchschnittliche Partikelgröße der jeweiligen Mahlungen und auf ihre Dichte hin untersucht. Die bisher ermittelten Kennwerte der Zementmatrices sind auf jeden Fall ein guter Ausgangspunkt für eine spätere klinische Anwendung; die Zemente könnten bisher gebräuchliche Werkstoffe in ihrer Funktion als Knochenersatzpräparate sinnvoll ergänzen.
In der hier vorliegenden Studie wurden drei verschiedene Modifikationen des Calcium-Phosphat-Zementes BoneSource® sowie Vergleichssubstanzen hinsichtlich der Überprüfung ihrer Biodegradation und Biokompatibilität untersucht und verglichen. Die histomorphologische Auswertung und Beurteilung der verschiedenen Modifikationen des Calcium-Phosphat-Zementes BoneSource® bezüglich Biodegradation, Resorption und Biokompatibilität sowie die Beurteilung einer eventuellen Osteoneogenese waren damit Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Der Calcium-Phosphat-Zement (CPZ) BoneSource® ohne Zusätze (Versuchsgruppe 1) zeigte dabei eine Osteokonduktivität im Knochen sowie im Muskel- bzw. Weichgewebe eine Biotoleranz. Eine Resorption oder Degradation war im Unterschied zu anderen Studien nicht nachweisbar. Der Calcium-Phosphat-Zement BoneSource® in einem Volumenmischungsverhältnis 1:1 mit dem osteoinduktiven Knochenkollagen (KK) Colloss® (Versuchsgruppe 2) verhielt sich in den Arealen mit BoneSource®-Anteilen (CPZ) wie in Versuchsgruppe 1 osteokonduktiv und bioinert im Knochen und wurde im Muskel- und Weichgewebe biotoleriert. Die Areale mit Colloss® (KK) im Materialgemisch zeigen ein osteoinduktives Potenzial und damit ein bioaktives Verhalten. Es ist hier eine Osteoneogenese zu verzeichnen. Trabekel neuentstandenen Knochens waren dabei sowohl in den Knochen- als auch in den Muskelpräparaten nachweisbar. Eine vollständige knöcherne Substitution der gesetzten Defekte war nicht zu verzeichnen. Der Calcium-Phosphat-Zement BoneSource® mit 1:1-Volumenverhältnismischung mit Alpha-Tricalciumphosphat (BioBase®; Versuchsgruppe 3) führte im Vergleich zur Versuchsgruppe 1 zu einer geringfügigen Verbesserung der osteokonduktiven Eigenschaften mit histologisch nachweisbarer geringfügiger oberflächlicher Degradation und partieller lokaler Resorption. Im Vergleich zur Versuchsgruppe 2 waren diese Resorptionserscheinungen jedoch deutlich weniger ausgeprägt. Bei der Versuchsgruppe 4 wurde als Kontrollgruppe das derzeit meistverwendete nichtresorbierbare polymere Implantatmaterial Polymethylmethacrylat (PMMA; Palacos®) mitgeführt. In beiden Einsatzgebieten (Knochen und Muskel) waren die Implantate eingescheidet und wurden demzufolge biotoleriert. Bei den Knochenpräparaten liegt ein bioinertes Verhalten des Lagergewebes gegenüber PMMA vor. Bei der Versuchsgruppe 5 wurde als 2. Kontrollgruppe ein Leerdefekt präpariert, der mit Gelatine gefüllt wurde, welches bei bekannter Resorptionsfähigkeit innerhalb weniger Wochen postoperativ einen vollständigen Ersatz durch körpereigenen Knochen in den Knochenpräparaten bzw. einen Ersatz durch Narbengewebe in den Muskelpräparaten aufwies. Bei der Versuchsgruppe 6 (Kontrollgruppe) wurde eine nichtoperierte Kohorte Versuchstiere mitgeführt, um alters- und/oder diätbedingte Veränderungen abschätzen bzw. beurteilen zu können. Es fanden sich bei den Versuchstieren am Ende des Versuchszeitraumes lediglich physiologische altersbedingte Veränderungen. Die großen inneren Organe der Versuchstiere wurden histologisch untersucht, um eventuelle systemische Auswirkungen der o.g. Modifikationen des Calcium-Phosphat-Zementes BoneSource® beurteilen zu können. Dabei konnten keine pathologischen Veränderungen gefunden werden. Es liegen somit keine systemischen Auswirkungen der Implantatmaterialien vor. Im Laufe der Versuchszeit traten vereinzelt Tumore auf, die jedoch nicht den Implantatmaterialien geschuldet sind und einer spontanen Tumorgenese zugeordnet werden konnten. Spontane Todesfälle sind unabhängig von den Implantatmaterialien aufgetreten. Gemessen an der Zielsetzung sind die gefundenen Ergebnisse dieser Studie statistisch auswertbar, objektivierbar und für die Weiterentwicklung von Knochenersatzmaterialien relevant. Insbesondere wird auf die in dieser Studie nicht erfolgte Degradation von CPZ und Alpha-TCP und das osteoinduktive Potenzial des untersuchten Kollagens