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The Transforming Growth Factor (TGF) superfamily of cytokines and their serine/threonine kinase receptors play an important role in the regulation of cell division, differentiation, adhesion, migration, organization, and death. Smad proteins are the major intracellular signal transducers for the TGF receptor superfamily that mediate the signal from the membrane into the nucleus. Bone Morphogenetic Protein-4 (BMP-4) is a representative of the TGF superfamily, which regulates the formation of teeth, limbs and bone, and also plays a role in fracture repair. Binding of BMP-4 to its receptor stimulates phosphorylation of Smad1, which subsequently recruits Smad4. A hetero-oligomeric complex consisting of Smad1 and Smad4 then translocates into the nucleus and regulates transcription of target genes by interacting with transcription factors. Although the individual steps of the signaling cascade from the receptor to the nucleus have been identified, the exact kinetics and the rate limiting step(s) have remained elusive. Standard biochemical techniques are not suitable for resolving these issues, as they do not offer sufficiently high sensitivity and temporal resolution. In this study, advanced optical techniques were used for direct visualization of Smad signaling in live mammalian cells. Novel fluorescent biosensors were developed by fusing cyan and yellow fluorescent proteins to the signaling molecules Smad1 and Smad4. By measuring Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between the two fluorescent proteins, the kinetics of BMP/Smad signaling was unraveled. A rate-limiting delay of 2 - 5 minutes occurred between BMP receptor stimulation and Smad1 activation. A similar delay was observed in the complex formation between Smad1 and Smad4. Further experimentation indicated that the delay is dependent on the Mad homology 1 (MH1) domain of Smad1. These results give new insights into the dynamics of the BMP receptor – Smad1/4 signaling process and provide a new tool for studying Smads and for testing inhibitory drugs.
BMPs influence a variety of cellular processes. They have been shown to regulate proliferation, differentiation, migration and apoptosis and thus play central roles during developmental processes and tissue homeostasis. Ligand mediated signal transduction is transmitted via BMP type I and BMP type II receptors, both members of the serine/threonine kinase superfamily. The BMP receptor mediated signal transduction is not explored in detail. Therefore our aim was to address different aspects of BMP mediated signal transduction with main focus on BRII and its regulation. Due to the existence of two alternative splice variants, a long and a short form, the function of the two variants and the impact of the C-terminal extension are of general interest. Moreover, mutations in the BMPR2 gene were identified to be responsible for PPH, a autosomal dominant lung disease. In this thesis, BRII phosphorylation and signalling mediated by different receptor oligomers were investigated and multiple BRII associated proteins were identified. We could show that the oligomerization pattern of BMP receptors exhibits a higher degree of flexibility compared to other receptors of that superfamily. In the present work the BMP2 mediated signal transduction should be examined, depending on the receptor oligomerization pattern. Using kinase-deficient mutants, it could be demonstrated, that signalling via preformed BMP receptor complexes is mediated by the well characterized Smad1/5/8 pathway, whereas signalling initiated by BMP2 induced recruitment of the receptors activates the p38 pathway and leads to Alkaline Phosphatase production. To further study signalling events triggered directly from the BRII a proteomics-based screen for BRII associated proteins was performed. 53 associated proteins were found, the majority being signal transducing molecules, but in addition metabolic proteins, transcriptional regulators and others were identified. These proteins enable to gain a deeper insight in BMP mediated signalling. One of the interactors, the receptor tyrosine kinase c-kit, was characterized in more detail. It could be demonstrated, that BRII and c-kit form a complex in vitro and in vivo, and the interaction is enhanced upon BMP2 stimulation. 2D phosphopeptid mapping showed that BRII is phosphorylated at S757 upon activation of c-kit by SCF. Moreover, c-kit and its ligand SCF are modulating BMP2 pathways, by enhancing Smad1/5 phosphorylation, Smad-transcriptional activity, Alkaline Phosphatase production and expression of Cbfa1. All these pathways hint towards modulation of the osteoblast development via c-kit. Thus, we were able to develop a novel paradigm for the BMP2 meditated signalling. One of the initial triggers for BRII is the auto-phosphorylation of BRII. Here we analyze ligand-independent as well as ligand-dependent phosphorylation of BRII. Some phosphorylation sites in BRII were identified. The general phosphorylation occurs mostly on serines. S815, S818 and Y825 are identified targets of phosphorylation whose function is still unclear. However phosphorylation of S336 is demonstrated to be essential for BRII activation. The elucidation of BMP receptor phosphorylation and oligomerization as well as the impact of a number of BRII associated proteins (such as c-kit), demonstrated in this thesis that BMP signalling has to be regulated precisely on multiple levels. This can be useful for the development of selective signalling inhibitors for basic research and therapeutic approaches of PPH and other diseases.
EINFÜHRUNG: Bisherige Methoden der Behandlung von Wirbelkörperfrakturen machten ein kombiniertes Vorgehen aus anteriorem und posteriorem Zugang zum frakturierten Wirbelkörper erforderlich, um zwei Dinge zu ermöglichen: die Stabilisierung der hinteren Säule durch einen Fixateur interne und die Aufrichtung und Abstützung des gesinterten Wirbels durch Cage-Interposition, Verplattung oder autologe trikortikale Spantransplantation vom Beckenkamm zur Erhöhung der axialen Belastbarkeit im frakturierten Wirbelsäulensegment. Ein bereits in den 80er Jahren entstandenes Konzept eines solitären dorsalen Vorgehens mit transpedikulärem Zugang zur Behandlung der ventralen Säule mittels autologer Spongiosa und dem Vorteil einer verminderten Morbidität durch den Wegfall des zusätzlichen ventralen Vorgehens scheiterte an der fehlenden axialen Belastungsstabilität. Wir testeten im Schafsmodell ein modifiziertes dorsales transpedikuläres Verfahren und untersuchten die Effizienz eines rhOP-1-Hydroxylapatit-Zement-Gemisches gegenüber transplantierter Spongiosa und Hydroxylapatit-Zement hinsichtlich seiner Eignung zur Abstützung der vorderen Säule. METHODIK: Es wurden 36 Schafe einer operativen Verblockung der Lendenwirbel 4-6 mittels Fixateur interne unterzogen und in drei Gruppen zu je 12 Tieren eingeteilt. In Gruppe 1 diente autologe Beckenkammspongiosa zur transpedikulären Auffüllung des pedikuloskopisch ausgeräumten Zwischenwirbelraumes L4/5, in Gruppe 2 wurde der Defekt durch Hydroxylapatit-Zement überbrückt und in Gruppe 3 durch Hydroxylapatit-Zement mit darin mikroverkapseltem rhOP-1. Die ersten beiden Tiere der ersten Gruppe mußten wegen einer primären postoperativen Paraplegie der hinteren Extremitäten getötet werden, so daß in dieser Gruppe noch zehn Tiere für die kommenden Untersuchungen verblieben. Nach 8 postoperativen Wochen wurden die Tiere getötet und die seit der Operation stattgefundenen Veränderungen im aufgefüllten Zwischenwirbelraum L4/5 röntgenologisch, makromorphometrisch und histologisch verglichen. ERGEBNISSE: In Gruppe 1 zeigte sich in einem von zehn Fällen eine einseitige knöcherne Durchbauung, in acht der zehn Fälle eine über das ursprüngliche Niveau der Wirbelkörperendplatten hinausreichende Knochenneubildung oder zumindest Spongiosaintegration, es traten keine Entzündungszeichen in dieser Gruppe auf. In Gruppe 2 wurden eine unilaterale und eine bilaterale Wirbelkörperfusion gefunden, die übrigen zehn Schafe wiesen eine deutliche Zementresorption und –fragmentierung mit steriler Entzündungsreaktion und Osteolysen in vier Fällen auf. Charakteristisch war eine horizontal verlaufende Bruchlinie im intervertebralen Anteil der Zementplombe, die in allen Präparaten zu finden, im Falle der Fusionen allerdings durch Knochenbrücken unterbrochen war. Gruppe 3 präsentierte in vier Fällen unilaterale und in sechs Fällen bilaterale Fusionen, selbst die beiden Präparate ohne Fusion zeichneten sich durch deutliche Knochenneubildung und fehlende Zementresorption oder –fragmentierung bei auch hier vorhandener horizontaler Plombenbruchlinie aus, es fanden sich keine osteolytisch-entzündlichen Veränderungen. DISKUSSION: Die rhOP-1-Hydroxylapatit-Zement-Gruppe erwies sich mit zehn erfolgreichen Fusionen ohne Entzündungsreaktionen somit als deutlich überlegen im Vergleich mit transplantierter Spongiosa (eine Fusion, kein Entzündungsfall) und Hydroxylapatit-Zement ohne rhOP-1 (zwei Fusionen, vier Entzündungsfälle). Die in Gruppe 2 und 3 beobachtete horizontale Bruchlinie in der Zementplombe rührte von einer frühen postoperativen Scherkraftbelastung auf den Zwischenwirbelraum L4/5 und konnte in der dritten Gruppe dank der osteoinduktiven Wirkung des rhOP-1 besser durchbaut werden als in der Hydroxylapatit-Zement-Gruppe ohne rhOP-1, in der die alleinige osteokonduktive Wirkung des Knochenzements eine rasche Wirbelkörperfusion nicht herbeiführen konnte. Stattdessen trat in einigen Fällen trotz primärer axialer Belastungsstabilität des Zementes wegen der fehlenden beschleunigten Biointegration des Hydroxylapatits eine deutliche Zementplombenfragmentierung mit nachfolgender steriler Entzündungsreaktion auf. ZUSAMMENFASSUNG: Es konnte also unter Vermeidung eines zusätzlichen ventralen Vorgehens mit einem transpedikulären dorsalen Verfahren mittels einer Kombination aus primär axial belastungsstabilem Hydroxylapatit-Zement und osteoinduktiv wirksamem rhOP-1 in zehn von zwölf Fällen und damit signifikant häufiger als mit den Vergleichsverfahren nach acht postoperativen Wochen eine Wirbelkörperfusion im Schafsmodell herbeigeführt werden.
Die lokale Bioverfügbarkeit von osteoinduktiven Wachstumsfaktoren hat einen entscheidenden Einfluss auf das Ausmaß der Knochenbildung. Die Affinität der Proteine zu Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) beeinflusst ihre Ortsständigkeit und damit ihre biologische Aktivität am Implantationsort. In der vorliegenden Arbeit wurden BMP-2 und seine gentechnologisch hergestellten Varianten mit verstärkter (T3, T4) und aufgehobener (EHBMP-2) Bindung an die EZM untersucht. Die Wachstumsfaktoren wurden einzeln sowie in Kombination mit EHBMP-2 in Bezug auf die erzielbare Knochenneubildungsrate im heterotopen Implantatlager (Oberschenkelmuskulatur der Ratte) verglichen. Durch den Einsatz der Proteinkombinationen wurde der Frage nachgegangen, inwieweit die Knochenneubildung durch die Mischung einer kaum an die extrazelluläre Matrix bindenden Varianten (EHBMP-2) mit einem „normal“ (BMP-2 Wildtyp) bzw. verstärkt (T3, T4) an die extrazelluläre Matrix bindenden Morphogen verbessert werden kann. Mittels röntgenologischer, biochemischer und histologischer Untersuchungen wurden die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Knochenneubildung analysiert. Bei allen Proteinen bzw. Proteinkombinationen wurde eine direkte Abhängigkeit der Knochenneubildung von den eingesetzten Proteinmengen beobachtet. Bei niedriger Konzentration (2 µg) waren BMP-2 bzw. die Varianten T3 und T4 den Proteinkombinationen mit EHBMP-2 immer überlegen. Bei höherer Dosis (4 µg) waren BMP-2 und T4 den Kombinationen mit EHBMP-2 überlegen. Nur bei T3 in höherer Dosierung konnte ein positiver Effekt einer Kombination mit EHBMP-2 beobachtet werden.
Die lokale Bioverfügbarkeit von osteoinduktiven Wachstumsfaktoren hat einen entscheidenden Einfluss auf das Ausmaß der Knochenbildung. Die Affinität der Proteine zu Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) beeinflusst ihre Ortsständigkeit und damit ihre biologische Aktivität am Implantationsort. In der vorliegenden Arbeit wurden BMP-2 und seine gentechnologisch hergestellten Varianten mit verstärkter (T3, T4) und aufgehobener (EHBMP-2) Bindung an die EZM untersucht. Die Wachstumsfaktoren wurden einzeln sowie in Kombination mit EHBMP-2 in Bezug auf die erzielbare Knochenneubildungsrate im heterotopen Implantatlager (Oberschenkelmuskulatur der Ratte) verglichen. Durch den Einsatz der Proteinkombinationen wurde der Frage nachgegangen, inwieweit die Knochenneubildung durch die Mischung einer kaum an die extrazelluläre Matrix bindenden Varianten (EHBMP-2) mit einem „normal“ (BMP-2 Wildtyp) bzw. verstärkt (T3, T4) an die extrazelluläre Matrix bindenden Morphogen verbessert werden kann. Mittels röntgenologischer, biochemischer und histologischer Untersuchungen wurden die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Knochenneubildung analysiert. Bei allen Proteinen bzw. Proteinkombinationen wurde eine direkte Abhängigkeit der Knochenneubildung von den eingesetzten Proteinmengen beobachtet. Bei niedriger Konzentration (2 µg) waren BMP-2 bzw. die Varianten T3 und T4 den Proteinkombinationen mit EHBMP-2 immer überlegen. Bei höherer Dosis (4 µg) waren BMP-2 und T4 den Kombinationen mit EHBMP-2 überlegen. Nur bei T3 in höherer Dosierung konnte ein positiver Effekt einer Kombination mit EHBMP-2 beobachtet werden.
Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der molekularen Grundlagen der Proepikardentwicklung im Huhn. Das Proepikard (PE) stellt die Vorläuferpopulation des Koronargefäßsystems dar. Es wurden zwei Schwerpunkte bearbeitet, zum einen die Rolle von einem Mitglied der TGFß-Superfamilie (BMP, bone morphogenetic protein) während der Induktionsphase des PE und zweitens die molekularen Mechanismen, welche der links/rechts Asymmetrie der PE Entwicklung zugrunde liegen. Die Expressionsmuster von TBX18, WT1, CFC weisen diese als proepikardiale Marker aus. BMP4 wird ebenfalls im PE exprimiert, wenngleich wesentlich schwächer als BMP2 im benachbarten Sinusmyokard. Durch in vitro Experimente mit proepikardialen Primärkulturen wurde festgestellt, dass die Zugabe von rekombinatem BMP2 einen Teil der Zellen zu Kardiomyozyten differenzieren lässt. Daher wird angenommen, dass ein Teil der proepikardialen Zellen konzentrationsabhängig auf Wachstumsfaktoren reagieren und in der Lage sind, die epikardiale Linie zu verlassen und ein myokardiales Schicksal anzunehmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle des NODAL-PITX2-Signalweges in Bezug auf die Unilateralität des Proepikards im Hühnchen analysiert. Dazu wurden Manipulationen des Hensenschen Knotens im HH Stadium 4 durchgeführt, mit dem Ziel linksseitige Markergene auf der rechten Seite ektopisch zu induzieren. Keine dieser Manipulationen, als auch eine virale Überexpression von PITX2 in sinuatrialen Progenitoren in vivo, liess eine Veränderung der TBX18-Lateralität erkennen, obwohl die PITX2-Expression randomisiert war. Dagegen führte die Inhibition des asymmetrischen Ionenfluxes sowie der Apoptose im Primitivstreifen zu einer völligen Randomisierung der TBX18-Expression, sowie unter anderem der Entwicklung bilateraler Proepikardien. Die Induktion bilateraler TBX18-Expressionsdomänen war ebenfalls durch ektopisches FGF8 auf der linken Seite des Knotens zu beobachten. Der Verlust der rechtsseitigen FGF Signalgebung im Knoten resultierte in einem Verlust der rechtsseitigen TBX18-Expression im Sinus. Daraus kann geschlossen werden, dass proepikardiale Progenitoren nicht nur durch den asymmetrischen Ionenflux sowie Apoptose im Primitivstreifen in ihrer Lateralität festgelegt werden, sondern auch von rechtsseitigen FGF-Signalen im Knoten und unabhängig vom linkseitigen NODAL-PITX2-Signalweg lateralisiert werden.
Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling
(2006)
Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs.
Ziel dieser Studie war es, acht verschiedene Materialien auf ihre Eignung als Träger für rhBMP-2 zu untersuchen (unlösliche kollagene bovine Knochenmatrix ICBM, Hydroxylapatit, a-TCP, Algipore®, BioOss®, Bioglas, Kollagen und Copolymer Ethisorb®). Bei erwachsenen, männlichen Spargue-Dawley-Ratten wurden Trepanationsdefekte kritischer Größe im Kieferwinkelbereich (5mm) und in der Kalotte (7mm) gesetzt. Im Femur wurde ein Kontinuitätsdefekt von 8mm Länge gesetzt. Die Defekte im Unterkiefer und der Kalotte wurden mit den jeweiligen Träger in Kombination mit 10µg rhBMP-2 implantiert. Im Femurkontinuitätsdefekt wurden die Materialien mit 25µg rhBMP-2 dotiert. Für synthetisches HA, Algipore® und BioOss® konnte nach Versuchsablauf keine Resorption festgestellt werden. a-TCP und Bioglas zeigten geringe resorptive Prozesse. Bei ICBM und Ethisorb konnten deutlich ausgeprägte Resorptionsvorgänge nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass alle getesteten Träger zusammen mit rhBMP-2 eine deutliche Knochenneubildung induzierten. In den mikroradiographischen und morphometrischen Untersuchungen konnten für ICBM die größte und schnellste Zunahme an neu gebildeten Knochen nachgewiesen werden. Die Kalziumphosphatkeramiken unterschieden sich innerhalb der Gruppe nur unwesentlich voneinander. Die geringste Knochenneubildung zeigten die Träger Bioglas, Kollagen und Ethisorb®. Bei allen Materialien war die Knochenneubildung im Kieferwinkelbereich am stärksten. Die Femurproben wurden biomechanisch untersucht. Für ICBM, a-TCP und Hydroxylapatit konnten die höchsten Elastizitätsmodule nachgewiesen werden. ICBM als Träger für rekombinantes humanes BMP-2 eignete sich in allen Untersuchungen am besten. Es wurde weitgehenden in den neu gebildeten Knochen integriert und zeigte ein ausgezeichnetes Resorptionsverhalten.