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Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und die Anfertigung eines 3D Erdfeld-NMR Tomographen, um damit die benötigte Technik der MR eines MR-MPI-Tomographen am Lehrstuhl zu etablieren. Daraufhin wurden alle nötigen Komponenten für ein komplettes 3D Erdfeld-NMR-System entwickelt, gebaut und getestet. Mit diesem Wissen wurde in enger Zusammenarbeit mit der MPI-Arbeitsgruppe am Lehrstuhl ein multimodaler MR-MPI-Tomograph angefertigt und die prinzipielle Machbarkeit der technischen Kombination dieser zwei Modalitäten (MRT/MPI) in einer einzigen Apparatur gezeigt.
Auf diesem Entwicklungsweg sind zusätzlich innovative Systemkomponenten entstanden, wie der Bau eines neuen Präpolarisationssystems, mit dem das Präpolarisationsfeld kontrolliert und optimiert abgeschaltet werden kann. Des Weiteren wurde ein neuartiges 3D Gradientensystem entwickelt, das parallel und senkrecht zum Erdmagnetfeld ausgerichtet werden kann, ohne die Bildgebungseigenschaften zu verlieren. Hierfür wurde ein 3D Standard-Gradientensystem mit nur einer weiteren Spule, auf insgesamt vier Gradientenspulen erweitert. Diese wurden entworfen, gefertigt und anhand von Magnetfeldkarten ausgemessen. Anschließend konnten diese Ergebnisse mit der hier präsentierten Theorie und den Simulationsergebnissen übereinstimmend verglichen werden.
MPI (Magnetic Particle Imaging) ist eine neue Bildgebungstechnik mit der nur Kontrastmittel detektiert werden können. Das hat den Vorteil der direkten und eindeutigen Detektion von Kontrastmitteln, jedoch fehlt die Hintergrundinformation der Probe. Wissenschaftliche Arbeiten prognostizieren großes Potential, die Hintergrundinformationen der MRT mit den hochauflösenden Kontrastmittelinformationen mittels MPI zu kombinieren. Jedoch war es bis jetzt nicht möglich, diese beiden Techniken in einer einzigen Apparatur zu etablieren. Mit diesem Prototyp konnte erstmalig eine MR-MPI-Messung ohne Probentransfer durchgeführt und die empfindliche Lokalisation von Kontrastmittel mit der Überlagerung der notwendigen Hintergrundinformation der Probe gezeigt werden. Dies ist ein Meilenstein in der Entwicklung der Kombination von MRT und MPI und bringt die Vision eines zukünftigen, klinischen, multimodalen MR-MPI-Tomographen ein großes Stück näher.
Supramolecular self-assembly of perylene bisimide (PBI) dyes via non-covalent forces gives rise to a high number of different PBI architectures with unique optical and functional properties. As these properties can be drastically influenced by only slightly structural changes of the formed supramolecular ensembles (Chapter 2.1) the controlled self-assembly of PBI dyes became a central point of current research to design innovative materials with a high potential for different applications as for example in the fields of organic electronics or photovoltaics.
As PBI dyes show a strong tendency to form infinite aggregated structures (Chapter 2.2) the aim of this thesis was to precisely control their self-assembly to create small, structurally well-defined PBI assemblies in solution. Chapter 2.3 provides an overview on literature known strategies that were established to realize this aim. It could be demonstrated that especially backbone-directed intra- and intermolecular self-assembly of covalently linked Bis-PBI dyes evolved as one of the most used strategies to define the number of stacked PBI chromophores by using careful designed spacer units with regard to their length and flexibility.
By using conventional spectroscopic methods like UV/Vis and fluorescence experiments in combination with NMR measurements an in-depth comparison of the molecular and optical properties in solution both in the non-stacked and aggregated state of the target compounds could be elucidated to reveal structure-property relationships of different PBI architectures. Thus, it could be demonstrated, that spacer units that pre-organize two PBI chromophores with an inter-planar distance of r < 7 Å lead to an intramolecular folding, whereas linker moieties with a length between 7 to 11 Å result in an intermolecular self-assembly of the respective Bis-PBIs dyes via dimerization to form well-defined quadruple PBI pi-stacks. Hence, if the used spacer units ensure an inter-planar distance r > 14 Å larger oligomeric PBI pi-stacks are generated.
In Chapter 4 a detailed analysis of the exciton coupling in a highly defined H-aggregate quadruple PBI pi-stack is presented. Therefore, bay-tethered PBI dye Bis-PBI 1 was investigated by concentration-dependent UV/Vis spectroscopy in THF and toluene as well as by 2D-DOSY-NMR spectroscopy, ESI mass spectrometry and AFM measurements confirming that Bis-PBI 1 self-assembles exclusively into dimers with four closely pi-stacked PBI chromophores. Furthermore, with the aid of broadband fluorescence upconversion spectroscopy (FLUPS) ensuring broadband detection range and ultrafast time resolution at once, ultrafast Frenkel exciton relaxation and excimer formation dynamics in the PBI quadruple pi-stack within 1 ps was successfully investigated in cooperation with the group of Dongho Kim. Thus, it was possible to gain for the first time insights into the exciton dynamics within a highly defined synthetic dye aggregate beyond dimers. By analysing the vibronic line shape in the early-time transient fluorescence spectra in detail, it could be demonstrated that the Frenkel exciton is entirely delocalized along the quadruple stack after photoexcitation and immediately loses its coherence followed by the formation of the excimer state.
In Chapter 5 four well-defined Bis-PBI folda-dimers Bis-PBIs 2-4 were introduced, where linker units of different length (r < 7 Å) and steric demand were used to gain distinct PBI dye assemblies in the folded state. Structural elucidation based on in-depth UV/Vis, CD and fluorescence experiments in combination with 1D and 2D NMR studies reveals a stacking of the two PBI chromophores upon folding, where geometry-optimized structures obtained from DFT calculations suggest only slightly different arrangements of the PBI units enforced by the distinct spacer moieties. With the resulting optical signatures of Bis-PBIs 2-4 ranging from conventional Hj-type to monomer like absorption features, the first experimental proof of a PBI-based “null-aggregate” could be presented, in which long- and short-range exciton coupling fully compensate each other. Hence, the insights of this chapter pinpoint the importance of charge-transfer mediated short-range exciton coupling that can significantly influence the properties of pi-stacked PBI chromophores
In the last part of this thesis (Chapter 6), spacer-controlled self-assembly of four bay-linked Bis-PBI dyes Bis-PBIs 5-8 into well-defined supramolecular architectures was investigated, where the final aggregate structures are substantially defined by the nature of the used spacer units. By systematically extending the backbone length from 7 to 15 Å defining the inter-planar distance between the tethered chromophores, different assemblies from defined quadruple PBI pi-stacks to larger oligomeric pi-stacks could be gained upon aggregation.
In conclusion, the synthesis of nine covalently linked PBI dyes in combination with a detailed investigation of their spacer-mediated self-assembly behaviour in solution concerning structure-properties-relationships was presented within this thesis. The results confirm a strong exciton coupling in different types of Bis-PBI architectures e.g. folda-dimers or highly defined quadruple pi-stacks, which significantly influences their optical properties upon self-assembly.
Dank der mit modernen NMR-Spektrometern (Kernspintomographen) routinemäßig realisierbaren isotropen räumlichen Auflösungen von wenigen Mikrometern, ergeben sich für die 1H NMR-Mikroskopie zahlreiche neue Anwendungsgebiete. Allerdings sind die Möglichkeiten und Grenzen der NMR-Mikroskopie bezüglich ihrer praktischen Anwendbarkeit bisher nur wenig untersucht worden. Die vorliegende Arbeit ist im Bereich der biophysikalischen Grundlagenforschung angesiedelt und soll die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie auf neuen medizinischen und biologischen Anwendungsgebieten anhand von ausgewählten Beispielen aus diesen Bereichen demonstrieren. Die einzelnen Projekte besitzen deswegen immer auch den Charakter von Machbarkeitsstudien, die aufzeigen sollen, welche Möglichkeiten und Vorteile die NMR-Mikroskopie im Vergleich zu etablierten Untersuchungsmethoden bietet. Im Detail wurden unterschiedliche lebende und fixierte biologische Proben mittels NMR-Mikroskopie zerstörungsfrei und räumlich hochaufgelöst dargestellt. Dabei variierte die spezielle Zielsetzung von der Visualisierung der Invasion eines Tumorsphäroiden in ein Zellaggregat anhand von T2-Parameterkarten (Zeitkonstante der Spin-Spin-Relaxation) über die dreidimensionale Darstellung des Gehirns der Honigbiene in der intakten Kopfkapsel bis hin zur nicht-invassiven Abbildung der Anatomie prenataler Delphine. Für alle durchgeführten Projekte war der nicht-invasive Charakter der NMR-Experimente von entscheidender Bedeutung. Die zu beobachtende Tumorinvasion durfte nicht durch die Messung beeinflusst werden, das Bienengehirn sollte möglichst naturgetreu abgebildet werden, und die untersuchten Delphine sind seltene Museumsstücke, die nicht zerstört werden durften. Die verschiedenen Proben wurden mit der jeweils bestmöglichen räumlichen Auflösung visualisiert, die sich entweder durch das minimal nötige Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) oder durch die zur Verfügung stehende Messzeit ergab. Um einzelne feine Strukturen in den Bildern auflösen zu können, mussten sowohl das SNR, als auch das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis optimiert werden. Die Messungen wurden an Hochfeld-NMR-Spektrometern bei 500 und 750 MHz durchgeführt, um das für die hohe Auflösung notwendige SNR zu gewährleisten. Mit den Experimenten konnten zahlreiche Fragen bezüglich mikroskopischer Details der verschiedenen untersuchten Proben nicht-invasiv beantworten werden. Gleichzeitig führten sie zu neuen interessanten Fragestellungen bezüglich der NMR-Mikroskopie an fixierten Proben. Darüber hinaus konnte die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie als Alternative bzw. Ergänzung zu herkömmlichen Untersuchungsmethoden wie der konfokalen Lasermikroskopie bei der Visualisierung des Bienengehirns und der konventionellen Histologie bei der Untersuchung der Anatomie der prenatalen Delphine demonstriert werden. Durch die Untersuchung der speziellen Vorteile und der Grenzen der Anwendung der NMR-Mikroskopie gegenüber den herkömmlichen Untersuchungsmethoden konnte konkret der praktische Nutzen ihres Einsatzes aufgezeigt und Ergebnisse erzielt werden, die sonst nicht erzielbar wären. Gerade der Einsatz der NMR-Mikroskopie in Form der NMR-Histologie stellt einen vielversprechenden Weg zur Etablierung der NMR-Mikroskopie als Routineuntersuchungsmethode dar. Als ebenso erfolgreich hat sich die Anwendung der NMR-Mikroskopie als Untersuchungsmethode bei der Beobachtung der Tumorinvasion erwiesen, so dass sie auch in der medizinischen in-vitro Forschung und Therapiesimulation als sinnvolle Alternative zu den vorhandenen Methoden angesehen werden kann. Anhand der ausgewählten Anwendungsbeispiele ist es in dieser Arbeit somit gelungen, neue, konkrete Einsatzmöglichkeiten für die NMR-Mikroskopie zu eröffnen und ihre praktische Anwendbarkeit als Untersuchungsmethode für Fragestellungen im Bereich der medizinischen in-vitro Forschung und verschiedener neuro- und entwicklungsbiologischer Bereiche zu demonstrieren.
Paclitaxel (PTX) is one of the leading drugs against breast and ovarian cancer. Due to its low solubility, treatment of the patients with this drug requires a very well-suited combination with a soluble pharmaceutical excipient to increase the bioavailability and reduce the strong side ef-fects. One efficient way to achieve this in the future could be the incorporation of PTX into pol-ymeric micelles composed of poly(2-oxazoline) based triblock copolymers (POL) which ena-bles PTX loadings of up to 50 wt.%. However, structural information at an atomic level and thus the knowledge of interaction sites within these promising but complex PTX-POL formula-tions were not yet available. Such results could support the future development of improved excipients for PTX and suitable excipients for other pharmaceutical drugs. Therefore, a solid-state MAS NMR investigation of these amorphous formulations with different POL-PTX com-positions was performed in this thesis as this gives insights of the local structure at an atomic level in its solid state. NMR in solution showed very broad 13C signals of PTX for this system due to the reduced mobility of the incorporated drug which exclude this as an analytical meth-od.
In a first study, crystalline PTX was structurally characterized by solid-state NMR as no com-plete 13C spectrum assignment and no 1H NMR data existed for the solid state. In addition, the asymmetric unit of the PTX crystal structure consists of two molecules (Z'=2) that can only be investigated in its solid state. As crystalline PTX in total has about 100 different 13C and 1H chemical shifts with very small differences due to Z’=2, and furthermore, its unit cell consisting of more than 900 atoms, accompanying GIPAW (CASTEP) calculations were required for NMR signal assignments. These calculations were performed using the first three available purely hydrous and anhydrous PTX structures, which were determined by XRD and published by Vel-la-Zarb et al. in 2013. Within this thesis, is was discovered that two investigated batches of commercially available PTX from the same supplier both contained an identical and so far un-known PTX phase that was elucidated by PXRD as well as solid-state NMR data. One of the two batches consists of an additional phase that was shown to be very similar to a known hy-drated phase published in 2013.[1] By heating the batch with the mixture of the two phases un-der vacuum, it is transformed completely to the new dry phase occurring in both PTX batches. Since the drying conditions to obtain anhydrous PTX in-situ on the PXRD setup described by Vella-Zarb et. al.[1] were much softer than ours, we identify our dry phase as a relaxed version of their published anhydrate structure. The PXRD data of the new anhydrate phase was trans-ferred into a new structural model, which currently undergoes geometry optimization. Based on solid-state NMR data at MAS spinning frequencies up to 100 kHz, a 13C and a partial 1H signal assignment for the new anhydrous structure were achieved. These results provided sufficient structural information for further investigations of the micellar POL-PTX system.
In a second study, the applicability and benefit of two-dimensional solid-state 14N-1H HMQC MAS NMR spectra for the characterization of amorphous POL-PTX formulations was investi-gated. The mentioned technique has never been applied to a system of similar complexity be-fore and was chosen because around 84% of the small-molecule drugs contain at least one nitrogen atom. In addition, the number of nitrogen atoms in both POL and PTX is much smaller than the number of carbons or hydrogens, which significantly reduces the spectral complexity. 14N has a natural abundance of 99.6% but leads to quadrupolar broadening due to its nuclear spin quantum number I = 1. While this is usually undesirable due to broadening in the resulting 1D 14N NMR spectra, this effect is explicitly used in the 2D 14N-1H HMQC MAS experiment. The indirect 14N measurement can avoid the broadening while maintaining the advantage of the high natural abundance and making use of the much more dispersed signals due to the additional quadrupolar shifts as compared to 15N.
This measurement method could be successfully applied to the complex amorphous POL-PTX mixtures. With increasing PTX loading of the formulations, additional peaks arise as spatial proximities of the amide nitrogens of POL to NH or OH groups of PTX. In addition, the 14N quadrupolar shift of these amide nitrogens decreases with increasing PTX content indicating a more symmetric nitrogen environment. The latter can be explained by a transformation of the trigonal planar coordination of the tertiary amide nitrogen atoms in pure POL towards a more tetrahedral environment upon PTX loading induced by the formation of hydrogen bonds with NH/OH groups of PTX.
In the third and last project, the results of the two abovementioned studies were used and ex-tended by solid state 13C and two-dimensional 1H-13C as well as 1H-1H MAS NMR data with the aim to derive a structural model of the POL-PTX formulations at an atomic level. The knowledge of the NMR signal assignments for crystalline PTX was transferred to amorphous PTX (present in the micelles of the formulations). The 13C solid-state NMR signals were evalu-ated concerning changes in chemical shifts and full widths of half maximum (FWHM) for the different PTX loadings. In this way, the required information about possible interaction sites at an atomic level becomes available. Due to the complexity of these systems, such proximities often cannot be assigned to special atoms, but more to groups of atoms, as the individual de-velopments of line widths and line shifts are mutually dependent. An advantageous aspect for this analysis was that pure POL already forms unloaded micelles. The evaluation of the data showed that the terminal phenyl groups of PTX seem to be most involved in the interaction by the establishment of the micelle for lowest drug loading and that they are likely to react to the change in the amount of PTX molecules as well. For the incorporation of PTX in the micelles, the following model could be obtained: For lowest drug loading, PTX is mainly located in the inner part of the micelles. Upon further increasing of the loading, it progressively extends to-ward the micellar shell. This could be well shown by the increasing interactions of the hydro-phobic butyl chain of POL and PTX, proceeding in the direction of the polymer backbone with rising drug load. Furthermore, due to the size of PTX and the hydrodynamic radius of the mi-celles, even at the lowest loading, the PTX molecules partially reach the core-shell interface of the micelle. Upon increasing the drug loading, the surface coverage with PTX clusters increas-es based on the obtained model approach. The latter result is supported by DLS and SANS data of this system. The abovementioned results of the 14N-1H HMQC MAS investigation of the POL-PTX formulations support the outlined model.
As an outlook, the currently running geometry optimization and subsequently scheduled calcu-lation of the chemical shieldings of the newly obtained anhydrous PTX crystal structure can further improve the solid-state NMR characterization through determination of further spatial proximities among protons using the existing 2D 1H(DQ)-1H(SQ) solid-state MAS NMR spec-trum at 100 kHz rotor spinning frequency. The 2D 14N-1H HMQC MAS NMR experiments were shown to have great potential as a technique for the analysis of other disordered and amor-phous drug delivery systems as well. The results of this thesis should be subsequently applied to other micellar systems with varying pharmaceutical excipients or active ingredients with the goal of systematically achieving higher drug loadings (e.g., for the investigated PTX, the similar drug docetaxel or even different natural products). Additionally, it is planned to transfer the knowledge to another complex polymer system containing poly(amino acids) which offers hy-drogen bonding donor sites for additional intermolecular interactions. Currently, the POL-PTX system is investigated by further SANS studies that may provide another puzzle piece to the model as complementary measurement method in the future. In addition, the use of MD simu-lations might be considered in the future. This would allow a computerized linking of the differ-ent pieces of information with the aim to determine the most likely model.
In this thesis the syntheses and detailed investigations on two foldable PBI systems were presented. The reversible, solvent-dependet folding/unfolding-behavior was used to study the ground and excited states properties of folda-dimer and folda-trimer by means of different spectroscopic methods as well as theoretical studies. The switching between charge transfer or excimer formation pathways of photoexcited molecules influenced by the spatial arrangement of chromophores within defined dye systems illustrates the impact of conformational preferences on functional properties.
Quantitative Bestimmungen Anhand verschiedener Substanzen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die NMR-Spektroskopie in der Lage ist, Verunreinigungen von Arzneistoffen zu quantifizieren. Für das Antidepressivum Fluvoxamin ist im Arzneibuch eine Ionenpaarchroma-tographie vorgeschrieben, um die Verunreinigung des wirksamen E-Isomers durch das Z-Isomer zu quantifizieren. Ionenpaarchromatographischen Methoden mangelt es häufig an der Robustheit. Eine quantitative Auswertung der NMR-Spektren einer Mischung beider Isomere ist ohne aufwändige Probenvorbereitung möglich. In den 1H-NMR-Spektren der Mischung sind die Signale der Was-serstoffe beider Isomere an Position 2 gut voneinander getrennt. Werden diese quantitativ ausgewertet, dann ist es nach Optimierung insbesondere hinsichtlich der T1-Relaxationszeit möglich, den Anteil des Z-Isomers auf 0,2 % zu begrenzen. Auch für die Bestimmung der Abbauprodukte des Perphenazinenantats konnte gezeigt werden, dass die qNMR eine geeignete Methode darstellt. Perphenazine-nantat kann durch Esterhydrolyse gespalten werden. Zur Auswertung der 1H-NMR-Spektren wird der Vergleich der Integralflächen der Signale der Wasserstoffe an Position 21 des Perphenazins mit dem zusammenfallenden Signal der Wasserstoffe an Position 11 beider Substanzen herangezogen. Es konnte sowohl Perphenazin als Abbauprodukt des Esters als auch Perphena-zinenantat in Perphenazin quantifiziert werden. Zusätzlich kann der Bereich der aromatischen Wasserstoffe zu einer Aussage über die Oxidation genutzt werden. Bei der Oxidation des Schwefels im Phenothiazinring zum Sulfoxid und zum Sul-fon ändern sich die chemischen Verschiebungen der Wasserstoffkerne in diesem Ringsystem. Dadurch wird eine halbquantitative Aussage ermöglicht. Schließlich konnten die beiden Epimere Chinin und Chinidin jeweils als Verunrei-nigung des anderen Chinaalkaloides quantifiziert werden. Auch in diesem Fall lie-gen in den 1H-NMR-Spektren in DMSO-d6 von Mischungen dieser beiden Verbin-dungen Signale weit genug auseinander, um eine Quantifizierung zu ermöglichen. In beiden Fällen, der Bestimmung von Chinidin in Chinin und von Chinin in Chini-din konnte dies auf einem Niveau von 2,5% geschehen, was den Anforderungen der Arzneibücher entspricht. Gentamicinsulfat Die 1H-NMR-Spektroskopie wurde ebenfalls zur Charakterisierung der Zusam-mensetzung des Antibiotkums Gentamicin eingesetzt. Gentamicin, das fermentativ aus Micromonospora purpurea gewonnen wird, besteht aus verschiedenen Haupt- und Nebenkomponenten, deren Zusammensetzung je nach Fermentationsbedingungen schwankt. Nach einer Reihe von Todesfällen im Zusammenhang mit der Anwendung des Antibiotikums Gentamicin in den USA wurde vermutet, dass diese auf verschiede-ne Verunreinigungen zurückzuführen sind. In der aktuellen Arzneibuch-Monographie wird eine HPLC-Methode beschrieben, die zwar die Hauptkomponenten quantifizieren kann, aber nicht alle Nebenkomponenten gut abtrennt. Auch ist die gesamte Elutionszeit sehr lang, so dass spät eluierende Substanzen breite Peaks zeigen. Außerdem ist der benutzte gepulste amperometrische Detektor sehr empfindlich und die Methode insgesamt daher wenig robust. Unter Zuhilfenahme von ein- und zweidimensionalen Standardmesstechniken sowie selektiver TOCSY-Messungen konnten alle Signale in den 1H- und 13C-NMR-Spektren der Haupt- und Nebenkomponenten von Gentamicin vollständig zugeordnet werden. Dabei zeigte sich, dass der Bereich der anomeren Wasserstoffe sehr gut geeignet ist, Aussagen über die Reinheit und über das Verhältnis der Hauptkomponenten zueinander treffen zu können. In dem in der Abbildung gezeigten Ausschnitt aus einem 400 MHz-1H-NMR-Spektrum ist eine Integration der H20-Signale der Hauptkomponenten aufgrund mangelnder Trennung nicht möglich. Diese ist jedoch in 600 MHz-Spektren möglich. Auf diese Weise können die Verhältnisse der Hauptkomponenten zueinander bestimmt werden. Die so erhaltenen Ergebnisse zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den aus einer MEKC-Trennung erhaltenen Daten. Das zeigt die sehr gute Ergänzung dieser beiden Methoden. Insgesamt wurden für diese Arbeit über 40 Gentamicin-Proben verschiedener Hersteller untersucht, miteinander verglichen und in verschiedene Gruppen einge-teilt. Als Leitverunreinigung hat sich dabei Sisomicin erwiesen. Daneben konnte der Vergleich der Verunreinigungsprofile Hinweise auf Handelswege geben. Unter den untersuchten Proben waren auch diejenigen, zu den Todesfällen führten. Die-se konnten den stark verunreinigten Gruppen zugeordnet werden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Fragestellung, ob sich die quantitative NMR-Spektroskopie zur Bestimmung von Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen eignet, und wie sich Präzision und Empfindlichkeit dieser Methode im Vergleich zu etablierten chromatographischen Verfahren verhalten. Die quantitative Untersuchung der drei strukturell jeweils verwandten Mehrkomponentengemische Codergocrinmesilat, Clomifencitrat und Flupentixoldihydrochlorid bewies eindrucksvoll die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie als orthogonale, analytische Messmethode im Vergleich zu validierten HPLC-Arzneibuchmethoden. Die im Rahmen einer Validierung der 1H-NMR-Methode ermittelten Ergebnisse erfüllten bezüglich Präzision und Richtigkeit die an eine im pharmazeutischen Bereich eingesetzte analytische Methode gestellten Anforderungen; zudem wurden weitere Prüfparameter wie Selektivität, Linearität, Robustheit und Stabilität verifiziert. Externe-Standard-Experimente wie "Zwei-Röhrchen-Methode" und ERETIC-Verfahren bestätigten die quantitativen Ergebnisse der Internen Standardisierung; jedoch wurde hier -- insbesondere für die ERETIC-Technik -- eine höhere Fehleranfälligkeit und somit eine größere Streuung der Einzelergebnisse beobachtet. Am Beispiel von Codergocrinmesilat und Flupentixoldihydrochlorid konnte zudem die Eignung anderer NMR-aktiver Kerne wie 13C und 19F für die quantitative Analyse von komplexen Substanzgemischen aufgezeigt werden. Das Potential der 1H-NMR-Spektroskopie für die Reinheitsprüfung von Arzneistoffen wurde am Beispiel der Aminosäure L-Alanin aufgezeigt. Die zu erwartenden Verunreinigungen Glutamin-, Asparagin-, Äpfel- und Fumarsäure konnten im Gegensatz zu den "veralteten" Prüfmethoden des Europäischen Arzneibuches eindeutig identifiziert und quantifiziert werden; mit einer Bestimmungsgrenze von <= 0.03% wurden die Vorgaben der ICH-Richtlinie Q3A(R2) erfüllt. Die deutliche Übereinstimmung der NMR-spektroskopisch ermittelten Ergebnisse einer quantitativ untersuchten Alanin-Modellmischung mit einer für den Routinebetrieb geeigneten HPLC-Methode unter Einsatz verschiedener Detektoren wie CAD, NQAD, ELSD und MS, sowie der Vergleich wichtiger Prüfparameter wie Linearität und Nachweisgrenze bestätigten die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Qualitätskontrolle. Die Aufdeckung von Arzneimittelfälschungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand der zwei aktuellen Fallbeispiele Heparin und Glycerin näher untersucht. Die in Zusammenhang mit dem Heparin-Skandal verantwortliche Kontaminante OSCS konnte neben Dermatansulfat und weiteren natürlich vorkommenden Glykosaminoglykan-Verunreinigungen im 1H-NMR-Spektrum eindeutig identifiziert und auf 0.1% OSCS bzw. 0.5% Dermatansulfat begrenzt werden. Eine präzise und richtige quantitative Bestimmung der beiden Glykosaminoglykane wurde über die N-Acetyl-Resonanzen mit Hilfe der Signalhöhenbestimmung und dem Standard-Additionsverfahren ermöglicht; deutliche Abweichungen vom "wahren" Gehalt wurden hingegen, bedingt durch starke Signalüberlagerungen, nach Flächenvergleich beobachtet. Weitere Verunreinigungen, insbesondere Lösungsmittelrückstände, die während des Extraktions- und Reinigungsprozesses des Heparins eingesetzt werden, konnten ebenfalls über charakteristische Resonanzen identifiziert und mit Hilfe der Internen-Standard-Methode quantitativ erfasst werden. Eine umfangreiche Untersuchung von 145 Heparin-API-Mustern mittels NMR-Spektroskopie und weiteren, neuentwickelten Verfahren wie HPLC, CE, IR- und Raman-Spektroskopie konnte die Eignung der entwickelten 1H-NMR-Methode bestätigen. Potentielle Glycerin-Kontaminanten wie Diethylenglycol und Ethylenglycol konnten ebenso wie eine weitere, natürlich vorkommende Verunreinigung, Propylenglycol, mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie identifiziert und quantifiziert werden. Beide Methoden erfüllten die in der USP beschriebenen Anforderungen, die für pharmazeutisch eingesetztes Glycerin jeweils höchstens 0.1% Diethylenglycol bzw. Ethylenglycol erlaubt. Während die quantitative Reinheitsprüfung beim Einsatz der 1H-NMR-Spektroskopie mit einer Messdauer im Bereich von etwa 30 min für den Routineeinsatz geeignet ist, ist die entwickelte quantitative 13C-NMR-Methode beim Einsatz von Spektrometern geringer Magnetfeldstärke aufgrund einer geringen Nachweisempfindlichkeit und der NOE-Problematik für den Routinebetrieb nur bedingt anwendbar. Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die untersuchten Beispiele die NMR-Spektroskopie als in hohem Maße geeignet für die quantitative Analyse von Arzneimitteln ausweisen.
No abstract available
Spectroscopic methods were established decades ago in a wide variety of fields. This also applies to the pharmaceutical field, although they initially were mostly used for identity testing or structure elucidation only. Technical developments, such as miniaturization (NMR benchtop devices), Fourier transformations (for NMR, MIR spectroscopy) or the combination with chemometric evaluation (e.g., in Process Analytical Technology, PAT), have further increased their importance and opened up new applications. The aim of this work was to investigate further new approaches and to find new applications for already established methods and to show their benefits.
By means of MIR, NIR and NMR data and their chemometric evaluation (principal component analysis, PCA; hierarchical cluster analysis, HCA; linear discriminant analysis, LDA), possibilities were presented to successfully determine the manufacturer or the pharmaceutical company of various paracetamol preparations. In the course of this, various similarities and correlations between the preparations of individual companies could also be identified. For this purpose, a suitable sample preparation was developed for each spectroscopic method, and suitable measurement parameters in order to obtain reproducible spectra for the chemometric evaluation were determined. Furthermore, the results of the two unsupervised methods (HCA, PCA) were compared with each other. The HCA was able to confirm those of the PCA for the very most part. Additionally, through these methods it was possible to characterize many of the preparations based on clusters formed by comparable tablet compositions.
In order to be able to measure unmortared, whole tablets using the NIR spectrometer, an attachment was developed and manufactured using 3D printing. Its functionality was demonstrated by measuring and analyzing the tablets of two different batches of nine paracetamol preparations. The batches were clearly distinguished on the basis of a PCA and a significant difference was also demonstrated by means of statistical tests.
For NMR spectroscopy, a method was developed to obtain optimized "fingerprint" spectra of drug formulations. For this purpose, a 1D DOSY measurement was elaborated, in which the signals of the active ingredient could be filtered out by the appropriate choice of measurement parameters. The chemometric evaluation can thus focus on the remaining signals of the excipients, on the basis of which the preparations of the same API can be distinguished. Especially in the case of formulations that consist largely of active ingredient, data pre processing of the spectra can thus be simplified and greater importance can be assigned to the originally very small excipient signals.
A quantitative 1H NMR method was developed for the comparison of a high field spectrometer (400 MHz) with a benchtop spectrometer (80 MHz) for two finished drugs. It was shown that it is possible to obtain comparable results with both instruments, but that the influence of the excipients on the signals and the lower resolution of the benchtop instrument must be taken into account. Therefore, it was not possible to obtain comparable results without further optimization of the method for one of the active ingredients.
In the investigation of various reactions between APIs and excipients using DOSY, its usefulness as a screening method in stability testing was demonstrated. For this purpose, three different APIs and excipients were stressed together and the reaction mixtures were subsequently measured using DOSY. Based on the translational diffusion coefficient, the reaction products could be identified and distinguished from the active ingredients and the excipients used. The importance of thoughtful processing could also be demonstrated. If all peak heights are selected when evaluating signals split by direct spin spin coupling, this allows the detection of hidden signals as long as not all signals have the same diffusion coefficient. The selective selection of individual peak heights in the case of split signals also enables the evaluation of signals that overlap slightly. However, the limitations of this method were also shown when two signals overlap too much and differ too little in their diffusion coefficients.
Hence, it has been successfully demonstrated in the various projects that the new chemometric approaches, as well as the new applications of already established methods, enable in depth findings and thus have a clear added value.
Nuclear magnetic resonance has numerous applications for in vivo diagnostics. However, methods requiring homogeneous magnetic fields, particularly magnetic resonance spectroscopy (MRS) techniques, have limited applicability in regions near or on anatomical boundaries that cause strong inhomogeneities. In cases where the shim system can not or just partly correct for these inhomogeneities, methods based on intermolecular multiple quantum coherence (iMQC) detection can provide an alternative solution for in vivo MRS. This dissertation presented the development, validation and application potential of a novel MRS pulse sequence detecting intermolecular zero-quantum coherences (iZQC) with special emphasis on in vivo experiments. In addition, the detection limit and spectral behaviour of iZQC-MRS under modelled realistic conditions were systematically approached for the first time. Based on the original sequence used to detect two dimensional (2D) iZQC-spectra, dubbed HOMOGENIZED, methodological development led to increased sensitivity and water suppression, and decreased T2-relaxation effects through the application of a frequency selective 90° RF-pulse in place of a non selective beta-pulse. Best water suppression was achieved by placing a pair of selective refocusing units immediately prior to the acquisition window. The same placement was found to be optimal also for single voxel localization units based on slice selective spin echo refocusing. By voxel selection before the iZQC-MRS sequence, the chemical shift artefact could be avoided. However, this led to significant residual signal from outside the voxel. Analytical derivations of signal evolution for several sequences presented in this dissertation provide useful additions to the iZQC MRS theory. In vivo applications of the developed sequence provided high quality spectra in the central nervous system of the rat, the mouse brain and in subcutaneous xenograft tumor grown on the thigh of the mouse. In all these 2D spectra, the limiting factor of the resolution in the indirect dimension was the digital sampling rate, rather than inhomogeneous line broadening. Nevertheless, linewidths of the cross-peaks were similar or narrower than along the direct axis, where the sampling rate was about ten times higher. The first MR spectroscopic investigation of the rat spinal cord at 17.6 T was performed. Through its insensitivity to macroscopic field inhomogeneities, the localized iZQC method allowed for the selection of larger voxels than conventional methods and still provided the same spectral resolution. This property was used also in tumor tissue to propel the relative signal to noise (SNR) efficiency of the iZQC spectroscopy for the first time above the SNR efficiency of a conventional sequence. Future applications for fast metabolite count in large inhomogeneous organs, like a tumor, are thinkable. Extensive simulations and phantom experiments assessed the limit of iZQC cross-peak detection in presence of local field distortions. The order of maximum volume ratio between dipole source and voxel was found to be between 0.1 % and 1 %. It is an essential conclusion of this study that the dominant effect of microscopic to mesoscopic inhomogeneities on iZQC spectra under general in vivo conditions, like for voxels greater than (1 mm)³ and metabolite concentrations in the millimolar range, is a cross-peak intensity reduction and not line broadening. The iZQC method provided resolution enhancement in comparison to conventional MRS even in the presence of clustered paramagnetic microparticles. However, the vision of iZQC spectroscopy in green leafs or the lung epithelium has to be, unfortunately, abandoned, because cross-peaks can be observed until the volume of the separating medium is much larger than the volume of local dipole sources. Intermolecular zero-quantum coherence spectroscopy remains an exciting field in NMR research on living organisms. It provides access to the monitoring of relative metabolite concentration changes in the presence of microscopic iron particles, which raises realistic hopes for new applications in studies using stained stem cells.