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Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung der Haut. Ein wesentliches Charakteristikum der Erkrankung sind Autoantikörper, welche gegen die humanen Zell-Adhäsionsmoleküle Desmoglein (Dsg) 3 und 1 gerichtet sind und zu zunehmender Zell-Dissoziation der Keratinozyten führen (Akantholyse). Neben der Dsg3-Reorganisation sind zytoskelettale Veränderungen in Form einer ZK-Retraktion und einer Reorganisation des Actin-Zytoskeletts als ein wichtiges Merkmal akantholytischer Zellen beschrieben worden. Dennoch ist der zeitliche Verlauf und die funktionelle Relevanz dieser zytoskelettalen Veränderungen im Vergleich zu anderen Prozessen, wie der Dsg3-Reorganisation oder der Zell-Dissoziation, unklar. In dieser Arbeit wurde daher die Rolle der ZK-Filamente und der Actinfilamente für die PV-Pathogenese untersucht. Inkubation von kultivierten Keratinozyten mit PV-IgG resultierte in einer ZK-Retraktion, welche eng mit dem Beginn der Dsg3-Reorganisation und der Zell-Dissoziation korrelierte. Weiterhin fand sich eine Abhängigkeit der PV-IgG-induzierten ZK-Retraktion und der Zell-Dissoziation von der p38MAPK-Signalkaskade, während die Beteiligung der p38MAPK an der Dsg3-Reorganisation von untergeordneter Rolle zu sein scheint. Übereinstimmend dazu führte eine Überexpression von E-Cadherin zu einer Hemmung der p38MAPK-Aktivierung, der ZK-Retraktion und der Zell-Dissoziation, so dass den Cadherinen eine übergeordnete Rolle in der Vermittlung der PV-Pathogenese zuzukommen scheint. Neben einer ZK-Retraktion zeigten die Zellen als Reaktion auf eine Inkubation mit PV-IgG auch wesentliche Reorganisationen der Actinfilamente, welche ebenfalls eng mit der Dsg3-Reorganisation und der Zell-Dissoziation korrelierten. Darüber hinaus interferierte die pharmakologische Modulation des Actin-Zytoskeletts mit den PV-IgG-Effekten. So führte eine Stabilisierung der Actinfilamente zu einer Reduktion sowohl der Dsg3-Reorganisation als auch der Zell-Dissoziation, während eine Zerstörung der Filamente die Effekte verstärkte. Zur Unterstützung dieser Ergebnisse wurde die Rolle des Actins für die durch Rho-GTPasen vermittelte Hemmung von PV-IgG-Effekten untersucht. Eine Aktivierung der Rho-GTPasen führte neben einer Hemmung PV-IgG-vermittelter Effekte auch zu einer Verstärkung des kortikalen Actin-Rings, während eine Hemmung der Actin-Polymerisation die protektiven Effekte der Rho-GTPasen-Aktivierung aufheben konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit eine übergeordnete Rolle sowohl der desmosomalen als auch der klassischen Cadherine für die PV-Pathogenese zeigen. Daneben scheint auch der Actin-Reorganisation eine wesentliche Position zuzukommen. Die ZK-Retraktion hingegen scheint, zumindest im Bezug auf die Dsg3-Reorganisation, sekundär zu sein, trägt aber möglicherweise im Anschluss an eine p38MAPK-Aktivierung wesentlich zum Verlust der Zell-Zell-Adhäsion bei.
Spir proteins are the founding members of the novel class of WH2-actin nucleators. A C-terminal modified FYVE zinc finger motif is necessary to target Spir proteins towards intracellular membranes. The function and regulation of the Spir actin organizers at vesicular membranes is almost unknown. Live cell imaging analyses performed in this study show that Spir-2 is localized at tubular vesicles. Cytoplasmic Spir-2-associated vesicles branch and form protrusions, which can make contacts to the microtubule network, where the Spir-2 vesicles stretch and slide along the microtubule filaments. The analysis of living HeLa cells expressing eGFP-tagged Spir-2, Spir-2-ΔKIND and Spir-2-ΔKW (lacking the 4 WH2 domains and the KIND domain) showed Spir-2-associated tubular structures which differ in their length and motility. Throughout the course of that study it could be shown that the tail domain of the actin motor protein myosin Vb, as a force-generating molecule, is colocalizing and co-immunoprecipitating with Spir-2-ΔKW. By using the tail domain of myosin Vb as a dominant negative mutant for myosin Vb-dependent vesicle transport processes it could be shown that Spir-2-ΔKW/MyoVb-cc-tail- associated vesicles exhibit an increased elongation. Moreover, using the microtubule depolymerizing drug nocodazole it could be shown that the elongation and the motility of Spir-2-ΔKW-associated vesicles depends on an intact microtubule cytoskeleton. Motility and morphological dynamics of Spir-2-associated vesicles is therefore dependent on actin, actin motorproteins and microtubule filaments. These results propose a model in which myosin/F-actin forces mediate vesicle branching, allowing the vesicles to move to and in between the microtubule filaments and thereby providing a new degree of freedom in vesicular motility. To determine the exact subcellular localization of Spir-2, colocalization studies were performed. It could be shown that Spir-2 shows a partial colocalization to Rab11a-positive compartments. Furthermore, Spir-2 exhibits an almost identical localization to Arf1 and the Arf1 small G protein but not Rab11a could be immunoprecipitated with Spir-2-ΔKW. This suggests, that Arf1 recruits Spir-2 to Arf1/Rab11a-positive membranes. Another important function of the Spir-2 C-terminus is the membrane targeting by the FYVE domain. By performing a protein-lipid overlay assay, it has been shown that purified GST- and 6xHis-tagged Spir-2-ΔKW bind phosphatidic acid suggesting a mechanism in which Spir-2 is recruited to phosphatidic acid-enriched membranes. To further elucidate the mechanism in which Spir-2 membrane-targeting could be regulated, interaction studies of C-terminal parts of Spir-2 revealed that the Spir-2 proteins interact directly.
Bei Yeast Two-Hybrid Untersuchungen wurde in unserer Arbeitsgruppe das RNA-Bindungsprotein hnRNP-R als Interaktionspartner von SMN gefunden und es konnte gezeigt werden, dass hnRNP-R mit SMN in Axonen von primären Motoneuronen kolokalisiert (Rossoll et al., 2002). hnRNP-R assoziiert mit der β-Aktin mRNA und nach Überexpression kommt es zu einer Akkumulation von β-Aktin in den Wachstumskegeln von neuronalen Zellen, sowie zu verstärktem Neuritenwachstum bei PC12 Zellen. Wird die SMN-Bindungsdomäne von hnRNP-R deletiert, ist dieser Effekt stark reduziert (Rossoll et al., 2003). Auf diesen in vitro Befunden ist die Hypothese begründet, dass hnRNP-R an der Translokation der β-Aktin mRNA in die Wachstumskegel von neuronalen Zellen beteiligt ist. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit die Rolle von hnRNP-R bei der Entwicklung in Neuronen des Nervensystems näher untersucht. Dazu wurden Zebrafisch Embryonen als in vivo Modellsystem für Morpholino vermittelte Knockdown Untersuchungen gewählt. Zunächst wurde ein gegen murines Protein hergestelltes hnRNP-R Antiserum charakterisiert und gezeigt, dass es das Zebrafisch Protein spezifisch erkennt. Dieses Antiserum wurde in Western Blot Analysen verwendet um den hnRNP-R Knockdown in Zebrafisch Embryonen zu verifizieren. Bei den hnRNP-R Morpholino injizierten Embryonen konnten dosisabhängig axonale Veränderungen beobachtet werden. Diese Veränderungen stimmen mit einem Krankheitsmodell für SMA im Zebrafisch überein. Es konnte gezeigt werden, dass das Überleben primärer Motoneurone in Zebrafisch Embryonen nicht beeinträchtigt ist und dass andere neuronale Zellen keine signifikante Beeinflussung durch einen hnRNP-R Knockdown erfahren. Um die Spezifität des axonalen Phänotyps, der durch hnRNP-R Knockdown hervorgerufen wurde zu belegen, wurde mit muriner hnRNP-R mRNA ein Rescue-Experiment durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass dabei der axonale Phänotyp weitestgehend wieder aufgehoben wurde. Parallel zu den Zebrafisch Experimenten wurde ein hnRNP-R Knockout Konstrukt mittels homologer Rekombination in Escherichia coli hergestellt und in murine embryonale Stammzellen elektroporiert. Die Charakterisierung einer hnRNP-R Knockout Maus könnte weitere bedeutende Einsichten in die in vivo Funktionen von hnRNP-R bei der Embryonalentwicklung und speziell der Entwicklung von Motoneuronen gewähren. Um der Frage nach zu gehen, welche mRNAs in Wachstumskegeln von Axonen primärer Maus Motoneuronen zu finden sind oder durch Transportprozesse lokal akkumuliert sind,wurden Versuche unternommen, um mittels Laser-Mikrodissektion einzelne Wachstumskegel von Motoneuronen für Untersuchungen der enthaltenen mRNAs zu gewinnen. Erstmalig ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, kompartimentalisierte Kulturen von primären Motoneuronen der Maus zu etablieren. Damit wurde die Grundlage geschaffen, um RNA-Profile von distalen Zellkompartimenten wie den Axonen und Wachstumskegeln zu bestimmen.