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Immunologische Gedächtnisreaktionen sind die Grundlage um wiederkehrende Erreger schnell und effizient zu bekämpfen und um einen Impfschutz zu generieren. Das zellvermittelte Gedächtnis wird unter anderem durch CD8 Gedächtnis-T-Zellen aufgebaut, welche vor allem im Kontext von Immunreaktionen gegen intrazellulärer Erreger vonnöten sind, um bei Reinfektion mit den Erregerstämmen einen schnellen Schutz zu gewährleisten. Ein detailliertes Wissen über die Generierung, Kontrolle und Reaktivierung der Gedächtniszellen ist nützlich, um Gedächtnisreaktionen verstehen und lenken zu können. Durch die Entdeckung des TZR und CD28 wurden Meilensteine für das Verständnis der T-Zellaktivierung gelegt und die Grundlage geschaffen, CD8 Gedächtnisreaktionen zu verstehen. Auch wenn für primäre Immunreaktionen die „2-Signal-Theorie“ lange als erwiesen gilt, so blieb die Rolle der Kostimulation für Gedächtnisreaktionen lange umstritten. In dieser Arbeit wurden verschiedene methodische Herangehensweisen verwendet, mit denen durchgehend die Bedeutung von CD28 vermittelter Kostimulation für immunologische CD8 T-Zell-Gedächtnisreaktionen nachgewiesen wurde. CD28 blockierende Antikörper und CD28 induzierbar deletierbare Mauslinien wurden im Modellinfektionssystem mit Ovalbumin produzierenden Listeria monocytogenes zur Analyse der Primär- und Sekundärantworten verwendet. Mit diesen Methoden konnte eine Beeinträchtigung der Expansion von CD8 Gedächtniszellen in Abwesenheit von CD28 bewiesen werden. Weiterhin werden Effektorfunktionen wie Degranulation und Produktion von IFN-γ während der Sekundärinfektion in Abwesenheit von Kostimulation eingeschränkt. Mit Hilfe von Experimenten, bei denen CD28 suffizienten Mäusen eine geringe Anzahl an naiven, antigenspezifischen, CD28 deletierbaren CD8 T-Zellen transferiert wurden, wurde die Bedeutung der Kostimulation für die Expansion von Gedächtniszellen bestätigt, jedoch konnte überraschenderweise auch ein Anstieg der Effektorfunktionen in Abwesenheit von CD28 sowohl während der Primär- als auch der Sekundärantwort dokumentiert werden. Diese zur globalen Blockade bzw. Deletion widersprüchlichen Ergebnisse lassen eine Beteiligung anderer CD28 abhängiger Zelltypen an der Induktion der Effektorfunktionen der CD8 T-Zellen plausibel erscheinen, wie zum Beispiel Einflüsse von T-Helferzellen, welche die Effektorfunktionen positiv verstärken, solange sie selbst Kostimulationssignale empfangen können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich Gedächtniszellen an den CD28 defizienten Phänotyp – eine CD28 intakte immunologische Umgebung vorausgesetzt – adaptieren können, wenn ausreichend Zeit nach Deletion und vor Sekundärinfektion verstreichen konnte.
In Ratten und Mäusen aktiviert der superagonistische anti-CD28 monoklonale Antikörper (CD28SA) vorzugsweise regulatorische T-Zellen. In niedriger Dosierung führt CD28SA zu einer fast ausschließlichen Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Diese Beobachtung konnte inzwischen auch für menschliche Zellen in Zellkultur bestätigt werden.
In gesunden und freiwilligen Testpersonen deutet die Zytokin-Antwort nach Applikationen von niedrigen CD28SA-Dosen darauf hin, dass sich diese Beobachtung auch in-vivo bewahrheitet. Eine Gabe von CD28SA in niedriger Dosierung, die zu einer exklusiven Aktivierung von regulatorischen T-Zellen führt, könnte somit in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder von entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden.
Eine mechanistische Erklärung für dieses Phänomen blieb lange Zeit unklar. Die CD28SA-vermittelte T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Verstärkung von basalen tonischen Signalen, die T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor erhalten. Diese Tatsache führte zu der Hypothese, dass die schwachen, tonischen Signale, die konventionelle CD4+ T-Zellen in Abwesenheit ihrer spezifischen Antigene über den T-Zell-Rezeptor erhalten, ein stärkeres CD28 Signal für ihre Aktivierung benötigen als die selbstreaktiven regulatorischen T-Zellen, die ein stärkeres Selbstpeptid-TCR Signal erhalten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blockade von MHC-Klasse-II-Molekülen in Mäusen, in-vitro und in-vivo, den Vorteil der regulatorischen T-Zellen gegenüber den konventionellen T-Zellen bezüglich der Antwort auf niedrige CD28SA Dosierungen, aufhebt.
Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine ntscheidende Rolle beim Erhalt der Immunhomöostase und bei der Kontrolle überschießender Immunantworten. Sie können anhand ihres Entstehungsortes in im Thymus generierte natürliche Tregs (nTregs) und in der Peripherie generierte induzierte Tregs (iTregs) unterteilt werden. Ihr Phänotyp wie auch ihre Funktion werden zu einem großen Teil durch den transkriptionellen Masterregulator Foxp3 kontrolliert. Das kostimulatorische Molekül CD28 wird von nTregs für die Differenzierung benötigt und von Tregs und konventionellen T-Zellen (Tkons) für ihre Aktivierung. Superagonistische CD28 spezifische monoklonale Antikörper (CD28SA) aktivieren T-Zellen im
Gegensatz zu konventionellen anti-CD28 Antikörpern ohne zusätzliche Ligation des T-Zellrezeptors. Die in vivo Applikation des CD28SA bewirkt eine starke Aktivierung der
Tregs und eine präferentielle Expansion der Tregs gegenüber Tkons. Dies erklärt die präventive und therapeutische Wirkung der CD28SA Behandlung in verschiedenen Krankheitsmodellen bei Nagern. Die erste Anwendung des humanisierten CD28SA TGN1412 führte in den Testpersonen jedoch zu einem unerwarteten „Cytokine-Release Syndrom“. Daher wurde hier am Mausmodell der Zusammenhang zwischen Treg Aktivierung und systemischer Zytokinausschüttung näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CD28SA vermittelte Proliferation der T-Zellen abhängig vom CD28 Signal und von parakrinem
Interleukin (IL)-2 ist. Durch die in vivo Depletion der Tregs vor der CD28SA Injektion wurde deutlich, dass es auch in Mäusen nach CD28SA Stimulation zu einer systemischen Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine kommt, die jedoch, im Gegensatz zum humanen System, von Tregs effektiv kontrolliert werden kann. Um die usschüttung pro-inflammatorischer Zytokine zu verhindern, wäre eine zusätzliche prophylaktische Behandlung
mit Corticosteroiden möglich, da diese auch in hohen Dosen die CD28SA vermittelte Aktivierung und Expansion der Tregs nicht beeinflussen. Neben der Expansion wird durch die Stimulation mit CD28SA auch die Produktion des
anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in Tregs induziert und so eine genauere Untersuchung des Ursprungs und des Schicksals IL-10 produzierender Tregs ermöglicht. Diese
Tregs exprimieren im Vergleich zu IL-10 negativen Tregs ein höheres Niveau an Molekülen, die mit einer supprimierenden Aktivität verbunden sind. Zudem werden IL-10 Produzenten aufgrund der Veränderung im Expressionsmuster der Migrationsrezeptoren nach der Stimulation von einem lymphknotensuchenden CCR7+CCR5-CCR6- zu einem entzündungssuchenden CCR7-CCR5+CCR6+ Phänotyp verstärkt in Bereiche mit stattfindender Immunantwort rekrutiert. Schließlich sind IL-10 produzierende Tregs von CD28SA stimu2 lierten Mäusen in vitro stärker apoptoseanfällig als die IL-10 negativen Tregs. Die
Aktivierung der Tregs scheint somit die terminale Differenzierung zu einem IL-10 produzierenden
Effektorphänotyp mit begrenzter Lebensdauer zu induzieren. Dies führt auch zur Beendigung der Immunsuppression. Die Kombination aus schwachem TZR und starkem CD28 Signal, die die CD28SA Stimulation
in naiven T-Zellen auslöst, induziert zumindest in vitro abhängig von IL-2 und TGFβ effizient die Expression von Foxp3. Die so generierten iTregs haben, ähnlich wie konventionell in vitro erzeugte iTregs, in Bezug auf die Expression von Oberflächenmolekülen und den Methylierungsstatus bestimmter Regionen des Foxp3 Gens einen Phänotyp, der zwischen dem von Tkons und Tregs liegt. Da auch die supprimierende Aktivität der iTregs
geringer ist als die der ex vivo Tregs bedarf es einer weiteren Optimierung des Stimulationsprotokolls,
um diese Zellen für therapeutische Zwecke verwenden zu können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls ein vielseitig einsetzbares Instrument ist. Einerseits können durch die CD28SA Stimulation Tregs polyklonal aktiviert und für therapeutische Zwecke mobilisiert werden
und andererseits kann die besondere Art der T-Zellstimulation auch dazu genutzt werden, neue Aspekte von nTregs und iTregs zu untersuchen.
Stimulatory or superagonistic (SA) CD28-specific monoclonal antibodies (mAbs) are potent polyclonal activators of regulatory T cells and have proven highly effective as treatment in a wide range of rodent models for autoimmune and inflammatory diseases. In these models, a preferential activation of regulatory T cells was observed by in vivo administration of CD28SA. In stark contrast, human volunteers receiving TGN1412, a humanized CD28-specific mAb, experienced a life-threatening cytokine release syndrome during the first-in-man trial. Preclinical tests employing human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) failed to announce the rapid cytokine release measured in the human volunteers in response to TGN1412. The aim of this thesis project was to find an explanation of why standard PBMC assays failed to predict the unexpected TGN1412-induced "cytokine storm" observed in human volunteers. CD28 superagonists can activate T cells without T cell receptor (TCR) ligation. They do depend, however, on “tonic” TCR signals received by MHC scanning, signals that they amplify. PBMC do not receive these signals in the circulation. Short-term in vitro preculture of human PBMC at a high cell density (HDC) resulted in massive cytokine release during subsequent TGN1412 stimulation. Restoration of reactivity was cell-contact dependent, associated with TCR polarization and tyrosine-phosphorylation, and blocked by HLA-specific mAb. In HDC, both CD4 T cells and monocytes functionally mature in a mutually dependent fashion. However, only CD4 memory T-cells proliferate upon TGN1412 stimulation, and were identified as the main source of pro-inflammatory cytokines. Importantly, responses to other T-cell activating agents were also enhanced if PBMC were first allowed to interact under tissue-like conditions. A new in vitro protocol is provided that returns circulating T-cells to a tissue-like status where they respond to TGN1412 stimulation, and it might represent a more reliable preclinical in vitro test for both activating and inhibitory immunomodulatory drugs. Finally, the surprising observation was made that the IgG1 “sibling” of TGN1412, which is of the poorly Fc receptor-binding IgG4 isotype, has a much lower stimulatory activity. We could exclude steric hindrance as an explanation and provide evidence for removal of TGN1112 from the T-cell surface by trans-endocytosis.
Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung.
Hematopoietic stem cell transplantation is a curative therapy for malignant diseases of the haematopoietic system. The patients first undergo chemotherapy or irradiation therapy which depletes the majority of tumour cells before they receive the transplant, consisting of haematopoietic stem cells and mature T cells from a healthy donor. The donor T cells kill malignant cells that have not been eliminated by the conditioning therapy (graft versus leukaemia effect, GvL), and, therefore, are crucially required to prevent relapse of the tumour. However, the donor T cells may also severely damage the patient’s organs causing acute graft versus host disease (aGvHD). In mice, aGvHD can be prevented by interfering with the co-stimulatory CD28 signal on donor T cells. However, experimental models using conventional CD28 knockout mice as T cell donors or αCD28 antibodies have some disadvantages, i.e. impaired T cell development in the thymus of CD28 knockout mice and systemic CD28 blockade with αCD28 antibodies. Thus, it remains unclear how CD28 co-stimulation on different donor T cell subsets contributes to the GvL effect and aGvHD, respectively.
We developed mouse models of aGvHD and the GvL effect that allowed to selectively delete CD28 on certain donor T cell populations or on all donor T cells. CD4+ conventional T cells (Tconv cells), regulatory T cells (Treg cells) or CD8+ T cells were isolated from either Tamoxifen-inducible CD28 knockout (iCD28KO) mice or their wild type (wt) littermates. Allogeneic recipient mice were then transplanted with T cell depleted bone marrow cells and different combinations of iCD28KO and wt T cell subsets. Tamoxifen treatment of the recipients caused irreversible CD28 deletion on the iCD28KO donor T cell population. In order to study the GvL response, BCL-1 tumour cells were injected into the mice shortly before transfer of the T cells.
CD4+ Tconv mediated aGvHD was efficiently inhibited when wt Treg cells were co-transplanted. In contrast, after selective CD28 deletion on donor Treg cells, the mice developed a late and lethal flare of aGvHD, i.e. late-onset aGvHD. This was associated with a decline in iCD28KO Treg cell numbers around day 20 after transplantation. CD28 ablation on either donor CD4+ Tconv cells or CD8+ T cells reduced but did not abrogate aGvHD. Moreover, iCD28KO and wt CD8+ T cells were equally capable of killing allogeneic target cells in vivo and in vitro. Due to this sufficient anti-tumour activity of iCD28KO CD8+ T cells, they had a therapeutic effect in our GvL model and 25% of the mice survived until the end of the experiment (day 120) without any sign of the malignant disease. Similarly, CD28 deletion on all donor T cells induced long-term survival. This was not the case when all donor T cells were isolated from wt donor mice. In contrast to the beneficial outcome after CD28 deletion on all donor T cells or only CD8+ T cells, selective CD28 deletion on donor CD4+ Tconv cells completely abrogated the GvL effect due to insufficient CD4+ T cell help from iCD28KO CD4+ Tconv cells.
This study demonstrates that therapeutic inhibition of the co-stimulatory CD28 signal in either all donor T cells or only in CD8+ T cells might protect patients from aGvHD without increasing the risk of relapse of the underlying disease. Moreover, deletion of CD28 on donor Treg cells constitutes a mouse model of late-onset aGvHD which can be a useful tool in aGvHD research.