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Sonstige beteiligte Institutionen
In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Applikation von Glutamat zur transienten Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration sowie zu einer Depolarisation der Plasmamembran von Mesophyllzellen führt. Pharmakologische Studien weisen auf mögliche Orthologe tierischer ionotroper Glutamatrezeptoren (iGLuRs) hin. Ziel dieser Arbeit war eine vertiefte molekulare und funktionelle Analyse der Glutamatrezeptoren (GLRs) aus Arabidopsis thaliana. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: i. Zugabe von extrazellulärem Glutamat in Kombination mit Glycin führt in Abhängigkeit der extrazellulären ATP-Konzentration (eATP) zu einer transienten Erhöhung der Calciumkonzentration in Mesophyllzellen. ii. Die Reaktion von Mesophyllprotoplasten auf die Applikation von Glutamat und Glycin ist im Vergleich zum intakten Blatt stark reduziert, kann jedoch in Gegenwart von eATP oder Glucose signifikant gesteigert werden. iii. Diese Responsibilität von Mesophyllprotoplasten ist zum Zeitpunkt des Einsetzens der Zellwandsynthese (48h) am höchsten. iv. In Patch-Clamp Experimenten führt die photolytische Freisetzung von extrazellulärem caged-Glutamat bei 34 % der gemessenen A. thaliana Mesophyllprotoplasten zu einem verstärkten Kationentransport über die Plasmamembran. Dieser Kationenstrom kann durch gleichzeitige Anwesenheit von extrazellulärem ATP noch verstärkt werden und ist durch einen Desensitivierungsprozess gekennzeichnet. Die Empfindlichkeit dieser Ströme gegenüber Antagonisten tierischer iGluRs stellt eine Verbindung zu der Genfamilie der AtGLRs dar. v. Coexpressionexperimente ausgewählter AtGLRs geben erste Hinweise auf eine Homo- bzw. eine Heteromerbildung von AtGLR1.1 und AtGLR1.4. Aufgrund fehlender Kanalaktivität konnten einzelne, in Oozyten exprimierte AtGLRs bislang nicht funktionell charakterisiert werden. vi. Studien zur transienten und stabilen Überexpression im homologen Expressionssystem zeigen einen cytotoxischen Effekt bei funktioneller Überexpression ausgewählter AtGLRs. vii. Die Analyse der Stellung des Glutamatrezeptors 3.4 in kälteregulierten Signalnetzwerken via Microarrays weist auf ein überlappendes Aufgabenspektrum der Familie der AtGLRs hin. viii. Im Rahmen von Microarray Transkriptionsanalysen an der glr3.4-1 Mutante konnte ein bisher nicht charakterisiertes, co-reguliertes Protein identifiziert werden. Dieses Protein ist durch den Besitz einer transmembranen Region sowie einer ATP-Bindedomäne charakterisiert und könnte einen möglichen Regulator des AtGLR3.4-Kanals darstellen. ix. Die Überprüfung einer möglichen Beteiligung der pflanzlichen Glutamatrezeptoren an der Generierung der glutamatabhängigen Ca2+-Signale sowie die Suche nach Regulatoren bzw. fehlenden Untereinheiten erfolgte mithilfe Mutanten-„Sreenings“. Die Analyse der bis dato identifizierten, Glutamat-insensitiven Mutanten konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden.
Um sich vor dem Austrocknen zu schützen, haben Pflanzen eine Transpirationsbarriere entwickelt, die als Membran alle primären, oberirdischen Pflanzenteile überzieht. Diese so genannte Kutikula besteht hauptsächlich aus den lipophilen Komponenten Kutin und Wachs und reduziert so effektiv den Verlust von Wasser und wasserlöslichen Nährstoffen aus dem Blattinneren. Trotzdem ist sie nicht vollständig undurchlässig, und so können Wasser und gelöste Substanzen wie organische und anorganische Nährstoffe, Pestizide oder Umweltchemikalien die Kutikula in beiden Richtungen permeieren. Dabei ist offensichtlich, dass die zu Grunde liegenden Transportmechanismen den Ernährungszustand der Pflanzen, die Effizienz von Pestiziden und die Wirkung von Umweltchemikalien beeinflussen. Ein genaues Verständnis der Transportprozesse auf denen die kutikuläre Permeation basiert, kann helfen die Wirkweise von blattapplizierten Dünge- und Pflanzenschutzmitteln zu optimieren, indem gezielt Wirk- oder Zusatzstoffe modelliert werden können, welche die Aufnahme steigern. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb der Einfluss physiko-chemischer Eigenschaften von hydrophilen Verbindungen auf die kutikuläre Permeation untersucht werden. Nicht zuletzt wegen ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit den blattapplizierten Herbiziden Glufosinat und Glyphosat wurden Aminosäuren als Modellsubstenzen ausgewählt. Die verwendeten Aminosäuren sind gut wasserlöslich, wobei alle Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten kleiner als 1 sind. Zusätzlich liegen alle Aminosäuren in gelöster Form als Ionen vor, was zu einer Hydratisierung der Moleküle führt. Es wird spekuliert, dass hydratisierte Moleküle keinen Zugang zur lipophilen Phase der Kutikula haben. Welche Rolle die Hydrathülle bei der Permeation tatsächlich spielt, ist allerdings noch unklar. Viele Aktivwirkstoffe liegen nur unter ganz bestimmten Bedingungen in geladener Form vor, während die Richtung der kontinuierlichen Nettoladung der Aminosäuren durch den pH Wert modifiziert wird. Damit kann der Einfluss verschiedener Ladungszustände auf die kutikuläre Permeation unter Verwendung eines einheitlichen Sets von Modellsubstanzen untersucht werden. Unter natürlichen Bedingungen sind Aminosäuren unter anderem auf Blattoberflächen zu finden, wo sie blattassoziierten Mikroorganismen eine profitable Nahrungsquelle bieten. Ob äußere Faktoren für die Deposition dieser Recourcen verantwortlich sind, oder ob der Ursprung innerhalb des Blattgewebes liegt, wird kontrovers diskutiert. Die Sorption von Aminosäuren in isolierte Kutikularmembranen ist sehr gering, und korreliert - anders als bei lipophilen Substanzen - nicht mit dem Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten. Das zeigt, dass der Verteilung von lipophilen und hydrophilen Substanzen innerhalb der Kutikula verschiedene Mechanismen zu Grunde liegen. Unter einer gegebenen Bedingung werden die kutikulären Leitwerte der Aminosäuren negativ vom Molvolumen beeinflusst. Zudem übersteigt die Länge des Permeationswegs die eigentliche Dicke der Membran um ein Vielfaches. Diese Zusammenhänge kennzeichnen eine gehinderte Diffusion innerhalb einer engporigen und weit verzweigten Umgebung. Eine Änderung des pH Wertes wirkt sich in unterschiedlicher Form auf die Leitwerte von Wasser und Aminosäuren aus. Mit steigendem pH Wert erhöht sich die Wasserpermeabilität isolierter Kutikularmembranen, was durch eine zunehmende, messbare Wassersorption in die Kutikula erklärt werden kann. Eine pH abhängige Dissoziation funktioneller Gruppen bewirkt eine Schwellung des polaren Weges, weshalb auch für die anionischen Aminosäuren bei pH 11 die höchsten Leitwerte gemessen wurden. Die zwitterionischen Aminosäuren bei pH 6 wiesen hingegen die geringsten Leitwerte auf, was im Widerspruch zu der Beobachtung steht, dass bei pH 1 die geringste Wassersorption in die Kutikula stattfindet. Eine Erklärung hierfür liefern die Hydrathüllen, die bei den zwitterionischen Aminosäuren am stärksten und bei den anionischen Species am geringsten ausgeprägt sind. Eine negative Korrelation aller gemessenen Aminosäureleitwerte mit den entsprechenden hydratisierten Molvolumen zeigt eindeutig, dass die Hydrathülle eine wichtige Größe für die Permeation durch die Kutikula darstellt. Dabei nimmt der Leitwert einer hydrophilen Substanz mit definiertem Molvolumen mit kleiner werdender Hydrathülle zu. Intakte Blätter wurden in flüssiges Wasser als Rezeptorlösung getaucht, um steady-state Bedingungen aufrecht zu erhalten. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Permeabilitäten von intakten Kutikularmembranen, die anhand der natürlichen Aminosäurekonzentration innerhalb der Blätter bestimmt wurden, in derselben Größenordnung liegen, wie die für isolierte Membranen gemessenen. Außerdem konnte ein Vergleich der Flussraten auf der Ober- und Unterseite der Blätter zeigen, dass die stomatären Poren nicht direkt in den Leachingprozess involviert sind.
Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in höheren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette für WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht möglich. Demgegenüber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch für stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen bestätigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der Überexpression eine starke Überladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis für einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotentialänderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkanäle führen könnte. Für die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden. Transkriptionelle Änderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakblättern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form gänzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, während kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten.
Untersuchungen zur Akkumulation phenolischer Inhaltsstoffe von Equisetum an gametophytischen und unterirdisch wachsenden sporophytischen Geweben vervollständigten den Kenntnisstand der phenolischen Inhaltsstoffe in dieser Gattung. In beiden Geweben konnten – wie in oberirdischen sporophytischen Geweben – Hydroxyzimtsäurederivate nachgewiesen werden. Styrylpyrone und Protoflavonoide ersetzen hier die in oberirdischen sporophytischen Geweben nachgewiesenen Flavonoide. Hydroxyzimtsäurederivate wurden in Prothallien aller untersuchter Arten gefunden wohingegen in Rhizomen der jeweiligen Arten einzelne Hydroxyzimtsäurederivate fehlten. Die Inhaltsstoffmuster der Styrylpyrone bei verschiedenen Arten entsprachen sich weitgehend. Die sukzessive Analyse des Übergangsbereiches - unterirdisch wachsendes Rhizom zu oberirdischem Spross - zeigte einen ebenso sukzessiven Wechsel im Akkumulationsmuster. Der Gehalt löslicher Styrylpyrone nahm - von unten nach oben betrachtet - in gleichem Maße ab, wie der Gehalt an Flavonoiden anstieg. In lokal braun pigmentierten Sprossbereichen, die vereinzelt an oberirdisch wachsenden Sporophyten auftraten, wurden neben den in Rhizomen konstitutiv akkumulierten Styrylpyronen auch, offenbar durch Verwundung induziert, Styrylpyrone detektiert. In den grünen, nicht pigmentierten Bereichen dieser Sprosse wurden dagegen ausschließlich Flavonoide und Hydroxyzimtsäurederivate detektiert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen belegten eine vakuoläre Speicherung der löslichen Inhaltsstoffe Styrylpyrone und Hydroxyzimtsäurederivate in Rhizomen und Prothallien. Hydroxyzimtsäurederivate wurden vorwiegend in zentral liegenden Rhizombereichen detektiert, während Styrylpyrone über den gesamten Rhizomquerschnitt verteilt sichtbar gemacht werden konnten. Folgende Styrylpyrone wurden aus Rhizomen von E. arvense isoliert und mit Hilfe spektroskopischer Methoden in ihrer Struktur aufgeklärt: 3,4-Dihydroxy-6-(4´-hydroxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-ß-D-glucopyranosid und 3,4-Dihydroxy-6-(3´-hydroxy-4´methoxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-ß-glucopyranosid. Untersuchungen zur Biosynthese von Styrylpyronen zeigten eine enzymkatalysierte Bildung von Hispidin und Bisnoryangonin in Gametophyten verschiedener Equisetum-Arten sowie in Rhizomen und fertilen Sporophyten von E. arvense. Ebenso gelang der Nachweis der enzymatischen Glycosilierung von 3-Hydroxyhispidin zu Equisetumpyron in Gametophyten von E. arvense. Eine Styrylpyronsynthase wurde charakterisiert: Das pH-Optimum für die Bildung von Bisnoryangonin lag bei pH 7,5-7,8 und für die Bildung von Hispidin bei 6,8-7,0, jeweils in 0,5 M KPi-Puffer. Das Temperaturoptimum für die Bildung von Bisnoryangonin betrug 30° C bzw. 37°C für die Bildung von Hispidin. Die Substanzen Natriumascorbat in einer Konzentration von 20 mM, BSA (0,1 % w/V), Dithiothreitol (2,5 mM) bzw. Mercaptoethanol (7 mM) konnten die Enzymaktivität deutlich steigern. Die KmWerte wurden für die Substrate Kaffeoyl-CoA und Malonyl-CoA bei 116 µM bzw. 141 µM ermittelt. Für die Substrate p-Cumaroyl-CoA und Malonyl-CoA lagen die KmWerte bei 182 µM bzw. 238 µM. Das relative Molekulargewicht des nativen Enzyms wurde mittels Gelfiltration mit 78-80 kD bestimmt. Im Rahmen der Proteinreinigung wurde eine auf chromatographischen Techniken basierende Methode entwickelt, mit der die Styrylpyronsynthase mit einem Anreicherungsfaktor von 1107 bei einer Ausbeute von 0,08 % gereinigt werden konnte.
Die Multigenfamilie der Lipid Transfer Proteine (LTP) stellt eine Gruppe von kleinen Proteinen dar, welche in allen höheren Landpflanzen vorkommen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden 92 Proteine zur Klasse der LTPs gezählt. Die Benennung der Proteinfamilie basiert auf dem beobachteten in vitro Transfer von Lipiden zwischen zwei Membranen. Alle LTPs weisen ein konserviertes, 8 Cysteine beinhaltendes Motiv und eine hydrophobe Tasche auf, welche für die Bindung hydrophober Moleküle verantwortlich ist. Aufgrund ihrer Signalsequenz werden LTPs über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum geschleust. Für einige pflanzliche LTPs konnte eine derartige Sekretion bereits nachgewiesen werden. Für andere LTPs wird eine Funktion in der Kutinbildung, der Embryogenese oder der pflanzlichen Immunantwort gegen Phytopathogene postuliert. Letzteres wurde für DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) und AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) nachgewiesen, während von LTPIV.4 (At4g55450) nur bekannt ist, dass die Expression spezifisch in Antwort auf Pathogene induziert ist.
Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktion von LTPIV.4 und AZI1 in Bezug auf die pflanzliche Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana untersucht. Anhand von GFP-Fusionsproteinen konnte für LTPIV.4 und AZI1 eine Endoplasmatische Retikulum-Lokalisierung detektiert werden. Auch eine gewebespezifische Promotoraktivität von LTPIV.4 an den Leitgeweben und in jungen sich entwickelnden Blättern konnte identifiziert werden. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass LTPIV.4 möglicherweise an der Signaltransduktion am/im Leitgewebe mitverantwortlich ist.
Im Fokus dieser Arbeit stand die spezifische Einordnung von LTPIV.4 in der Ausbildung der lokalen bzw. systemischen Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Anhand einer Infektion von Wildtyppflanzen und LTPIV.4 Mutanten mit zwei verschiedenen Pseudomonasstämmen konnte eine LTPIV.4-abhängige Steigerung der pflanzlichen Resistenz gegen die biotrophen Bakterien nachgewiesen werden. In der Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia hingegen zeigte sich keine LTPIV.4 Abhängigkeit. Da die Hormone Salicylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA) in der Ausbildung der pflanzlichen Abwehr gegen verschiedene Pathogene wichtig sind, wurden die Hormonlevel von SA und JA in ltpIV.4, 35S::LTPIV.4 sowie in Wildtyppflanzen analysiert. Die untersuchten Phytohormongehalte zeigten eine LTPIV.4 unabhängige, schnelle Akkumulation von SA nach der Infektion mit virulenten (vir) Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) und eine spätere Erhöhung der JA-Gehalte. Es konnte somit kein regulatorischer Effekt von LTPIV.4 auf die SA- sowie die JA-Gehalte detektiert werden. Die Expression von SAG13 (SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 13) und OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE 1), welche eine Funktion im programmierten Zelltod (PCD) haben beziehungsweise durch oxidativen Stress induziert werden, war hingegen erhöht in konstitutiv LTPIV.4 exprimierenden Pflanzen, verglichen mit dem Wildtyp von LTPIV.4. Als ein weiterer Ansatzpunkt für die funktionelle Charakterisierung von LTPIV.4 wurde die in vitro Identifizierung möglicher Substrate mittels Lipid-Protein-Interaktionsanalysen, sowie einer unspezifischen Metabolomanalyse herangezogen. Bei den Interaktionsanalysen konnten Phosphatidsäuren (PA), Phosphatidylglycerine (PG), Monogalactosyldiacylglycerole (MGDG) und auch Digalactosyldiacylglycerole (DGDG) als Interaktionspartner von LTPIV.4 identifiziert werden. Die Metabolomanalyse zeigte einen quantitativen Unterschied zwischen Wildtyp/35S::LTPIV.4 und ltpIV.4 bei einigen MGDG, DGDG und PG Spezies. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich somit schließen, dass LTPIV.4 nach Pathogen/Schaden-assoziierte molekulare Muster- (PAMP/ DAMP-) Erkennung, z.B. von Psm, SA-abhängig vermehrt gebildet wird. Da die konstitutive Expression von LTPIV.4 sowohl zu erhöhter OXI1 und SAG13 Expression als auch zu erhöhter Resistenz gegenüber Psm führt, lässt sich ein Modell aufstellen, in dem LTPIV.4 als positiver Regulator des PCD die Pathogenresistenz von Arabidopsis erhöht. Der zugrunde liegende Mechanismus ist unbekannt. Die Bindung von PAs, PGs, MGDGs und DGDGs an LTPIV.4 in vitro könnte darauf hindeuten, dass auch in vivo hydrophobe Moleküle gebunden und möglicherweise transportiert werden und dies ein Teil der Pathogenantwort ist. Es wäre z.B. denkbar, dass eine mögliche Translokation von LTPIV.4 über das ER in das Zytoplasma oder den apoplastischen Raum erfolgt. Dort interagiert LTPIV.4 mit durch ROS gebildeten, oxidierten Lipiden oder DAMPs und löst entweder symplastisch durch eine Interaktion in der Infizierten Zelle oder in intakten Nachbarzellen durch eine weitere Signaltransduktionskaskade den PCD sowie eine erhöhte ROS Bildung aus, oder das LTP interagiert spezifisch mit oxidierten Lipiden oder DAMPs von abgestorbenen Nachbarzellen, und löst eine intrazelluläre Signalkaskade mit Initiierung des PCD sowie erhöhter ROS-Bildung aus.
AZI1 wurde als zweites LTP in dieser Arbeit einbezogen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die konstitutive Expression von AZI1 die Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogene Botrytis cinerea erhöht, sollte in der vorliegenden Arbeit detailiert untersucht werden, ob AZI1 eine Rolle in der Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogen Sclerotinia sclerotiorum spielt. Die azi1-1 Mutante zeigte hierbei jedoch eine erhöhte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum. Da bisher keine Unterschiede in der Genexpression von spezifischen Markergenen in WT und azi1-1 Pflanzen nach Sklerotiniainfektion festgestellt werden konnte und es auch für LTPs bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Kutikulasynthese spielen, wäre eine Hypothese, dass die unterschiedlichen Infektionsphänotypen mit Sclerotinia und Botrytis auf eine strukturelle Veränderung der Kutikulabeschaffenheit zurückzuführen sind. Weiterhin konnte für AZI1 eine mögliche Rolle in der Verwundungsantwort detektiert werden, da sowohl die AZI1 Genexpression, als auch die erhaltenen basal signifikant erhöhten 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA)-Gehalte auf eine negativ regulatorische Rolle von AZI1 in der Verwundungs-abhängigen JA-Signaltransduktion hindeuten.
In der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Aquaporine aus Nicotiana tabacum und Samanea saman mit molekularbiologischen Methoden analysiert und durch heterologe Expression in Oozyten von Xenopus laevis funktionell charakterisiert. Das aus Tabak isolierte Aquaporin NtAQP1 wird am höchsten in Wurzeln exprimiert, ist trotz vorhandener Cysteine nicht quecksilbersensitiv und permeabel für Glycerin und Harnstoff. Sowohl eine Ionenleitfähigkeit, als auch eine Regulation auf Proteinebene konnten im Oozytensystem nicht nachgewiesen werden. Die Leguminose Samanea saman bewegt im Tag-/Nachtrhythmus ihre Fiederblätter und -stengel. Dieses wird durch Variieren des Turgors im Flexorgewebe von Pulvini realisiert. Während SsAQP1 in seinen Charakteristika mit NtAQP1 übereinstimmt, ist SsAQP2 quecksilbersensitiv und hoch selektiv für Wasser. Der für SsAQP2 ermittelte Permeabilitätskoeffizient war um den Faktor 10 höher als der von SsAQP1. Northern Experimente zeigten, dass SsAQP2 ausschließlich im Flexorgewebe exprimiert wird. Die Expression ist zum Zeitpunkt der Streckungsbewegung des Pulvinus um 7 Uhr am stärksten. Dagegen wurde SsAQP1 zu allen untersuchten Zeitpunkten nur schwach in Pulvini exprimiert.
Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodomänen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch auflösender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abhängige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine für kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodomänen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelettären Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. Möglicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. Für zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Vollängenproteine erneut an der PM zu finden. Für die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen könnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandomänen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Domänen ausbilden, das möglicherweise zur Stabilität und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beiträgt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Größenverteilung von 97±4nm Durchmesser für PM-ständige Domänen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Domänen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabhängigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabhängige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodomänen beschränkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine für Membrandomänen.
Background: Sterols and Sphingolipids form lipid clusters in the plasma membranes of cell types throughout the animal and plant kingdoms. These lipid domains provide a medium for protein signaling complexes at the plasma membrane and are also observed to be principal regions of membrane contact at the inception of infection. We visualized different specific fluorescent lipophilic stains of the both sphingolipid enriched and non-sphingolipid enriched regions in the plasma membranes of live protoplasts of Arabidopsis thaliana. Results: Lipid staining protocols for several fluorescent lipid analogues in plants are presented. The most emphasis was placed on successful protocols for the single and dual staining of sphingolipid enriched regions and exclusion of sphingolipid enriched regions on the plasma membrane of Arabidopsis thaliana protoplasts. A secondary focus was placed to ensure that these staining protocols presented still maintain cell viability. Furthermore, the protocols were successfully tested with the spectrally sensitive dye Laurdan. Conclusion: Almost all existing staining procedures of the plasma membrane with fluorescent lipid analogues are specified for animal cells and tissues. In order to develop lipid staining protocols for plants, procedures were established with critical steps for the plasma membrane staining of Arabidopsis leaf tissue and protoplasts. The success of the plasma membrane staining protocols was additionally verified by measurements of lipid dynamics by the fluorescence recovery after photobleaching technique and by the observation of new phenomena such as time dependent lipid polarization events in living protoplasts, for which a putative physiological relevance is suggested.
Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung.
Die Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, weckte aufgrund ihrer karnivoren Lebensweise schon sehr früh das Interesse vieler Wissenschaftler. Für karnivore Pflanzen, die auf Nährstoff-armen Böden wachsen, spielen Insekten als Beute und somit als Nährstofflieferant eine entscheidende Rolle. So können die Pflanzen durch die Verdauung der Beute mit wichtigen Makro- und Mikronährstoffen, wie Stickstoff, Phosphat, Kalium oder Natrium versorgt werden. Aus diesem Grund sollte im Rahmen meiner Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die molekularen Mechanismen der Kationenaufnahme während der Nährstoffresorption gerichtet werden. Insbesondere die aus dem Insekt stammenden Nährstoffe Kalium und Natrium waren dabei von großem Interesse.
Im Allgemeinen sind Kaliumionen für Pflanzen eine essentielle anorganische Substanz und von großer physiologischer Bedeutung für die Entwicklung, den Metabolismus, die Osmoregulation, das Membranpotential und viele zelluläre Prozesse. Analysen der Kaliumaufnahme an Wurzeln von Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana und Reis zeigten, dass die Aufnahme von K+ ein Zusammenspiel von hoch-affinen K+-Transportern der HAK5-Familie und nieder-affinen Kaliumkanälen (AKT1/AtKC1) erfordert, die in ein komplexes
(De-)Phosphorylierungsnetzwerk eingebunden sind. In der vorliegenden Arbeit war es mir möglich das Netzwerk zur Kaliumaufnahme in den Drüsen der Venusfliegenfalle zu entschlüsseln. Es konnten Orthologe zum Kaliumtransporter HAK5 aus Arabidopsis (DmHAK5) und zum Kaliumkanal AKT1 (DmKT1) identifiziert und im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten elektrophysiologisch charakterisiert werden. Dabei zeigte sich, das DmKT1 durch einen Ca2+-Sensor/Kinase-Komplex aus der CBL/CIPK-Familie phosphoryliert und somit aktiviert wird. Phylogenetische Analysen von DmKT1 bestätigten die Eingruppierung dieses Kaliumkanals in die Gruppe der pflanzlichen Shaker-Kaliumkanäle des AKT1-Typs. Die Transporteigenschaften zeigten zudem, dass DmKT1 bei hyperpolarisierenden Membranpotentialen aktiviert wird und einen K+-selektiven Einwärtsstrom vermittelt. In Oozyten konnte eine Kaliumaufnahme bis zu einer externen Konzentration von ≥1 mM beobachtet werden. DmKT1 repräsentiert also einen Kaliumkanal mit einer hohen Transportkapazität, der die nieder-affine Kaliumaufnahme in die Drüsenzellen der Venusfliegenfalle vermitteln kann.
Unterhalb einer externen Kaliumkonzentration von 1 mM würde der anliegende elektrochemische Kaliumgradient einen Kaliumausstrom und somit einen Verlust von Kalium favorisieren. Hoch-affine K+/H+-Symporter können durch die Ausnutzung des Protonengradienten eine Kaliumaufnahme im mikromolaren Bereich gewährleisten. In Wurzelhaaren von Arabidopsis vermittelt der Transporter AtHAK5 die Kaliumaufnahme unter Kaliummangelbedingungen. DmHAK5, ein Ortholog zu AtHAK5, ist in Dionaea Drüsen exprimiert und konnte zum ersten Mal im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten im Detail charakterisiert werden. Interessanterweise zeigte sich, dass DmHAK5 wie der K+-Kanal DmKT1 durch denselben CBL/CIPK-Komplex posttranslational reguliert und aktiviert wird. Die Transporteigenschaften von DmHAK5 wiesen auf einen Transporter mit einer breiten Substratspezifität hin, sodass sich DmHAK5 neben Kalium auch für Ammonium permeabel zeigte. Affinitätsuntersuchungen von DmHAK5 zu seinem Substrat Kalium klassifizierten das Protein als einen hoch-affinen Kaliumtransporter, der im Symport mit Protonen die Kaliumaufnahme im mikromolaren Konzentrationsbereich vermitteln kann.
Das Kaliumtransportmodul besteht also aus dem K+-selektiven Kanal DmKT1 und dem
K+/H+-Symporter DmHAK5, die die hoch- und nieder-affine Kaliumaufnahme in den Drüsenzellen während der Beuteverdauung in Dionaea muscipula Fallen ermöglichen. Beide Transportmodule werden Kalzium-abhängig durch die Kinase CIPK23 und den Ca2+-Sensor CBL9 auf posttranslationaler Ebene reguliert.
Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit Einblicke in die Kationenaufnahme während der Nährstoffresorptionsphase der Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, zu gewinnen. Dabei wurde klar, dass Dionaea muscipula im Laufe ihrer Evolution zu einer karnivoren Pflanze, nicht neue Transportmodule zur Nährstoffresorption aus der Beute entwickelte, sondern bekannte aus Wurzeln stammende Transportmodule umfunktionierte. Auf molekularer Ebene konnten die biophysikalischen Charakteristika der K+- und Na+-Transportproteine, sowie ihre Regulation entschlüsselt werden. Diese Erkenntnisse wurden schließlich in den Kontext des Beutefangs der Venusfliegenfalle gebracht und diskutiert.