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Ziel dieser Arbeit war es die intranasalen pharmakokinetischen Abläufe nach topischer Applikation mittels in vitro und ex vivo Experimenten zu charakterisieren und ihre Auswirkungen auf die Pharmakodynamik zu beschreiben. Es wurden hierbei die nasal angewendeten Glucocorticoide Triamcinolonacetonid (TCA), Budesonid (Bud), Beclomethasondipropionat (BDP), Fluticasonpropionat (FP), Mometasonfuroat (MF) und Fluticasonfuroat (FF) sowie ihre handelsüblichen Präparate Nasacort® (TCA), Budes® (Bud), ratioAllerg® (BDP), Flutide® Nasal (FP), Nasonex® (MF) und Avamys® (FF) untersucht. Zum Aufbringen der Wirkstoffsuspension auf die nasale Mukosa durch den Patienten kommen Dosierpumpsprays zum Einsatz, deren Dosiervorrichtung das Applikationsvolumen festlegen. Die Bestimmung des Sprühstoßvolumens unterschiedlicher handelsüblicher Präparate ergab Werte zwischen 56 und 147 µL/Sprühstoß. Zum ersten Mal wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglichte die Glucocorticoidkonzentration in den wässrigen Überständen handelsüblicher Präparate zu bestimmen. Die Wasserlöslichkeit der unterschiedlichen Glucocorticoide sowie die galenische Zusammensetzung der Formulierungen konnten als mögliche Einflussfaktoren für den bereits gelösten Wirkstoffanteil ermittelt werden. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die Löslichkeit der Wirkstoffkristalle der lipophileren Substanzen wie BDP, FP, MF und FF durch das KNS signifikant verbessert wurde. Die Löslichkeit der hydrophileren Wirkstoffe wie TCA und Bud wurde durch das KNS dagegen nur leicht beeinflusst. Nach der Auflösung der Wirkstoffkristalle können die gelösten Moleküle zur cytoplasmatischen Zielstruktur, dem Glucocorticoidrezeptor diffundieren und spezifisch binden. Neben der Rezeptorbindung erfolgt auch eine unspezifische Bindung an Nasengewebe. So wurde zunächst mit einem einfachen, bereits etablierten Versuchsaufbau erstmalig die Bindung von FF an Nasengewebe im Vergleich zu anderen Glucocorticoiden in vitro untersucht. Die lipophileren Substanzen wie FF, MF und FP grenzten sich hierbei durch eine höhere Gewebebindung von den hydrophileren TCA und Bud ab. Es wurde ein neues Modell entwickelt, welches die pharmakokinetische Untersuchung zur Gewebebindung mit der Pharmakodynamik der Wirkstoffe in Form ihres antiinflammatorischen Effektes im Zellkulturmodell verknüpfen sollte. So wurde wirkstoffgesättigtes Gewebe einer extensiven Auswaschphase in Humanplasma ausgesetzt, um es anschließend mit humanen Lungenepithelzellen zu inkubieren. Es konnte gezeigt werden, dass alle Gewebeproben den Wirkstoff in das Zellkulturmedium freisetzten, was eine Hemmung der IL-8 Sekretion aus Lungenepithelzellen zur Folge hatte. Die Stärke des antiinflammatorischen Effektes der IL-8 Hemmung durch FF, FP, Bud und TCA entsprach der Kombination aus Geweberetention und intrinsischer Aktivität (Rezeptoraffinität) der Wirkstoffe. Gewebeproben des MF führten zur geringsten IL-8 Hemmung, was durch die chemische Instabilität der Substanz erklärt werden konnte. Um eine weitere Annäherung an physiologische Verhältnisse zu erreichen, wurde erfolgreich ein Modell entwickelt, welches nach Applikation der Suspension auf die Mukosa die pharmakokinetischen Abläufe simulieren sollte. Dafür entscheidend war die Einbettung respiratorischen Gewebes in eine Gel-Matrix, wodurch eine zusammenhängende Mukosa-ähnliche Oberfläche erreicht werden konnte. Als Modellsubstanzen wurden Bud aus Budes®-Nasenspray und FP aus Flutide® Nasal sowie als Vertreter der Antihistaminika Azelastin-HCl (AZ-HCl) aus Vividrin® akut eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Gewebebindung des AZ-HCl im Vergleich zu den Glucocorticoiden am höchsten war. Die gute Korrelation der Gewebebindung der Substanzen mit ihrem Verteilungsvolumen und der Vergleich von FP mit Bud zeigte die erfolgreiche Etablierung des Modells. Beide Glucocorticoide zeigten nach Applikation der Wirkstoffsuspension zunächst eine ähnliche Assoziation an das Gewebe. Bei der Inkubation der Gewebe-Gel-Matrix mit Humanplasma wurde schließlich Fluticasonpropionat aus der Gewebe-Gel-Bindung im Vergleich zu Budesonid langsam freigesetzt. Weiterhin wurde im Gewebe-Gel-Modell die Bedeutung der Pharmakokinetik der Wirkstoffe auf die Pharmakodynamik ermittelt. Es wurden Freisetzungsproben der Gewebe-Gel-Matrices von AZ-HCl und FP auf ihre antiinflammatorische Aktivität untersucht. Die deutlich höhere Bindung des AZ-HCl an die Gewebe-Gel-Matrix äußerte sich auch in höheren Plasmakonzentrationen bei der Freisetzung im Vergleich zu FP. Jedoch konnte im Zellkulturmodell gezeigt werden, dass die Hemmung der IL-8 Freisetzung des FP, trotz der geringeren Konzentration in der Freisetzungsmatrix, das antiinflammatorische Potential des AZ-HCl übertraf.
Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing
(2015)
The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling.
This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day.
Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors.
Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling.
Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions.
Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo.
Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies.
Patienten mit chronischer Nebenniereninsuffizienz (NNI) haben ein hohes Risiko, eine lebensbedrohliche Nebennierenkrise (NNK) zu erleiden. Hauptauslöser sind insbesondere gastrointestinale und fieberhafte Infekte, sowie Unfälle, Operationen, psychische und physische Belastungssituationen. Häufig entwickeln sich dabei NNK innerhalb weniger Stunden und können rasch zu einem letalen Verlauf führen, bevor den betroffenen Patienten suffiziente ärztliche Hilfe gewährleistet werden kann.Zur Prävention solcher NNK, werden nebenniereninsuffiziente Patienten wiederholt in der Eigenanpassung ihrer Glucocorticoiddosis in Belastungssituationen geschult. Sie erhalten einen Notfallausweis und werden zusätzlich mit einem Notfallkit, bestehend aus einer Ampulle Hydrocortison für Injektionszwecke, ausgestattet. Da Patienten jedoch nach wie vor (zum Beispiel im Rahmen von Gastroenteritiden durch ungenügende enterale Resorption des Hydrocortisons) an NNK versterben, sind eine Verbesserung der Krisenprävention und des Notfallmanagements dringend anzustreben.Um den Patienten in Krisensituationen ein höheres Maß an Unabhängigkeit zu ermöglichen, erfolgen daher mittlerweile Schulungen in der Eigeninjektion von Hydrocortison. Aktuell besteht hier eine Zulassung für die intramuskuläre (i.m.) Verabreichung. Es ist jedoch anzunehmen, dass die i.m. Eigeninjektion für viele Patienten eine große Hemmschwelle darstellt und daher in Krisensituationen nicht konsequent genug angewandt wird. Die subkutane (s.c.) Verabreichung von Hydrocortison wäre eine für die Patienten leicht durchzuführende und äquivalente Alternative. Erfahrungsgemäß besteht bezüglich einer s.c. Applikation von Medikamenten eine höhere Akzeptanz , da diese in vielen anderen Bereichen, wie z. B. der s.c. Selbstinjektion von Insulin bei Diabetikern oder der Injektion von Heparin in der postoperativen Phase oder bei der Injektion von Hormonpräparaten im Rahmen einer Hypophyseninsuffizienz, bereits regelmäßig Anwendung findet und bei vielen Patienten bekannt ist.
Ziel der Studie war es daher, die Pharmakokinetik und die Sicherheit der s.c. Hydrocortisonapplikation für einen routinemäßigen Einsatz in Krisensituationen im Vergleich zur i.m. Gabe zu evaluieren. Für die Studie wurden zwölf Patienten mit einer chronischen NNI eingeschlossen. Ihnen wurde an drei verschiedenen Untersuchungstagen s.c. Kochsalzlösung (Kontrollintervention), sowie s.c. und i.m. 100 mg Hydrocortison injiziert. An jedem Untersuchungstag, wurden Speichelproben sowie über eine venöse Verweilkanüle Blutproben zu 15 Zeitpunkten (0 bis 240 min nach Injektion) entnommen und asserviert. Anhand der pharmakokinetischen Profile zeigte sich, dass sowohl die i.m. als auch die s.c. Applikation von Hydrocortison zu suffizienten Wirkspiegeln (> 36 µg/dl) von Cortisol im Serum führt. Wie erwartet zeigte sich bei der i.m. Injektion von Hydrocortison ein etwas schnellerer Anstieg der Cortisolkonzentration. Andererseits ergab sich nach der s.c. Injektion von Hydrocortison eine längere mittlere Verweildauer im Blut. Des Weiteren wurde nach s.c. Applikation eine stärkere Abhängigkeit der Serumcortisolprofile vom BMI der Patienten beobachtet. Schwerwiegende unerwünschte Ereignisse traten nicht auf. Leichte unerwünschte Ereignisse, ließen sich vielmehr auf die Injektion an sich, als auf die applizierte Substanz Hydrocortison zurückführen und waren überwiegend bei der i.m. Applikation zu beobachten. Die Beurteilung der Patientenzufriedenheit anhand eines Fragebogens zeigte deutlich, dass die Patienten die s.c. gegenüber der i.m. Eigeninjektion bevorzugen würden. Weiterhin wurde deutlich, dass die Bedrohung durch NNK, für einige Patienten auch eine Einschränkung der Lebensqualität bedeutet und dass sie sich durch die Möglichkeit der Eigeninjektion sicherer fühlen würden. Alle Patienten würden sich nach Studienteilnahme eine Eigeninjektion von Hydrocortison zutrauen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die s.c. Applikation von Hydrocortison eine geeignete Alternative zur i.m. Injektion darstellt; besonders für Patienten mit einem normwertigen BMI und im Falle von beginnenden NNK, bevor es evtl. zur Beeinträchtigung der Zirkulation im Schock und einer möglicherweise unzureichenden Resorption bei einer Minderdurchblutung des Fettgewebes kommt. Da die Patienten die s.c. der i.m. Applikation deutlich vorziehen würden, kann davon ausgegangen werden, dass nebenniereninsuffiziente Patienten die s.c. Eigeninjektion konsequenter einsetzten würden. Durch eine geringere Hemmschwelle gegenüber der s.c. Gabe und einem folglich vermehrten Einsatz der Eigeninjektion bei beginnenden Krisen, könnte die Zahl der NNK und deren Mortalität gesenkt werden. Allerdings ist die i.m. Verabreichung von Hydrocortison auch weiterhin als eine sehr gute und schneller wirksamere Art der Eigeninjektion zu betrachten, die den Patienten in erster Linie empfohlen werden kann.
Zur Krisenprävention sollte zukünftig, zusätzlich zum Notfallausweis und der generellen Aufklärung, der Schwerpunkt auch auf eine individuelle Schulung im richtigen Umgang mit der Eigeninjektion von Hydrocortison in Notfallsituationen gelegt werden. Des Weiteren sollte generell neben der Optimierung der Substitutionstherapie auch die Verbesserung des Krisenmanagements mit im Fokus der NNI-Forschung stehen.
Die humane Lunge kann bei der Pharmakotherapie einer Erkrankung entweder als betroffenes Organ Ziel eines verabreichten Arzneistoffes sein oder aber auch als Portal für diesen in die systemische Zirkulation fungieren. Wird ein Arzneistoff inhaliert, ist für dessen Nutzen-Risiko-Profil von zentraler Bedeutung, in welchem Ausmaß und mit welcher Geschwindigkeit dieser resorbiert und anschließend in die systemische Zirkulation umverteilt wird. Wenn bei der Behandlung einer Lungenerkrankung dagegen ein Arzneistoff z.B. nach peroraler Gabe erst in der systemischen Zirkulation anflutet, müssen ausreichend hohe Wirkstoffkonzentrationen in den betroffenen Gewebearealen sichergestellt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Möglichkeiten zu finden, diese beiden Vorgänge in vitro möglichst realitätsnah messen zu können. Für die Simulation der pulmonalen Absorption nach inhalativer Applikation eines Arzneistoffs diente Beclomethasondipropionat (BDP), freigesetzt aus den handelsüblichen FCKW-freien Dosieraerosolen Sanasthmax® und Ventolair®, als Modellsubstanz. Es wurde zunächst ein einfaches Dialysemodell als Screeningverfahren entwickelt. Hier wurden BDP-Partikel unter Verwendung der beiden Dosieraerosole auf humanem Lungenhomogenat deponiert und nachfolgend die kombinierten Prozesse aus Auflösung und Umverteilung der Substanz in eine Dialyseflüssigkeit, die sich entweder aus salinem Puffer oder humanem Blutplasma zusammensetzte, untersucht. Anschließend wurde erstmals ein etabliertes humanes Lungenperfusionsmodell dahingehend modifiziert, dass eine Inhalation von BDP nach Applikation eines handelsüblichen Dosieraerosols nachgestellt werden konnte. Auf diese Weise konnte an diesem realitätsnahen Modell die initiale Phase der pulmonalen Absorption von BDP in der Perfusionsflüssigkeit verfolgt werden. Beide Modelle zeigten Unterschiede in der Auflösungs- bzw. Umverteilungskinetik von BDP in Abhängigkeit von der verwendeten Applikationsform auf. So schienen sich von Ventolair® erzeugte BDP-Partikel schneller und in größerer Menge aufzulösen als diejenige bei den Versuchen mit Sanasthmax®, was eine vermehrte Umverteilung der Substanz sowohl in die Dialyseflüssigkeit als auch Perfusionslösung zur Folge hatte. Die am Lungenperfusionsmodell beobachteten Verläufe der initialen pulmonalen Absorption von BDP nach Freisetzung aus den Dosieraerosolen Sanasthmax® oder Ventolair® korrelierten dabei sehr gut mit Daten aus einer entsprechenden Humanstudie mit gesunden Probanden. Auch standen die ermittelten Unterschiede in sinnvoller Übereinstimmung mit Untersuchungen der in den von Sanasthmax® oder Ventolair® versprühten Aerosolen enthaltenen Partikel hinsichtlich Größenverteilung, Morphologie und Lösungsverhalten in Bronchialsekret. Um die Umverteilung eines Wirkstoffs von der systemischen Zirkulation in lungenspezifisches Gewebe am humanen Lungenperfusionsmodell zu simulieren, wurden die Gewebekonzentrationen von Thalidomid (THAL) in peripherem Lungengewebe im Vergleich zu den korrespondierenden Spiegeln in einem Bronchialkarzinom erstmals mittels Mikrodialyse verfolgt. Hierzu wurde im Vorfeld für diese Substanz unter Einsatz des Komplexbildners (2 Hydroxypropyl)-beta-cyclodextrin (HPCD) ein bezüglich der Sensitivität und der zeitlichen Auflösung optimiertes Mikrodialysesystem etabliert und dessen Eigenschaften systematisch untersucht. Am Lungenperfusionsmodell wurde dann eine an klinisch relevante Plasmaspiegel angelehnte THAL-Konzentration in der Perfusionslösung vorgelegt und anschließend das Anfluten in den oben genannten Geweben mit Hilfe des entwickelten Mikrodialysesystems beobachtet. Durch Zugabe von HPCD in das Mikrodialyseperfusat konnte eine signifikante Erhöhung der Wiederfindungsrate im Dialysat (Relative Recovery) erreicht und damit ein Mikrodialysesystem etabliert werden, das neben hoher zeitlicher Auflösung eine ausreichende analytische Sensitivität für THAL aufwies. Allerdings wurden aufgrund dieses Perfusatzusatzes die Diffusionsvorgänge während der Mikrodialyse derart beeinflusst, dass übliche Methoden zur Sondenkalibrierung wie z.B. die Retrodialyse nicht mehr angewendet werden konnten, und daher in Hinblick auf die Messungen am Lungenperfusionsmodell bestehende Kalibrierverfahren modifiziert werden mussten. Bei der Untersuchung der Gewebepenetration am Lungenperfusionsmodell flutete THAL in Tumorgewebe langsamer an als in peripherem Lungengewebe, wo schnell ähnliche Konzentrationen wie in der Perfusionslösung gefunden wurden. Auch lagen die Gewebespiegel im Tumorgewebe stets unter dem ermittelten Niveau im Lungengewebe. Die erhaltenen Konzentrationsverhältnisse zwischen Perfusionslösung, peripherem Lungengewebe und Tumorgewebe deckten sich dabei mit Kenntnissen aus Humanstudien, in denen analog Plasmakonzentrationen von antineoplastischen Substanzen ebenfalls mittels Mikrodialyse in Relation zu deren Spiegeln in gesundem Gewebe und Tumorgewebe verschiedenster Ätiologie bestimmt wurden.
The inhaled pharmacotherapy is fundamental in the management of obstructive lung diseases such as asthma bronchiale or chronic obstructive pulmonary disease. In this context short- and long-acting β2-agonists play a prominent role as relieve and control medication. Regarding the risk-benefit profile of an inhaled drug, the pattern of pulmonary deposition and the rate and extent of absorption into systemic circulation are essential parameters. New developments of drugs are characterized by high lung retention and improved efficacy. The aim of the present thesis was the parallel evaluation the pharmacokinetic (PK) and -dynamic (PD) properties of inhaled β2-agonists employing an isolated human lung perfusion model (IPL). The short-acting β2-agonist salbutamol and the newly developed ultra long-acting β2-agonist GW597901 were chosen for the analysis of pulmonary drug absorption and bronchodilation. In a pharmacokinetic enabling study an established human IPL setting was modified to monitor the pharmacokinetics of the β2-agonists by measuring the concentrations in perfusion fluid, lung tissue and BAL samples obtained during and after the experiments. The IPL model revealed differences in the pulmonary absorption behaviour of GW597901 and salbutamol. The lipophilic compound GW597901 was distributed to a lower extent into the perfusion fluid compared to the more hydrophilic compound salbutamol. The analyzed time profiles of nebulized salbutamol in the perfusate were consistent to with a clinical study if considering experimental conditions as the actual deposited doses and the differing volume of distribution. Thus, the suitability of the IPL model for the PK analysis of inhaled β2-agonists was confirmed. In a PK/PD study the human ex vivo model was employed for the first time for the evaluation of the clinical relevant bronchodilating effect induced by inhaled β2-agonists in addition to the analysis of their pharmacokinetics. Thereby the focus was to determine the onset and extent of bronchodilation. A new method was established to monitor changes in lung function parameters due to pharmacodynamic interventions over the duration of the experiment that allowed permanent online recording of the ventilation volume and lung mechanic parameters. Bronchial challenges with aerolised MCh were performed successfully in isolated ventilated human lung lobes, even though the responder rate was lower than expected despite high administered doses. The administration of the short acting agent salbutamol led to an immediate onset of action recognized as a sudden increase of the ventilation volumes. The bronchodilation following the application of GW597901 was observed delayed after about 6 min. Monitored lung function parameters considerably improved by both β2 - agonists in the IPL setting but not significantly different. Thus, in regard of the different applied doses GW597901 had a higher intrinsic activity and bronchodilating potency than salbutamol. The concentrations of salbutamol and GW597901 in the perfusate determined in the PK/PD study were significantly lower than those observed in the pharmacokinetic enabling study, while the tmax values and the course of the distribution profiles remained similar. Most likely, the application of nebulized MCh prior to the administration of the β2 - agonists had a substantial influence on their pharmacokinetic behaviour. It is yet not clear whether pharmacodynamic effects or molecular competition processes for the passage to the systemic circulation or both influenced the redistribution of the β2 - agonists as seen in the PK/PD study. The potential clinical relevance of this observation has to be further investigated. The development of pulmonary edema during the experiment was one limitation of the IPL model. For the determination of the onset of edema formation four potential biochemical markers, specifically surfactant-protein A (SP-A), angiotensin-converting enzyme (ACE), urea and lactate dehydrogenase, were measured in perfusion fluids. In this context, an ELISA method for the quantification of human SP-A in biological matrices was successfully established. The investigations showed that the concentrations of SP-A and ACE in the perfusate increased over time as a sign for lung tissue damage and correlated with the degree of edema formation. For the first time the IPL model was used for the evaluation of potential pulmonary edema marker and the results have shown that it is valuable tool for further investigations in this field. In conclusion, the pharmacokinetic and pharmacodynamic characterization of GW597901 and salbutamol was successfully achieved using the IPL model. This ex vivo methodology may contribute to further insights and understanding of the complex pharmacokinetic processes of inhaled β2 – agonists in the lung.
Antiinflammatorische Wirkungen und Pharmakokinetik eines standardisierten Kiefernrindenextraktes
(2005)
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die Hemmung des induzierten Abbaus von Matrixproteinen sowie von Gelatine durch Matrixmetalloproteinasen mithilfe des Kiefernrindenextraktes Pycnogenol, einer Auswahl seiner Inhaltsstoffe und seiner Metabolite d-(3,4-Dihydroxyphenyl)-g-valerolacton (M1) und d-(3-Methoxy-4-hydroxyphenyl)-g-valerolacton (M2) untersucht. Beide Metabolite zeigten eine signifikante Hemmwirkung und lagen in der Effektivität ihrer Hemmung auf einer µg/ml-Basis immer leicht über der des Gesamtextraktes. Um die in Frage kommenden Mechanismen der Hemmwirkung gegenüber Matrixmetalloproteinasen aufzuklären, wurde die Bindung des Gesamtextraktes an Hautpulver, sowie an die Matrixproteine Collagen und Elastin untersucht. Es wurde ein Schutz der Substrate vor enzymatischer Degradierung durch MMPs infolge einer Adsorption der Procyanidine abgeleitet. Die Metabolite M1 und M2 schienen auf Grund eines anderen Mechanismus die Aktivität der MMPs zu hemmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmwirkung der untersuchten Inhibitoren auf MMP-9 nach Zinkzusatz vollständig aufgehoben wurde. Daher konnte eine direkte Interaktion von beiden Metaboliten auf das Zinkatom des aktiven Zentrums angenommen werden. Die Wirkungen der Metabolite M1 und M2 wurden anschließend auf zellulärer Ebene untersucht. Es wurde getestet, ob sie einen Einfluss auf die Sekretion von MMP-9 aus bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Monocyten hatten. Als Positivkontrolle wurden antiinflammatorisch wirkenden PPAR-Agonisten, sowie das endogene Glucocorticoid Hydrocortison eingesetzt, deren Hemmwirkung auf die MMP-9-Freisetzung gut belegt war. Die PPAR-Agonisten waren in Bezug auf die MMP-9-Sekretion die wirksamsten Inhibitoren. Mit einer bemerkenswert niedrigen IC50 waren die beiden Metabolite M1 und M2 in ihrer Wirkung equipotent. Im Vergleich zu Hydrocortison konnte sogar gezeigt werden, dass beide Metabolite potentere Inhibitoren darstellten als das körpereigene antiinflammatorisch wirksame Glucocorticoid. In pharmakokinetischen Untersuchungen wurden Plasmaproben von Probanden nach Einmal- (n = 11) und Mehrfach- (n = 5) Einnahme von 300 bzw. 200 mg Pycnogenol mithilfe der HPLC vermessen. Durch diese Untersuchungen sollte festgestellt werden, ob eine Absorption von Extraktbestandteilen, sowie Metabolisierungsreaktionen im Körper stattfinden. Es konnten in den Proben der meisten Probanden erstmalig im Plasma sowohl Extraktbestandteile als auch der Metabolit M1 nachgewiesen werden. Daneben konnten zehn bislang unbekannte Substanzen detektiert werden, die in weiterführenden Arbeiten noch identifiziert werden müssen. Es wurde eine große interindividuelle Variabilität sowohl im Grad der Konjugation als auch bei den im Plasma vorliegenden Konzentrationen der einzelnen Substanzen festgestellt. Nach Einmalgabe des Extraktes wurden verschiedene Gruppen von Substanzen mit frühen, mittleren, späten und interindividuell sehr variablen Plasmaspiegelmaxima nachgewiesen. Es konnten erstmalig nach Pycnogenol-Einnahme pharmakokinetische Parameter der bekannten und im Gesamtextrakt quantifizierbaren Verbindungen errechnet werden. Nachfolgend wurde in den Plasmaproben der Probanden nach Pycnogenol-Einnahme nachgewiesen, dass Wirksubstanzen in Konzentrationen vorhanden waren, die tatsächlich pharmakodynamische Effekte erzielen konnten. Dazu wurde ein neues Versuchskonzept erstellt, bei dem die Hemmung der MMP-9-Sekretion auf zellulärer Ebene mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer vor und nach Pycnogenol-Einnahme ex vivo untersucht wurde. Nach Mehrfachgabe bewirkten die verdünnten Plasmaproben der Probanden eine signifikant verminderte MMP-9-Sekretion um im Mittel 25 %. Plasmaproben nach einmaliger Einnahme von 300 mg Pycnogenol riefen schon 30 Minuten nach Extrakt-Einnahme eine Hemmung der MMP-9-Sekretion hervor. Diese Hemmung war bis 14 Stunden nach der Einnahme nachzuweisen. Einen wichtigen Transkriptionsfaktor im Entzündungsgeschehen stellt NF-kB dar. Stimuliert durch verschiedene Agenzien führt NF-kB u.a. zur Induktion von MMP-9. Nach Mehrfachgabe konnte in ex vivo Versuchen mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer nach Inkubation mit stimulierten Monocyten eine etwa 15 %ige Hemmung der NF-kB-Aktivierung gezeigt werden. Es konnte am Beispiel von MMP-9 und NF-kB erstmalig gezeigt werden, dass nach Einnahme von Pycnogenol auch in vivo Konzentrationen an Metaboliten bzw. Bestandteilen erreicht werden, die ex vivo in der Lage waren, pharmakodynamische Effekte zu erzielen. Bislang konnte jedoch keine Zuordnung der pharmakokinetisch identifizierten Verbindungen zu den pharmakodynamischen Effekten erfolgen. Die umfassenden in vitro, ex vivo und in vivo Untersuchungen von Bestandteilen und/oder Metaboliten des Pycnogenol-Extraktes in der vorliegenden Arbeit leisten auf molekularer und auf zellulärer Ebene einen grundlegenden Beitrag zum Verständnis der klinischen antiinflammatorischen Effekte des Kiefernrindenextraktes.
Aufgrund seiner potentiell gesundheitsfoerdernden Wirkung wurde das Falvonol Quercetin in den letzten Jahren intensiv untersucht. Daten zur Bioverfuegbarkeit nach oraler Applikation sind jedoch selten und widerspruechlich. Fruehere Untersuchungen deuteten darauf hin, dass die Disposition von Quercetin von der Zuckerkomponente des Glykosids oder der Pflanzenmatrix abhaengen koennte. Um den Einfluss der Zuckerkomponente oder der Matrix auf die Resorption von Quercetin festzustellen, wurden zwei isolierte Quercetinglykoside sowie zwei Pflanzenextrakte in einer vierarmigen, randomisierten cross-over Studie an 12 gesunden Probanden getestet. Jeder Proband erhielt eine Zwiebelzubereitung oder Quercetin-4'-O-glucosid, jeweils entsprechend 100 mg Quercetinaglykon, sowie Quercetin-3-O-rutinosid oder Buchweizenkrauttee entsprechend 200 mg Quercetinaglykon. Die Proben wurden mittels HPLC und Coulometrischer Arraydetektion analysiert. Im Plasma wurden ausschliesslich Quercetinglucuronide detektiert. Freies Quercetin und die Glykoside waren nicht nachweisbar. Die Bioverfuegbarkeit und Pharmakokinetik nach Applikation von Zwiebeln und Quercetin-4'-glucosid zeigte keine signifikanten Unterschiede. Maximale Plasmakonzentrationen von 2.3±1.5 µg·mL-1 and 2.1±1.6 µg·mL-1 (MW±SD) wurden nach 0.7±0.2 h und 0.7±0.3 h erreicht. Nach Einnahme von Buchweizenkraut und Rutin wurden maximale Plasmakonzentrationen (trotz der doppelten Dosis) von nur 0.6±0.7 µg·mL-1 und 0.3±0.3 µg·mL-1 nach 4.3±1.8 h bzw. 7.0±2.9 h erreicht. Die terminale Halbwertszeit lag bei ca. 11 h fuer alle vier Pruefpraeparate. Die Disposition von Quercetin ist daher primaer von der Zuckerkomponente abhaengig. Zu einem geringern Anteil beeinflusst die Pflanzenmatrix im Falle von Buchweizenkrauttee sowohl Geschwindigkeit als auch Ausmass der Resorption. Der Resorptionsort scheint fuer Quercetin-4‘-O-glucoside und Quercetin-3-O-rutinoside unterschiedlich zu sein. Die bedeutung spezifischer carrier fuer die Resorption von Quercetinglykosiden sowie von intestinalen ß-Glucosidasen muss in weiteren Untersuchungen geklaert werden.
Development and validation of LC-MS/MS methods to determine PK/PD parameters of anti-infectives
(2014)
In the present thesis the development and validation of bioanalytical LC-MS/MS methods for the quantification of erythromycin A, erythromycin ethylsuccinate, roxithromycin, clarithromycin, 14 hydroxy clarithromycin, flucloxacillin, piperacillin and moxifloxacin in human plasma and human urine (piperacillin) is introduced. All methods were applied to analyze human plasma and urine samples from clinical trials and therefore, have been validated according to international guidelines. The methods were reliable in these studies and fulfilled all regulatory requirements known at the time of the study conduct.
Moreover, the validation data of the macrolides were compared on three different mass spectrometers (API III Plus, API 3000™, API 5000™). The new innovations in the ion source (horizontal versus vertical electrospray), the ionpath (skimmer, QJet) and the diameter of the orifice resulted in better sensitivity and a larger linearity range for the majority of the analytes. Sensitivity was improved up to a factor of 12 (for clarithromycin) between API III Plus to API 3000™ and up to a factor of 8 (for erythromycin and roxithromycin) between API 3000™ and API 5000™, keeping the accuracy and precision data at about the same level. The high sensitivity was a benefit for example for the flucloxacillin study, because concentrations from all subject samples were detectable up to approximately eight half-lives, i.e. no concentrations needed to be reported below the quantification limit. Also the linearity range were extended from two orders of magnitude to up to four orders of magnitude, which increases the likelihood to allow to analyze all samples from a pharmacokinetic study in the same run.
This is especially useful if a large concentration range needs to be analysed, for example, if the method shall be applied in an ascending dose study. Then, all low concentrations from the beginning of the study can be determined, as well as all high concentrations, without the need to dilute and analyse single samples repeatedly.
The pharmacokinetic data were compared to previously reported literature data and correlated graphically with MIC values of popular microorganisms which might be a starting point for further PK/PD investigations.
The PK/PD theory is a very helpful tool for prediction of the efficacy of given drugs against certain micro-organisms. Depending on the pharmacodynamic processes, e. g. the mode of action, three classes of drugs have been identified.
In the same way this applies to adverse effects, which need to be minimised by reducing plasma concentrations. These coherences are not well-investigated, yet, and are not discussed further in this thesis.
Still, a lot of research has to be done in this interdisciplinary field to minimise uncertainty in single values, like an AUC/MIC. These include:
Improve accuracy and precision of bioanalytical methods determining total and free concentration data in biological matrices for calculation of AUC and Cmax
These parameters are related to the MIC in pharmacodynamic considerations. Since the determination of the MIC often underlies significant variations and also differences between microbiological laboratories, the determination of concentrations of anti-infectives is particular important, being achievable by scientific exact techniques. Finally, from the volume of distribution of antibiotics can be used to derive information about intracellular concentrations and effectivity of antiinfectives.
Ätherische Öle bzw. Ätherisch-Öl Komponenten sind etabliert in der Therapie der chronischen und akuten Bronchitis. Eine klinische Studie, die mit Thymianextrakt durchgeführt wurde, ließ auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis schließen. Zahlreiche pharmakodynamische Effekte konnten in vitro für Thymianextrakt bzw. das ätherische Thymianöl gezeigt werden, jedoch wurde bis jetzt die systemische Verfügbarkeit der betreffenden Verbindungen am Zielorgan noch nicht untersucht. Diesbezügliche Untersuchungen sind notwendig, um die Verknüpfung zwischen den in vitro beobachteten Effekten und der klinischen Wirksamkeit herstellen zu können. Eine pharmakokinetische Studie wurde nach Einnahme einer Einzeldosis BronchipretTP (Filmtabletten mit 60 mg Primelwurzelextrakt und 160 mg Thymianextrakt) durchgeführt, um festzustellen, ob Thymol, das den Hauptbestandteil des ätherischen Thymianöls darstellt, zur Wirksamkeit dieser Zubereitung beitragen kann. Dazu wurde eine Extraktionsmethode für die Bestimmung von Thymol nach enzymatischer Spaltung des Phase-II-Konjugates Thymolsulfat im Plasma sowie von Thymolsulfat und Thymolglucuronid im Urin entwickelt. Es wurde eine neuartige, automatisierte headspace Festphasenmikroextraktionsmethode (HS-SPME) entwickelt, die Extraktion, Anreicherung und Probenaufgabe in einem einzigen Schritt ermöglichte. Die Quantifizierung von Thymol im unteren ng.mL-1 Bereich wurde durch die Verwendung von Gaschromatographie in Kombination mit Flammenionisationsdetektion durchgeführt. Die Automatisierung der Methode war notwendig um sie nach internationalen Richtlinien zur Validierung bioanalytischer Methoden validieren zu können. Dies ist das erste Mal, dass eine Bioverfügbarkeitsstudie bzw. eine pharmakokinetische Studie mit Hilfe der HS-SPME durchgeführt wurde. Thymol selbst war nicht systemisch verfügbar. Es war kein freies Thymol oberhalb von 1,4 ng/mL im Plasma detektierbar. Der systemisch verfügbare Phase-II-Metabolit wurde per LC-MS/MS als Thymolsulfat identifiziert. Thymolsulfat wurde nur im Plasma detektiert, wohingegen sowohl Thymolsulfat als auch Thymolglucuronid im Urin nachgewiesen wurden. Im Urin wurde kein freies Thyxmol oberhalb von 2,1 ng/mL detektiert. Da Thymol nur in Form von Thymolsulfat systemisch verfügbar war, wurde die pharmakokinetische Auswertung an Hand der sich nach enzymatischer Spaltung von Thymolsulfat ergebenden Daten vorgenommen. Die pharmakokinetische Studie wurde nach Verabreichung einer Einzeldosis BronchipretTP (1,08 mg Thymol) mit 12 Probanden durchgeführt. Die Resorption von Thymol war frühzeitig. Bereits nach 20 min konnte Thymol im hydrolisierten Plasma nachgewiesen werden. Maximale Plasmakonzentrationen (cmax) von 93,1±24,5 ng/mL (MW±SD) wurden nach 1,97±0,77 h (tmax) (MW±SD) erreicht. Die Plasmakonzentrationen zeigten einen biphasischen Verlauf und die terminale Eliminationphase setzte nach ca. 10 h ein. Die Eliminationshalbwertszeit errechnete sich zu 10,2 h. Dies betont die Wichtigkeit entsprechend langer Meßzeiträume in Verbindung mit einer hoch sensitiven Analytik, um die Elimination vollständig erfassen zu können. Bezogen auf die verabreichte Thymoldosis (1,08 mg) wurden 16,2±4,5 Prozent (MW±SD) mit unverändertem Thymolgrundgerüst renal eliminiert. Die renale Clearance von 271±156 mL/h (MW±SD) indiziert eine hohe Plasmaeiweißbindung und/oder tubuläre Reabsorption. Die Daten deuten darauf hin, dass die klinische Wirksamkeit nach Applikation einer thymianextrakthaltigen Zubereitung auf Thymolsulfat oder mögliche Phase-I-Metabolite zurückzuführen sein könnte. Die pharmakodynamischen Effekte dieser Verbindungen wurden bislang noch nicht untersucht. Andererseits könnte die Aktivität von Sulfatasen im Lungengewebe die pulmonale Elimination von Thymol erklären. Freies Thymol könnte somit am Respirationstrakt wirksam sein, obwohl es im Plasma nicht detektiert wurde.
Sekundäre Pflanzenstoffe zeichnen sich wegen ihrer heterogenen Zusammensetzung und großen Strukturvariabilität durch eine komplexe Pharmakokinetik aus. Wissen um die Pharmakokinetik ist wiederum für die Beurteilung von pharmakodynamischen Prozessen unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war es durch die Bestimmung wichtiger pharmakokinetischer Parameter zur Erweiterung des Verständnisses um die Verteilung von verschiedenen Bestandteilen und Metaboliten eines standardisierten Extraktes der französischen Meereskieker (pinus pinaster) im menschlichen Körper beizutragen. Es erfolgte zunächst, unter Verwendung zweier verschiedener Methoden, die Bestimmung der Plasmaproteinbindung dieser Substanzen. Hierbei fand eine affinitätschromatographische Methode mit immobilisiertem Albumin Anwendung. Die Flavonoide Taxifolin, (+)-Catechin sowie das Catechindimer Procyanidin B1 zeigten eine, aufgrund der vorliegenden Polyphenolstruktur der Substanzen gut erklärbare ausgeprägte Bindung, während für Kaffesäure, Ferulasäure und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton (Metabolit M1), das in vivo als Metabolit aus(+)-Catechin gebildet wird, eine wesentlich geringere Affinität zu Albumin ermittelt werden konnte. Desweiteren kam eine Filtrationsmethode zur Anwendung, die durch Abtrennung der Proteine aus dem Plasma eine Bestimmung der Bindung ermöglichte. Um die in Vorversuchen gezeigte ausgeprägte unspezifische Bindung der Flavonoide (+)-Catechin und Taxifolin an Membran- und Gefäßoberflächen zu minimieren wurde eine Vorbehandlung der Membranen vorgenommen. Die Resultate beider Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung, ausgenommen der bei der Ultrafiltration erhaltenen geringen Proteinbindung des Procyanidin B1. Auch die Ultrafiltrationsmethode ergab für Taxifolin und (+)-Catechin eine beinahe vollständige Bindung. Für die Phenolcarbonsäuren Ferulasäure und Kaffeesäure sowie den Metaboliten M1 hingegen ergaben sich geringere Affinitäten so dass die Ergebnisse der affinitätschromatographischen Methode bestätigt und durch die Verwendung von zwei verschiedenen unabhängigen Bestimmungsansätzen eine gesteigerte Aussagekraft der Resultate erreicht werden konnte. Eine weitere Ergänzung der Aufklärung des pharmakokinetischen Profils erfolgte durch die Ermittlung der Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und verschiedenen Blutzellen. Insbesondere für den Metaboliten M1 zeigte sich bei einigen der Versuche eine ausgeprägte Affinität zu Erythrozyten und mononukleären Zellen. Ob diesem Phänomen möglicherweise aktive Transportmechanismen zu Grunde lagen sollte durch weiterführende Betrachtungen geklärt werden. Die Untersuchungen ergaben, dass an dieser Verteilung weder ein Aminosäuretransporter noch das para-Glykoprotein beteiligt gewesen waren, jedoch ließen ergänzende Versuche den Schluss zu, dass eine erleichterte Diffusion in das Zellinnere durch den Glucose-Transporter GLUT-1 ermöglicht werden könnte. Diese Vermutung wurde durch vergleichende Energiefeld-,Oberflächen-, und Volumenberechnungen zwischen dem natürlichen Substrat des Transporters Glucose und dem Metaboliten M1 gestützt. Aufbauend auf den Ergebnissen der Verteilungsversuche wurde ein möglicher intrazellulärer Metabolismus der Substanzen in Erythrozyten und mononukleären Zellen, insbesondere durch Reaktionen des Phase II Metabolismus, untersucht. Mittels massenspektrometrischer Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bildung eines Addukts zwischen Glutathion und dem Metaboliten M1 in Erythrozyten gefunden werden. Abschließend wurde durch die Bestimmung der protektiven Eigenschaften des Metaboliten M1 gegen oxidative Schädigungen der Erythrozytenmembran auch ein pharmakodynamischer Aspekt dieser Verbindung hinzugefügt. Zwar zeigte sich bereits in einem Konzentrationsbereich von 1 μM eine ausgeprägte antioxidative Aktivität des Metaboliten M1, jedoch konnte kein Hinweis auf Beeinflussung oxidativer Membranschädigungen durch möglicherweise intrazellulär gebildete Konjugate obiger Verbindung gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten für verschiedene Bestandteile eines Kiefernrindenextraktes und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton Plasmaproteinbindungen und erstmals die Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und Blutzellen ermittelt werden. Insbesondere die in einigen Versuchen gezeigte Aufnahme bzw. Adsorption könnte einen Beitrag zur Klärung der Beobachtung liefern, dass eine deutliche Diskrepanz gefunden wurde zwischen in vivo gemessenen Plasmakonzentrationen, welche in vitro nicht ausreichend sind um deutliche Effekte auszulösen und Ergebnissen aus ex vivo Untersuchungen, die eine deutliche Beeinflussung insbesondere antiinflammatorischer Prozesse zeigten.