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Das Opc-Protein ist ein Außenmembranprotein von Meningokokken, das über extrazelluläre Matrixproteine mit Integrinen der Wirtszelle interagiert. Opc ist in Menschen immunogen und induziert bakterizide Antikörper. Das Opc-Protein wurde daher als aussichtsreicher Impfstoff-Kandidat angesehen, da es außerdem relativ gut konserviert ist. Allerdings wird das Opc-Protein nicht von allen Meningokokkenstämmen exprimiert. Einerseits fehlt das opc-Gen in einigen klonalen Komplexen (z.B. ST-8, ST-11, ST-53), andererseits ist die Opc-Expression nicht konstitutiv wegen einer phasenvariablen Transkription, die auf einem Poly-Cytidin-Bereich im Promotor des opc-Gens beruht.
In dieser Arbeit wurde die Präsenz des opc-Gens und die Opc-Expression in zwei großen Sammlungen deutscher Meningokokkenisolate von invasiven Erkrankungen (n=1141) und gesunden Trägern (n=792) untersucht.
Das opc-Gen war bei 71% der invasiven und 77% der Trägerstämme nachweisbar. Der größte Teil der opc-Gen negativen Stämme gehörte zu den klonalen Komplexen ST-8, ST-11, ST-213, ST-231, ST-334 und ST-53.
Der Anteil opc-positiver Stämme, die Opc in vitro exprimieren, war bei den invasiven Stämmen kleiner als bei den Trägerstämmen (13% vs. 29%, p<0,001, Chi-square-Test).
Der größere Anteil Opc-exprimierender Trägerstämme ist u.a. am ehesten mit der Überrepräsentation von wenig pathogenen klonalen Komplexen (ST-23, ST-35, ST-198) mit einer hohen Opc-Expressionsrate zu erklären.
24 von den 176 invasiven Stämmen mit einer Anzahl von 11 - 14 Cs in der Promotor-Region, die die Opc-Expression begünstigt, zeigten weder im ELISA noch im Westernblot eine Opc-Expression. Bei 14 dieser 24 Stämme wurde als Ursache ein phasenvariabler, intragenischer Poly-Adenin-Bereich identifiziert, der zu einer Leserasterverschiebung führte.
Die Vermutung mehrerer Autoren, dass die Opc-Expression mit dem klinischen Bild der Meningitis verknüpft ist, konnte mit der hier genutzten großen Stammsammlung nicht bestätigt werden. Invasive Stämme, die das Opc-Protein exprimierten, wurden genauso häufig von Patienten mit dem klinischen Bild der Meningitis isoliert wie Stämme, die das Opc-Protein nicht exprimierten (46% vs. 47%, Chi-square-Test: p<0,9). Allerdings gibt es eine starke Assoziation der Gegenwart des opc-Gens mit dem klinischen Merkmal Meningitis. Dieser Befund gibt Anlass zu der Hypothese, dass in vitro und in vivo Expression von Opc sich unterscheiden.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Opc-Protein nur in 19,8% aller Isolate (invasive und Trägerstämme zusammengenommen) exprimiert wurde. Es zeigte sich eine Tendenz zu häufigerer Opc-Expression in apathogenen Trägerisolaten. Das Vorhandensein des opc-Gens, nicht aber die in vitro Expression konnten mit dem klinischen Merkmal Meningitis assoziiert werden. Zusätzlich wurde ein weiterer Mechanismus der intragenischen Phasenvariation beschrieben.
Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is a human commensal that occasionally causes life-threatening infections such as bacterial meningitis and septicemia. Despite experi-mental evidence that the expression of small non-coding RNAs (sRNAs) as well as the RNA chaperone Hfq affect meningococcal physiology, the impact of RNA-based regula-tion (riboregulation) on fitness and virulence in N. meningitidis is only poorly understood. Therefore, this study addressed these issues using a combination of high-throughput tech-nologies.
A differential RNA-sequencing (dRNA-seq) approach was applied to produce a single-nucleotide resolution map of the primary transcriptome of N. meningitidis strain 8013. The dRNA-seq analysis predicted 1,625 transcriptional start sites including 65 putative sRNAs, of which 20 were further validated by northern blot analysis. By Hfq RNA im-munopreci-pitation sequencing a large Hfq-centered post-transcriptional regulatory net-work comprising 23 sRNAs and 401 potential mRNA targets was identified. Rifampicin stability assays demonstrated that Hfq binding confers enhanced stability on its associat-ed sRNAs. Based on these data, the interactions of two paralogous sRNAs and their cog-nate target mRNA prpB were validated in vivo as well as in vitro. Both sRNAs directly repress prpB encoding a methylisocitrate lyse which was previously shown to be involved in meningococcal colonization of the human nasopharynx.
Besides the well-described RNA chaperone Hfq, FinO-domain proteins have recently been recognized as a widespread family of RNA-binding proteins (RBPs) with regulatory roles in diverse bacteria. They display an intriguing bandwidth of target sites, ranging from a single RNA pair as recognized by plasmid-encoded FinO to the global RNA regu-lons of enterobacterial ProQ proteins. To better understand the intrinsic targeting mode of this RBP family, in vivo targets of the minimal ProQ protein of N. meningitidis were de-termined. In vivo UV crosslinking with RNA deep sequencing (UV-CLIP) identified as-sociations of ProQ with 16 sRNAs and 166 mRNAs encoding a variety of biological functions and thus revealed ProQ as another global RBP in meningococci. It could be shown that meningococcal ProQ predominantly binds to highly structured RNA regions including DNA uptake sequences (DUS) and rho-independent transcription terminators and stabilizes many of its RNA targets as proved by rifampicin stability experiments. As expected from the large suite of ProQ-bound RNAs, proQ deletion globally affects both gene and protein expression in N. meningitidis, changing the expression levels of at least 244 mRNAs and 80 proteins. Phenotypic analyses suggested that ProQ promotes oxida-tive stress tolerance and UV damage repair capacity, both of which are required for full virulence of N. meningitidis.
Together, this work uncovers the co-existence of two major post-transcriptional regulons, one governed by ProQ, the other by Hfq, in N. meningitidis. It further highlights the role of these distinct RBPs and its associated sRNAs to bacterial virulence and indicates that riboregulation is likely to contribute to the way how meningococci adapt to different host niches.
FinO-domain proteins are a widespread family of bacterial RNA-binding proteins with regulatory functions. Their target spectrum ranges from a single RNA pair, in the case of plasmid-encoded FinO, to global RNA regulons, as with enterobacterial ProQ. To assess whether the FinO domain itself is intrinsically selective or promiscuous, we determine in vivo targets of Neisseria meningitidis, which consists of solely a FinO domain. UV-CLIP-seq identifies associations with 16 small non-coding sRNAs and 166 mRNAs. Meningococcal ProQ predominantly binds to highly structured regions and generally acts to stabilize its RNA targets. Loss of ProQ alters transcript levels of >250 genes, demonstrating that this minimal ProQ protein impacts gene expression globally. Phenotypic analyses indicate that ProQ promotes oxidative stress resistance and DNA damage repair. We conclude that FinO domain proteins recognize some abundant type of RNA shape and evolve RNA binding selectivity through acquisition of additional regions that constrain target recognition. FinO-domain proteins are bacterial RNA-binding proteins with a wide range of target specificities. Here, the authors employ UV CLIP-seq and show that minimal ProQ protein of Neisseria meningitidis binds to various small non-coding RNAs and mRNAs involved in virulence.
Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren.
Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff.
Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%.
Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden.
Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen.
Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen.
Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern.
Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen.
Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten.
In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden.
In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann.
Neisseria meningitidis ist ein wichtiger Erreger von Meningitis und Sepsis insbesondere bei jungen Menschen, gleichzeitig sind hohe Raten asymptomatischen Trägertums bekannt. Als die Virulenz begünstigende Faktoren wurden unter anderem die Kapsel, Pili, äußere Membranvesikel (OMV) und Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert, die es dem Erreger erleichtern, das menschliche Immunsystem zu überwinden.
Dabei war bisher die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) als neu beschriebene Komponente der angeborenen Immunantwort nicht untersucht worden. NETs stellen spinnennetzartige DNA-Strukturen mit globulären Proteindomänen dar, die aus neutrophilen Granulozyten entstehen und als antimikrobiell gelten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von NETs auf Meningokokken zu charakterisieren und mögliche Resistenzmechanismen der Bakterien zu identifizieren.
In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass Meningokokken an NETs binden und durch diese in ihrer Proliferation gehemmt werden. Eine Lokalisation der Bakterien an die NETs konnte dargestellt werden, LPS und Pili wurden als wichtige Strukturen für die Vermittlung der NET-Bindung identifiziert. OMVs zeigten sich als protektiv gegenüber dem Einfluss der NETs, indem sie die Bindung der Erreger an die NETs blockierten.
Wenig empfindlich zeigten sich die Bakterien gegenüber Histonen als den quantitativ bedeutsamsten NET-Proteinen. Meningokokken schützen sich gegenüber dem Einfluss der NETs durch Ausbildung von Kapsel und LPS mit intakter Phosphoethanolamin-Modifikation. Ebenso vermitteln zwei Cathelicidin-Resistenzgene den Bakterien einen Überlebensvorteil. Keine Rolle bei der NET-Resistenz spielten die untersuchten Effluxmechanismen.
Neuere Untersuchungen von Lappann et al. indentifizierten Meningokokken und OMVs als potente NET-Induktoren. Damit könnten durch die relativ NET-resistenten Mikroorganismen andere Abwehrmechanismen der Neutrophilen konterkariert werden und eine Immunevasion begünstigt werden. Genauere Untersuchungen diesbezüglich stehen noch aus.
Objective
The aim of this study was to determine the prevalence of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, group A Streptococcus (GAS), and Staphylococcus aureus in asymptomatic elderly people and to unravel risk factors leading to colonization.
Methods
A multi-centre cross-sectional study was conducted including 677 asymptomatic adults aged 65 years or more, living at home or in nursing homes. Study areas were Greater Aachen (North-Rhine-Westphalia) and Wuerzburg (Bavaria), both regions with medium to high population density. Nasal and oropharyngeal swabs as well as questionnaires were collected from October 2012 to May 2013. Statistical analysis included multiple logistic regression models.
Results
The carriage rate was 1.9% ([95%CI: 1.0–3.3%]; 13/677) for H. influenzae, 0.3% ([95%CI: 0–1.1%]; 2/677) for N. meningitidis and 0% ([95% CI: 0–0.5%]; 0/677) for S. pneumoniae and GAS. Staphylococcus aureus was harboured by 28.5% of the individuals ([95% CI: 25.1–32.1%]; 193/677) and 0.7% ([95% CI: 0.2–1.7%]; 5/677) were positive for methicillin-resistant S. aureus. Among elderly community-dwellers colonization with S. aureus was significantly associated with higher educational level (adjusted OR: 1.905 [95% CI: 1.248–2.908]; p = 0.003). Among nursing home residents colonization was associated with being married (adjusted OR: 3.367 [1.502–7.546]; p = 0.003).
Conclusion
The prevalence of N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae and GAS was low among older people in Germany. The S. aureus rate was expectedly high, while MRSA was found in less than 1% of the individuals.
Neisseria meningitidis (the meningococcus) is one of the major causes of bacterial meningitis, a life-threatening inflammation of the meninges. Traversal of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier (mBCSFB), which is composed of highly specialized brain endothelial cells (BECs), and subsequent interaction with leptomeningeal cells (LMCs) are critical for disease progression. Due to the human-exclusive tropism of N. meningitidis, research on this complex host-pathogen interaction is mostly limited to in vitro studies. Previous studies have primarily used peripheral or immortalized BECs alone, which do not retain relevant barrier phenotypes in culture. To study meningococcal interaction with the mBCSFB in a physiologically more accurate context, BEC-LMC co-culture models were developed in this project using BEC-like cells derived from induced pluripotent stem cells (iBECs) or hCMEC/D3 cells in combination with LMCs derived from tumor biopsies.
Distinct BEC and LMC layers as well as characteristic expression of cellular markers were observed using transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence staining. Clear junctional expression of brain endothelial tight and adherens junction proteins was detected in the iBEC layer. LMC co-culture increased iBEC barrier tightness and stability over a period of seven days, as determined by sodium fluorescein (NaF) permeability and transendothelial electrical resistance (TEER). Infection experiments demonstrated comparable meningococcal adhesion and invasion of the BEC layer in all models tested, consistent with previously published data. While only few bacteria crossed the iBEC-LMC barrier initially, transmigration rates increased substantially over 24 hours, despite constant high TEER. After 24 hours of infection, deterioration of the barrier properties was observed including loss of TEER and altered expression of tight and adherens junction components. Reduced mRNA levels of ZO-1, claudin-5, and VE-cadherin were detected in BECs from all models. qPCR and siRNA knockdown data suggested that transcriptional downregulation of these genes was potentially but not solely mediated by Snail1. Immunofluorescence staining showed reduced junctional coverage of occludin, indicating N. meningitidis-induced post-transcriptional modulation of this protein, as previous studies have suggested. Together, these results suggest a potential combination of transcellular and paracellular meningococcal traversal of the mBCSFB, with the more accessible paracellular route becoming available upon barrier disruption after prolonged N. meningitidis infection. Finally, N. meningitidis induced cellular expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines such as IL-8 in all mBCSFB models. Overall, the work described in this thesis highlights the usefulness of advanced in vitro models of the mBCSFB that mimic native physiology and exhibit relevant barrier properties to study infection with meningeal pathogens such as N. meningitidis.
Meningococcal meningitis is a severe central nervous system infection that occurs when Neisseria meningitidis (Nm) penetrates brain endothelial cells (BECs) of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier. As a human-specific pathogen, in vivo models are greatly limited and pose a significant challenge. In vitro cell models have been developed, however, most lack critical BEC phenotypes limiting their usefulness. Human BECs generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) retain BEC properties and offer the prospect of modeling the human-specific Nm interaction with BECs. Here, we exploit iPSC-BECs as a novel cellular model to study Nm host-pathogen interactions, and provide an overview of host responses to Nm infection. Using iPSC-BECs, we first confirmed that multiple Nm strains and mutants follow similar phenotypes to previously described models. The recruitment of the recently published pilus adhesin receptor CD147 underneath meningococcal microcolonies could be verified in iPSC-BECs. Nm was also observed to significantly increase the expression of pro-inflammatory and neutrophil-specific chemokines IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8, and CCL20, and the secretion of IFN-γ and RANTES. For the first time, we directly observe that Nm disrupts the three tight junction proteins ZO-1, Occludin, and Claudin-5, which become frayed and/or discontinuous in BECs upon Nm challenge. In accordance with tight junction loss, a sharp loss in trans-endothelial electrical resistance, and an increase in sodium fluorescein permeability and in bacterial transmigration, was observed. Finally, we established RNA-Seq of sorted, infected iPSC-BECs, providing expression data of Nm-responsive host genes. Altogether, this model provides novel insights into Nm pathogenesis, including an impact of Nm on barrier properties and tight junction complexes, and suggests that the paracellular route may contribute to Nm traversal of BECs.
Bacterial meningitis occurs when blood-borne bacteria are able to penetrate highly specialized brain endothelial cells (BECs) and gain access to the meninges. Neisseria meningitidis (Nm) is a human-exclusive pathogen for which suitable in vitro models are severely lacking. Until recently, modeling BEC-Nm interactions has been almost exclusively limited to immortalized human cells that lack proper BEC phenotypes. Specifically, these in vitro models lack barrier properties, and continuous tight junctions. Alternatively, humanized mice have been used, but these must rely on known interactions and have limited translatability. This motivates the need to establish novel human-based in vitro BEC models that have barrier phenotypes to research Nm-BEC interactions. Recently, a human induced pluripotent stem cell (iPSC) model of BECs has been developed that possesses superior BEC phenotypes and closely mimics the in vivo blood vessels present at the blood-meningeal barrier.
Here, iPSC-BECs were tested as a novel cellular model to study Nm-host pathogen interactions, with focus on host responses to Nm infection. Two wild type strains and three mutant strains of Nm were used to confirm that these followed similar phenotypes to previously described models. Importantly, the recruitment of the recently published pilus adhesin receptor CD147 underneath meningococcal microcolonies could be verified in iPSC-BECs. Nm was also observed to significantly increase the expression of pro-inflammatory and neutrophil-specific chemokines IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8, and CCL20, at distinct time points of infection, and the secretion of IFN γ and RANTES by iPSC-BECs. Nm was directly observed to disrupt tight junction proteins ZO-1, Occludin, and Claudin-5 at late time points of infection, which became frayed and/or discontinuous upon infection. This destruction is preceded by, and might be dependent on, SNAI1 activation (a transcriptional repressor of tight junction proteins). In accordance with tight junction loss, a sharp loss in trans-endothelial electrical resistance, and an increase in sodium fluorescein permeability was observed at late infection time points. Notably, bacterial transmigration correlated with junctional disruption, indicating that the paracellular route contributes for bacterial crossing of BECs. Finally, RNA-Sequencing (RNA-Seq) of sorted, infected iPSC-BECs was established through the use of fluorescence-activated cell sorting (FACS) techniques following infection. This allowed the detection of expression data of Nm-responsive host genes not previously described thus far to play a role during meningitidis.
In conclusion, here the utility of iPSC-BECs in vitro to study Nm infection could be demonstrated. This is the first BEC in vitro model to express all major BEC tight junctions and to display high barrier potential. Altogether, here this model provides novel insights into Nm pathogenesis, including an impact of Nm on barrier properties and tight junction complexes and suggests that the paracellular route contributes to Nm traversal of BECs.