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Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Die opportunistische Hefe Candida albicans ist in der Lage durch ein koordiniertes Zusammenspiel bestimmter zellulärer Eigenschaften sich unterschiedlichen Umweltbedingungen anzupassen und unterschiedliche Nischen innerhalb des menschlichen Wirts zu kolonisieren. Die Sekretion hydrolytischer Enzyme, wie Proteinasen und Phospholipasen, stellt eine wichtige Eigenschaft des Pilzes dar, die als wesentlicher Faktor für die Aufrechterhaltung der Pathogenität von C. albicans angesehen wird. Ein Schwerpunkt der hier vorliegenden Studie ist die funktionale Charakterisierung des caPLB5-Gens, eines neuen Mitglieds der insgesamt 5 Mitglieder umfassenden Phospholipase-B-Genfamilie. Im Gegensatz zu den gut untersuchten sekretorischen PLBs caPlb1p and caPlb2p scheint das caPlb5-Protein GPI-verankert und letztlich zellwandgebunden zu sein. Mittels Northernexpressions-Studien ließen sich in verschiedenen C.-albicans-Stämmen und unterschiedlichen Wachstumsbedingungen caPLB5-spezifische Transkripte nachweisen. Während des Hefe-Hyphe-Wechsels in Lee’s Medium zeigte sich interessanterweise eine differentielle Regulation der Gene caPLB5, caPLB1 and caPLB2. Durch Sequenzanalyse einzelner caPLB5-Allele konnte die Anwesenheit zweier unterschiedlicher Allele in C. albicans bei verschiedenen Stämmen nachgewiesen werden. Die gezielte Geninaktivierung beider Allele in zwei verschiedenen Stämmen resultierte in einer attenuierten Virulenz, was sich im Mausmodell für systemische Infektion anhand des Kolonisationsgrads des Wirtsgewebes messen ließ. Die Phänotypen sowohl der Nullmutanten als auch der caPLB5-Revertanten belegen, dass die Phospholipase B caPlb5p für die vollständige Virulenz des Pathogens benötigt wird und dabei eine Rolle bei der in vivo Organbesiedlung spielt. Diese Arbeit präsentiert zudem die Isolierung und Charakterisierung des ATP-Binding-Cassette-(ABC)-Transporter-Gens caMLT1 aus C. albicans. CaMlt1p zählt zur MRP/CFTR-Unterfamilie ATP-bindender Transportproteine, eine Proteinkategorie, die in diesem Pilz bislang noch nicht beschrieben wurde. Energiebetriebene Transportproteine der ABC-Superfamilie schleusen eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate aktiv durch biologische Membranen und erfüllen dabei wichtige Funktionen im zellulären Metabolismus und in der Entgiftung. Das caMlt1-Protein zeigt hohe sequenzielle und strukturelle Ähnlichkeiten zu den vakuolaren Efflux-Pumpen Ycf1p und Bpt1p von S. cerevisiae. Durch genomische Markierung mit dem grün fluoreszierenden GFP-Protein konnte caMlt1p in der vakuolaren Membran lokalisiert werden. Northernblothybridisierungen belegten die Induzierbarkeit der Gentranskripte durch die metabolischen Gifte Cadmium und CDNB, beides Substrate der scYcf1-Pumpe. Obwohl diese Untersuchungen darauf hindeuten, dass caMlt1p ein Ortholog von scYcf1p sein könnte, zeigte sich bei dem Komplementationsversuch einer scycf1-negativen S.-cerevisiae-Mutante mit einer caMLT1-Genkopie keine Reversion des sensitiven Phänotyps gegenüber Cadmium oder CDNB. Auch wiesen die in dieser Arbeit konstruierten, camlt1-negativen Mutanten in C. albicans, die zur Identifizierung potentieller caMlt1p-Substrate eingesetzt wurden, keinen hypersensitiven Phänotyp gegenüber CdCl2, CDNB oder irgendeiner anderen getesteten inhibitorischen Substanz auf. CaMlt1p ist demzufolge kein funktionales Homolog von scYcf1p. Als vakuolar lokalisiertes Protein weist caMLT1 ein für diese Proteingruppe typisches Transkriptionsprofil auf. Die mRNA-Expression erfolgt dabei wachstumsphasenabhängig mit der höchsten Geninduktion während des Diauxic-Shifts, wenn ein Mangel an Glucose (und anderen Nährstoffen) im Medium entsteht. Eine generierte camlt1-Nullmutante war interessanterweise in einem murinen Peritonitismodell in ihrer Fähigkeit die Leber zu invadieren drastisch reduziert. Durch Reintegration einer funktionalen caMLT1-Genkopie konnte der Virulenzdefekt aufgehoben werden. CaMlt1p scheint in die Fähigkeit von C. albicans involviert zu sein an intestinale Organe adhärieren und Gewebebarrieren penetrieren zu können, möglicherweise durch Einbindung des Transporters in Stressantwort- und Detoxifikationsmechanismen. Beide Gene, caMLT1 und caPLB5, wurden auf zweierlei Weise inaktiviert: mittels einer klassischen Mutagenesemethode für C. albicans (dem URA3-Blaster-System im Ura--auxotrophen Stamm CAI4) und durch Entwicklung eines neuen dominanten Selektionssysstems. Die dominante Selektion basiert dabei auf der genomischen Insertion einer Einzelkopie eines mutierten caIMH3-Allels (MPAR), das Transformanten Resistenz gegenüber Mycophenolsäure (MPA) verleiht. Dieses System ermöglicht die genetische Manipulation von C. albicans Wildtypstämmen, wodurch die mühselige Konstruktion auxotropher und oft avirulenter Stämme nicht mehr nötig ist.