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Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM) ist eine Autoimmunerkrankung, welche durch die progrediente Schä¬digung der βZellen der Pankreas mit dadurch resultierendem absolutem Insulin¬mangel gekennzeichnet ist. Obwohl sich eine Vielzahl an Studien in den ver¬gangenen Jahrzehnten den zellulären Grundlagen dieser Erkrankung ge¬widmet hat, fehlt bis dato ein geeigneter kausaler Therapieansatz, sodass nach wie vor lediglich die eher symptomatisch orientierte Insulin-Substitution im Vor-dergrund steht.
Die hier vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der genauen Charakterisierung von Immunzellen – insbesondere Lymphozyten – aus dem peripheren Blut er¬krankter Kinder mit dem Ziel, Verschiebungen im Phänotyp dieser Zellen aufzudecken, um potenzielle Ansatzpunkte zur weiteren Forschung und Therapiefindung zu finden. Hierfür wurde die Durchflusszytometrie genutzt, um den genauen Phänotyp der Lymphozyten zu untersuchen und Veränderungen im Oberflächenmarker-Expressionsmuster einzelner spezifischer Subpopulati¬onen zuweisen zu können.
In erster Linie wurden hierbei zwei Zellpopulationen identifiziert, welche bei erkrankten Kindern deutlich vermehrt im peripheren Blut vorkommen, als bei gesunden Vergleichspersonen.
Die Erste dieser Populationen sind CCR6-exprimierende CD4+ Zellen. Dies ist interessant, da CCR6 in verschiedenen früheren Studien mit Autoim¬munität in Verbindung gebracht wurde. In der weiteren Analyse zeigte sich, dass eine erhöhte IFNγ-Produktion in der vermutlich selben Zellpopulation vorlag, die auch CCR6 verstärkt exprimierte (Gedächtnis-T-Zellen vom Typ CD4+CD45RO+CCR7+CD28+), während kein Anhalt auf eine geänderte IL 17-Produktion gesehen wer¬den konnte.
Die zweite in unserer Studie bei T1DM deutlich vermehrte Zellpopulation sind CXCR3-exprimierende CD8+ Zellen. Hierbei handelte es sich in erster Linie um Zellen, welche auch CCR7 exprimierten.
In der hier vorliegenden Studie wurde die T1DM-Gruppe außerdem aufgeteilt nach der Krankheitsdauer (recent onset T1DM RO und long-standing T1DM LS), um im Krankheitsverlauf entstehende Veränderungen erkennen zu können. Es konnten jedoch insgesamt keine klaren derartigen Veränderungen festgestellt werden, was allerdings möglicherweise auch an einer zu geringen überblickten Zeitspanne liegen könnte (geringe durchschnittliche und maximale Krankheitsdauer).
Aufgrund unserer Ergebnisse kann spekuliert werden, dass es sich bei den prozentuell vermehrt auftre¬tenden CCR6+ Zellen um IFNγ-produzierende Zellen handelt. Dies würde neueren Erkenntnissen von anderen Studien entsprechen, welche nicht – wie zuvor vermu¬tet wurde – Th17 Zellen, sondern nicht-klassische Th1 Zellen als pathogene Population diskutieren. Ein quantitativer Mangel an Treg als Ursache der ge¬steigerten IFNγ-Produktion erscheint nach unseren Ergebnissen unwahrscheinlich, da wir erhöhte Mengen CD25+CD127 /dim Zellen bei T1DM nachweisen konnten.
Die beobachtete Koexpression von CXCR3 und CCR7 ist interessant vor dem Hintergrund, dass CXCR3-Überexpression im Pankreas in einer früheren Studie mit T1DM in Verbindung gebracht wurde, jedoch eine CXCR3-Blockade bisher keinen geeigneten therapeutischen Ansatz lieferte. Zunächst kann hier aber nur eine Assoziation beschrieben werden, wobei ein kausaler Zusammenhang in geeigneten Studiendesigns überprüft werden müsste.
Eine genauere Betrachtung der CD8+CCR7+CXCR3+ Zellen könnte nach unserer Ansicht interessante neue Aspekte und potenzielle Therapieansätze offenlegen. Insbesondere scheint die Untersuchung CCR7-vermittelter Migration dieser Zel¬len einen geeigneten Studienansatz darzustellen. Ebenso verweisen unsere Er-gebnisse erneut auf eine pathogene Rolle CCR6-exprimierender Zellen, welche in kommenden Studien näher beleuchtet werden sollte.
T-Zell-Charakterisierung im peripheren Blut bei Kindern mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
(2019)
Die Inzidenz von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), insbesondere von Morbus Crohn (MC), nimmt weltweit zu, was auch eine Vielzahl an Kindern betrifft. Obwohl die Krankheit in den letzten Jahrzehnten Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten war, ist die Pathogenese nicht abschließend geklärt.
Diese Arbeit vergleicht T-Zellen gesunder pädiatrischer Probanden mit T-Zellen pädiatrischer CED Patienten mittels Flowcytometrie unter Berücksichtigung von Differenzierungsstadium, Krankheitsaktivität, Therapie und CMV-Status.
Die Verteilung der T-Zell-Subpopulationen zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten und Kontrollen, jedoch zeigen sich für TH1 und TH17 Zellen Unterschiede zwischen MC Patienten und Kontrollen, welche auch mit Krankheitsaktivität und Therapie korrelieren. Der Anteil von CXCR3+ Zellen ist innerhalb der CD4+ Memory-Populationen und innerhalb der CD8+ Memory- und Effektor-Populationen bei MC Patienten – vor allem mit aktiver Erkrankung bzw. ohne Therapie – deutlich geringer als bei Kontrollen. Gleichzeitig zeigt sich der Anteil an CCR6+ Zellen sowie der Anteil an IL 17+CCR6+ Zellen bei MC Patienten in Remission sowie unter Therapie mit TNFα-Blockern höher als bei Kontrollen. Zudem sind die Effektor-Zell-Gleichgewichte bei MC zugunsten von TH17 Zellen verschoben. Somit unterstützt die Arbeit die weitverbreitete Hypothese einer gesteigerten TH17-Antwort bei MC. Auch zeigt sich eine Verminderung der TH1-Zellen im peripheren Blut bei aktiv erkrankten MC Patienten im Vergleich zu Kontrollen, was sich möglicherweise durch eine Abwanderung oder Umwandlung dieser Zellen bei aktivem MC erklären lässt.
Desweiteren zeigt sich, dass CED Patienten eine verstärkte Neigung zur vorzeitigen Immunoseneszenz aufzuweisen scheinen, was durch eine latente CMV-Infektion nochmals verstärkt erscheint. Einige CMV-assoziierte Veränderungen der T-Zell-Differenzierung, wie z.B. die CD45RA-Reexpression sowie die TNFα- und IFNγ-Mehrexpression, zeigen sich bei CMV+ CED Patienten zudem ausgeprägter als bei CMV+ Kontrollen. Interessant ist daher, dass CMV+ Probanden und CED Patienten Veränderungen aufweisen, die sich teilweise zu addieren scheinen.
Die Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Strukturen ist eine grundlegende Herausforderung der spezifischen Immunantwort. Pathologische Veränderungen dieser Abgrenzung können zu schwerwiegenden Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Diabetes Mellitus, Rheumatischer Arthritis oder Multipler Sklerose führen. Um unerwünschte (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern, existieren verschiedene Formen von peripheren Toleranzmechanismen, die durch viele Transkriptionsfaktoren wie z. B. ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells) und Foxp3 (forkhead box protein p3) kontrolliert werden. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) sind spezialisierte immun-suppressive Lymphozyten, welche die Aktivierung anderer Immunzellen unterdrücken können. Einer der möglichen Mechanismen ist der Transfer zyklischen Adenosin-Monophosphats (cAMP) von Tregs in konventionelle T- und B-Lymphozyten. Die erhöhte intrazelluläre Konzentration an cAMP führt in Effektorzellen zur Induktion und Kerntranslokation von ICER. Der transkriptionelle Repressor ICER supprimiert die Expression vieler NFAT-regulierter Gene und hemmt darüber hinaus die Induktion der NFATc1/αA-Isoform selbst. Diese Isoform wird speziell in pro-inflammatorischen Effektorzellen hochreguliert und ist maßgeblich an deren spezifischem transkriptionellen Programm beteiligt. Foxp3 ist ein zentraler Faktor für die Bildung und Funktion sowohl Thymus-generierter nTregs als auch peripher (TGFβ-) induzierter iTregs. Die Kontrolle des Foxp3-Gens wird in iTregs – überraschenderweise aber nicht in nTregs – durch NFAT-Faktoren reguliert. Allerdings hemmt Foxp3 durch eine negative Rückkopplung wiederum die Induktion und Aktivität von NFATc1/αA. Dies stellt somit ein weiteres Regulativ dar, wobei Foxp3 nicht nur die Plastizität, sondern auch die Funktion von immun-suppressiven T-Zellen steuert. Zusätzlich regulieren die verschiedenen NFAT-Faktoren auch die Antigen präsentierenden dendritischen Zellen (DCs). Während NFATc1 und NFATc2 die Differenzierung und Proliferation von DCs beeinflussen, reguliert NFATc3 deren Zytokinexpression und steuert indirekt auch die nachfolgende T-Zell-Immunantwort. Die Kontrolle der Genregulation in Immunzellen durch die Transkriptionsfaktoren ICER, NFAT und Foxp3 erfüllt somit spezifische Funktionen der Immunität, reguliert aber gleichzeitig wichtige Aspekte der peripheren Toleranz, um schädliche (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern.
Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung.
CD70-abhängige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten
(2014)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen.
Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die
quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss.
Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können.
CD8 wird von thymisch gereiften a/b T Zellen als CD8ab-Heterodimer exprimiert und dient als Korezeptor bei der MHC Klasse I (MHC I) restringierten Antigenerkennung. In dieser Funktion stabilisiert CD8 die Bindung des T Zellrezeptors (TCR) an seinen Liganden (MHC I mit antigenem Peptid) und vermittelt darüber hinaus kostimulatorische Signale an die T Zelle. Die Antigene der g/d T Zellen sind bis auf einige Ausnahmen unbekannt, aber g/d T Zellen von Maus und Mensch weisen im allgemeinen höchstwahrscheinlich keine MHC-restringierte Antigenerkennung auf. Dementsprechend findet man auf den meisten g/d T Zellen dieser Spezies keinen der MHC-spezifischen Korezeptoren CD4 oder CD8. In auffälligem Gegensatz dazu exprimieren in der Milz der Ratte bis zu 80 Prozent der g/d T Zellen das CD8ab-Heterodimer. Um die mögliche Funktion von CD8ab auf g/d T Zellen besser zu verstehen, wurden zunächst die CD8-vermittelten Signale untersucht. Eine Schlüsselrolle bei der Initiierung der TCR-Signalkaskade kommt der mit CD8a assoziierten Proteintyrosinkinase p56lck zu. Diese ist, wie durch Kopräzipitationsexperimente gezeigt wurde, bei a/b und g/d T Zellen gleichermaßen mit CD8 assoziiert und zeigt dieselbe Kinaseaktivität. Weiterhin konnte in vitro ein kostimulatorisches Potential von CD8-spezifischen Antikörpern für a/b und g/d T Zellen gezeigt werden. Demnach besitzt CD8 auf a/b und g/d T Zellen prinzipiell eine vergleichbare Fähigkeit zur Übertragung kostimulatorischer Signale. Es war folglich naheliegend, einen Zusammenhang zwischen der CD8ab-Expression der g/d T Zellen mit einer möglichen MHC I estringierten Antigenerkennung zu prüfen. Da bisher keine Antigene für g/d T Zellen der Ratte bekannt sind, wurden die Antigen bindenden Regionen des g/d TCR analysiert. Bei Antigenrezeptoren von Mensch und Maus bestehen nämlich charakteristische Längenunterschiede zwischen den mit dem Antigen interagierenden CDR3-Proteinschleifen (englisch: complementarity determining regions), die in der Verknüfungsregion der V-, D- und J-Gensegmente codiert sind. Bei Maus und Mensch sind die CDR3-Längen der TCRd-Kette ähnlich variabel und etwa so lang wie bei der schweren Kette des B Zellrezeptors. Dagegen sind die CDR3-Regionen der TCRb-Kette sehr kurz, was wahrscheinlich durch die notwendige Interaktion des MHC-Peptid-Komplexes mit allen drei CDR-Schleifen bedingt wird. Daraus wurde geschlossen, daß die Bestimmung der CDR3d-Längen Aussagen über eine mögliche MHC-Restriktion von g/d T Zellen der Ratte erlauben sollte. Zur Durchführung der CDR3d-Längenanalysen wurde die Methode des Spektratyping etabliert. Hierfür wurden in der Milz häufig vorkommende TCRd V-Gensegmente (DV105 und fünf Mitglieder der ADV7-Familie) partiell kloniert und sequenziert. In CD8 positiven und negativen g/d T Zellen wurden sowohl DV105 als auch Mitglieder der ADV7-Familie jeweils etwa gleich häufig exprimiert. Spektratyp-Analysen ergaben in g/d T Zellen der Ratte für beide V-Genfamilien etwas längere CDR3d-Schleifen als bei der Maus; CD8ab positive, CD8aa positive und CD8 negative g/d T Zellen der Ratte besaßen identische Längenspektren. Demnach kann man die CD8ab-Expression von g/d T Zellen der Ratte nicht als Hinweis auf eine der klassischen MHC-Restriktion ähnliche Antigenerkennung werten. Als spezifische Eigenschaft von g/d T Zellen der Ratte wurde eine Modulation der CD8b-Genexpression nachgewiesen, die mit der Stärke des Aktivierungssignals zunahm. Nach Aktivierung in vitro exprimierte ein großer Teil zuvor CD8ab positiver g/d T Zellen nur noch das CD8aa-Homodimer, das auf MHC I restringierten a/b T Zellen deutlich schlechtere Korezeptoreigenschaften aufweist als das CD8ab-Heterodimer. Die Modulation war irreversibel, fand prätranslational statt und zeigte keine Einflüsse auf Effektorfunktionen der g/d T Zellen wie Interferon-g-Produktion oder zytotoxische Fähigkeiten. Über die physiologische Bedeutung dieser Modulation kann nur spekuliert werden, doch könnte sie ein Mechanismus sein, um den Schwellenwert für Signale einer erneuten T Zellaktivierung zu erhöhen. Darüber hinaus limitiert sie den Nutzen der CD8ab-Expression als Marker für die thymisch gereifte Linie von g/d T Zellen.
Die Entdeckung der Autoimmunkrankheit APECED führte zur Entdeckung des verantwortlichen Gens AIRE (autoimmune regulator), das einen Einblick in die Verhinderung oder Entstehung von Autoreaktivität im Thymus bietet. Durch Aktivierung des AIRE-Gens und Expression des AIRE-Proteins werden organspezifische Selbstantigene in medullären Thymusepithelzellen exprimiert und entweder direkt oder nach Transfer auf dendritsche Zellen unreifen T-Zellen präsentiert. Durch Elimination autoreaktiver Zellen entsteht Toleranz gegenüber den körpereigenen Geweben. Da das Immunsystem bei steigendem Alter tiefgreifende Veränderungen erfährt, die zum Teil durch die Thymusinvolution bedingt sind, ist es von Interesse, den Verlauf von AIRE über verschiedene Altersstufen hinweg zu untersuchen. Zielsetzungen dieser Arbeit waren daher die quantitative und räumliche Untersuchung der AIRE+ -Zellen im Alter und im Kontext einer prototypischen organspezifischen Autoimmunerkrankung, der Myasthenia gravis. Diese Fragestellungen wurden bei Normalthymi, entzündlich veränderten Thymi mit assoziierter Myasthenie und an B1-Thymomen untersucht. Als Ergebnis konnte erarbeitet werden, dass der Gehalt an AIRE+ -Zellen mit dem Alter abnimmt, wobei bis in die neunte Lebensdekade noch AIRE+ -Zellen vorhanden waren. Der Gehalt an AIRE+ Zellen stellte sich als stärker mit dem Lebensalter korreliert dar als beispielsweise die Thymusfläche. AIRE scheint damit ein mit der Thymusinvolution eng assoziiertes Gen zu sein. Es fand sich eine hochsignifikante Co-Lokalisation von AIRE+ Zellen und Hassall-Körperchen, die besonders durch die Untersuchungen von Typ B1 Thymomen mit und ohne Hassall-Körperchen bestätigt werden konnte. In Übereinstimmung mit aktuellen Forschungsergebnissen in Mausmodellen fand sich kein Zusammenhang zwischen der Anzahl oder der räumlichen Anordnung regulatorischer T-Zellen und AIRE+ -Zellen. Myoidzellen nahmen mit zunehmendem Alter ebenfalls ab. Ihre Rolle in der Entstehung der Myasthenie ist bei Patienten mit early und late onset wahrscheinlich unterschiedlich; die abnehmende Zahl an Myoidzellen stellt möglicherweise vor allem bei Patienten mit late onset einen Risikofaktor dar.
Die chronische Rhinosinusitis (CRS) ist eine entzündliche Erkrankung der Nase und Nasennebenhöhlen mit einem Bestehen von Symptomen über zwölf Wochen im Jahr. In Europa sind über 10% der erwachsenen Bevölkerung von ihr betroffen und leiden unter einer stark verminderten Lebensqualität. Nach dem Phänotyp lassen sich zwei Formen unterscheiden: die chronische Rhinosinusitis mit Polypen (CRScNP) und ohne Polypen (CRSsNP). Meist wird unter europäischen Probanden bei der CRScNP eine hauptsächlich eosinophile Th2- vermittelte und bei der CRSsNP ein gemischtes Profil aus Th1/Th17/Th2-vermittelter Entzündung beschrieben. Doch dies erfasst nicht die Vielfalt dieser Erkrankung. Erst kürzlich konnten Endotypen, basierend auf der Zytokinsekretion, identifiziert werden, die auf ein multifaktorielles Geschehen schließen lassen. Nachdem im Nasensekret von über 90% der CRS Patienten Pilze nachgewiesen werden konnten erscheint es wichtig, deren Rolle in der Pathogenese der CRS zu ergründen. Besonders interessant sind dabei Aspergillus fumigatus und Candida albicans. Als opportunistische Pilze könnten sie im Rahmen der CRS in der Lage sein bei einigen Endotypen durch eine verstärkte Aktivierung von Immunzellen die lokale Entzündungsreaktion aufrecht zu erhalten. Es wurden lokale und periphere CD4+ und CD8+ T-Zellen von Patienten mit CRScNP, CRSsNP und einer gesunden Kontrollgruppe isoliert. Eine Kultivierung mit den Antigenen von C. albicans und A. fumigatus erfolgte in einer Konzentration von 1 µg/ml über 6 Tage. Im Anschluss daran wurden die Zellen für das Durchflusszytometer angefärbt und ihre Aktivität über die Ki67+ Expression gemessen. In den Überständen der Kultivierung wurde durch das Durchflusszytometer mittels Multiplexassay die produzierten Zytokinkonzentrationen der Zellen bestimmt. In dieser Arbeit konnte eine Stimulierung der lokalen und peripheren T-Zellen durch die beiden Antigene gezeigt werden...
Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich stören, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verfügt nicht nur über vielfältige Mechanismen der Immunsuppression, während einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivität von Tregs beeinflussen könnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine präferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen können sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivität von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer präferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt während der frühen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt ursächlich für die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn während einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind nötig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die frühe IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erhöhte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergründen müssen.
Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.