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Eine intakte Darmbarriere ist überlebensnotwendig. Bei einigen Erkrankungen kann eine Störung der Darmbarriere zur Translokation von Bakterien aus dem Lumen des Darmes in den menschlichen Körper führen, die septische Entzündungsprozesse auslösen können. In dieser Arbeit untersuchten wir zum einen die Bedeutung der desmosomalen Adhäsion für die Darmbarriere und zum anderen die Rolle der Rho-GTPasen in der Regulation der Darmbarriere. Für unsere Untersuchungen charakterisierten wir Caco2 Zellen, von denen wir nachweisen konnten, dass sie ein geeignetes Modell für die Darmbarriere sind. Wir konnten zeigen, dass Caco2 Zellen 14 Tage nach ihrer Konfluenz einen vollständigen Schlussleistenkomplex ausbilden und funktionell ähnlich Permeabilitäseigenschaften, wie die Mukosa von Ratten ex vivo aufweisen. Um die Bedeutung der desmosomalen Adhäsion zu klären, applizierten wir einen gegen die Extrazellulärdomäne von Dsg2 gerichteten Antikörper. Dieser Antikörper war spezifisch in der Lage Dsg2 vermittelte Adhäsion zu blockieren. Nach Applikation des Dsg2 ED konnten wir eine Fragmentierung der Occludensproteine, sowie eine gestörte Barrierefunktion mit erhöhter Permeabilität und erniedrigtem transepithelialen Widerstand nachweisen. Damit konnten wir zeigen, dass die Dsg2 vermittelte Adhäsion essentiell für die Aufrechterhaltung der Darmbarriere ist. Des Weiteren untersuchten wir die Rolle der Rho-GTPasen. Wir veränderten die Aktivität der Rho-GTPasen durch Applikation von bakteriellen Toxinen, wie CNF-1, CNF-y, Toxin B, C3-TF und LT sowie Mediatoren, wie Y27632 und quantifizierten die Änderung anschließend durch die Aktivitätsmessung der Rho-GTPasen mittels GLISA. In Immunfluoreszenzen konnten wir zeigen, dass sowohl eine Steigerung als auch eine Erniedrigung der Aktivität von RhoA mit einer Fragmentierung der Occludensproteine einhergeht, während die Adherens Junktionen unbeeinflusst bleiben. Diese morphologische Veränderung korreliert mit einer signifikant erhöhten Permeabilität und einem erniedrigtem transepithelialem elektrischen Widerstand. Im Gegensatz dazu, konnten wir zeigen, dass eine Erhöhung der Aktivität von Rac1 und Cdc42 in der Immunfluoreszenz zu keinen sichtbaren Veränderungen führt, die funktionellen Ergebnisse, mit einem erhöhten transepithelialen elektischen Widerstand und einer erniedrigten Permeabilität auf eine Stabilisierung der Barriere hinweisen. Eine Erniedrigung der Aktivität von Rac1 und Cdc42 führt hingegen zu einer Destabilisierung der Barriere. Morphologisch führte die Verringerung der Aktivität von Rac1 durch LT zu einer Reduzierung der Occludensproteine an den Zellgrenzen und zu einer diffuseren Färbung des Adherens Junktionsprotein E- Cadherin. Zum anderen zeigte sich in diesem Fall eine deutliche Reduzierung der Barrierefunktion mit einem erniedrigten transepithelialen elektrischen Widerstand und einer erhöhten Permeabilität. Letzlich konnte diese Arbeit durch ihre Erkenntnisse einen Teil dazu beizutragen, dass die komplexe Regulation der Darmbarriere besser verstanden wird. Dieses bessere Verständnis soll künftig zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Patienten dienen, die unter den septischen Folgen einer Störung der Darmbarriere leiden.
Das Endothel verfügt im wesentlichen über drei dynamische Funktionseinheiten zur Migration und Zellkontaktbildung: Ein intrazelluläres Gerüst, bestehend einerseits aus den sogenannten Stressfasern, welche die Zelle durchziehen und vornehmlich an Zell-Zell-Kontakten und Zell-Matrix-Kontakten anhaften und so der Zelle Stabilität geben, und andererseits aus kontraktilen Aktin-Myosinbündeln, welche die Zelle befähigen, sich fortzubewegen oder ihre Form zu ändern, beispielsweise Ausläufer zu bilden. Zell-Zell-Kontakte, die es den Zellen ermöglichen, fest aneinander zu haften und sich so einerseits gegenseitig zu stützen und andererseits eine regulierbare Barriere zwischen intravasalem Raum und Interstitium zu bilden. Zell-Matrix-Kontakte, welche die Zelle fest mit dem Untergrund verankern und ein Unterspülen der Zelle verhindern. Besonders während der Migration der Endothelzelle unterliegen diese Systeme ständigem Auf- und Abbau. Diese Funktionseinheiten werden durch Rho-Proteine reguliert. Man unterscheidet drei wichtige Vertreter dieser Gruppe: Rac, CDC42 und RhoA. Es wurde die Prenylierung von Proteinen und damit auch die Prenylierung von Rho-Proteinen durch den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Lovastatin unterdrückt. In einer zweiten Versuchsserie wurden alle Rho-Proteine unselektiv durch Toxin-B, einem Toxin aus Clostridium difficile, und anschließend selektiv RhoA durch C3-Toxin aus Clostridium botulinum inaktiviert. Es wurden die Effekte auf Primärkulturen von Endothelzellen aus dem Truncus pulmonalis des Schweins, besonders im Hinblick auf Migration, Stressfasersystem, Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte, mit Hilfe immuncytochemischer Methoden beobachtet. Es konnte gezeigt werden, daß die Rho-Proteine wesentlich für die Bildung von Zellausläufern, wie zum Beispiel Lamellopodien, und die Migration in Endothelzellen sind. Zudem konnte belegt werden, daß Aufbau und Aufrechterhaltung des Aktinfilamentsystems und des kontraktilen Apparates der Endothelzellen im wesentlichen über das geranylierte RhoA reguliert werden. Die Effekte der unselektiven Rho-Protein-Hemmung unterschieden sich hier kaum von denen der selektiven RhoA-Hemmung. Auch die Unterdrückung der Geranyl-Prenylierung zeigte vergleichbare Ergebnisse. Die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Kontakte ist allerdings RhoA-unabhängig, da es trotz selektiver RhoA-Hemmung durch C3-Toxin nicht zur Auflösung der Zell-Zell-Kontakte kam. Diese werden vielmehr über Rac und/oder CDC42 gesteuert, denn erst durch die Blockierung aller Rho-Proteine durch Toxin-B kam es zur Lückenbildung zwischen den Zellen. Auch hier spielt die Geranylierung der Rho-Proteine eine wichtige Rolle, da die Geranylierungshemmung ähnliche Effekte wie die Hemmung durch Toxin-B zeigte. Die Ausbildung und Aufrechterhaltung der Fokalkontakte erfolgt im wesentlichen auch über die geranylierten Rho-Proteine, wobei RhoA hier die entscheidende Rolle zuzukommen scheint. Somit konnte in dieser Arbeit die entscheidende Rolle der Rho-Proteine und im speziellen die des RhoA-Proteins bei der Regulation wesentlicher Funktionseinheiten der Endothelzelle aufgezeigt werden.
In this thesis the Drosophila mutant loechrig (loe), that shows progressive degeneration of the nervous system, is further described. Loe is missing a neuronal isoform of the protein kinase AMPK γ subunit (AMP-activated protein kinase- also known as SNF4Aγ) The heterotrimeric AMPK controls the energy level of the cell, which requires constant monitoring of the ATP/AMP levels. It is activated by low energy levels and metabolic insults like oxygen starvation and regulates multiple important signal pathways that control cell metabolism. Still, its role in neuronal survival is unclear. One of AMPK’s downstream targets is HMGR (hydroxymethylglutaryl-CoA- reductase), a key enzyme in cholesterol and isoprenoid synthesis. It has been shown that manipulating the levels of HMGR affects the severity of the neurodegenerative phenotype in loe. Whereas the regulatory role of AMPK on HMGR is conserved in Drosophila, insects cannot synthesize cholesterol de novo. However, the synthesis of isoprenoids is a pathway that is evolutionarily conserved between vertebrates and insects. Isoprenylation of target proteins like small G-proteins provides a hydrophobic anchor that allows the association of these proteins with membranes and following activation. This thesis shows that the loe mutation interferes with the prenylation of Rho1 and the regulation of the LIM kinase pathway, which plays an important role in actin turnover and axonal outgrowth. The results suggest that the mutation in LOE, causes hyperactivity of the isoprenoid synthesis pathway, which leads to increased farnesylation of RHO1 and therefore higher levels of phospho-cofilin. A mutation in Rho1 improves the neurodegenerative phenotype and life span. The increased inactive cofilin amount in loe leads to an up regulation of filamentous actin. Actin is involved in neuronal outgrowth and experiments analyzing loe neurons gave valuable insights into a possible role of AMPK and accordingly actin on neurite growth and stability. It was demonstrated that neurons derived from loe mutants exhibit reduces axonal transport suggesting that changes in the cytoskeletal network caused by the effect of loe on the Rho1 pathway lead to disruptions in axonal transport and subsequent neuronal death. It also shows that actin is not only involved in neuronal outgrowth, its also important in maintenance of neurons, suggesting that interference with actin dynamics leads to progressive degeneration of neurons. Together, these results further support the importance of AMPK in neuronal function and survival and provide a novel functional mechanisms how alterations in AMPK can cause neuronal degeneration