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Background
The honeybee (Apis mellifera) represents a model organism for social insects displaying behavioral plasticity. This is reflected by an age-dependent task allocation. The most protruding tasks are performed by young nurse bees and older forager bees that take care of the brood inside the hive and collect food from outside the hive, respectively. The molecular mechanism leading to the transition from nurse bees to foragers is currently under intense research. Circular RNAs, however, were not considered in this context so far. As of today, this group of non-coding RNAs was only known to exist in two other insects, Drosophila melanogaster and Bombyx mori. Here we complement the state of circular RNA research with the first characterization in a social insect.
Results
We identified numerous circular RNAs in the brain of A. mellifera nurse bees and forager bees using RNA-Seq with exonuclease enrichment. Presence and circularity were verified for the most abundant representatives. Back-splicing in honeybee occurs further towards the end of transcripts and in transcripts with a high number of exons. The occurrence of circularized exons is correlated with length and CpG-content of their flanking introns. The latter coincides with increased DNA-methylation in the respective loci. For two prominent circular RNAs the abundance in worker bee brains was quantified in TaqMan assays. In line with previous findings of circular RNAs in Drosophila, circAmrsmep2 accumulates with increasing age of the insect. In contrast, the levels of circAmrad appear age-independent and correlate with the bee's task. Its parental gene is related to amnesia-resistant memory.
Conclusions
We provide the first characterization of circRNAs in a social insect. Many of the RNAs identified here show homologies to circular RNAs found in Drosophila and Bombyx, indicating that circular RNAs are a common feature among insects. We find that exon circularization is correlated to DNA-methylation at the flanking introns. The levels of circAmrad suggest a task-dependent abundance that is decoupled from age. Moreover, a GO term analysis shows an enrichment of task-related functions. We conclude that circular RNAs could be relevant for task allocation in honeybee and should be investigated further in this context.
In den letzten Jahrzehnten ist die Akzeptanz stetig größer geworden, dass oxidativer Stress eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von chronischen Erkrankungen, malignen Neoplasien sowie der Beschleunigung des Alterungsprozesses spielt. Als eine der häufigsten chronischen Erkrankungen ist Hypertonie oft mit einem fehlregulierten Renin-Angiotensin-Aldosteron-System assoziiert, welches chronisch oxidativen Stress verursacht. Bluthochdruck ist ein Risikofaktor für neurologische Erkrankungen wie der vaskulären Demenz (VaD) und viele neurologischen Störungen, einschließlich der VaD, haben eine ROS-assoziierte beziehungsweise inflammatorische Komponente in ihrer Entstehung.
Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits eine AT-II-induzierte Genotoxizität in Nieren- und Myokardzellen bzw. -Gewebe nachweisen. Ziel dieser Dissertation war es, einen möglichen Zusammenhang zwischen AT-II und Neurodegeneration zu untersuchen, welche durch eine neuronale Genotoxizität von AT-II ausgelöst wird.
Zunächst zeigten wir in zwei neuronalen Zelllinien, dass AT-II eine Dosis-abhängige Genomschädigung verursacht. Nachfolgende Experimente konnten diese Toxizität auf NOX-produziertes Superoxid zurückführen, das nach Bindung von AT-II an den AT1R generiert wird. Zudem konnte ein AT-II-induzierter Verbrauch des wichtigsten intrazellulären Antioxidans – Glutathion - nachgewiesen werden.
In vivo konnten wir zeigen, dass AT1aR-Knockout-Mäuse nach AT-II-Behandlung signifikant mehr Genomschäden im Subfornikalorgan (SFO) aufwiesen als Wildtypmäuse. Das SFO hat als eine der wenigen Strukturen im Gehirn eine unterbrochene Blut-Hirn-Schranke, was es für zirkulierendes AT-II zugänglich und besonders empfindlich macht. Diese Genomschäden wurden in der neueren Literatur auch in Nieren- und Herzgewebe beschrieben und belegen eine zusätzliche, AT1aR- und damit Blutdruck-unabhängige Genotoxizität von AT-II.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass erhöhte AT-II-Konzentrationen in Nervenzellen Genomschäden durch NOX-produziertes Superoxid verursachen. Die Hoffnung ist, dass diese Ergebnisse dabei helfen, eines Tages die vollständige Entstehung der VaD zu entschlüsseln.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden humane mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (mhMSCs) und aus trabekulären Knochenfragmenten (bhMSCs) isoliert und in einem neurogenen Prädifferenzierungsmedium mit BME gefolgt von einem Differenzierungsmedium mit BHA und DMSO kultiviert. Anschließend wurden die differenzierten hMSCs mit den jeweiligen undifferenzierten, im normalen Wachstumsmedium kultivierten, mhMSCs bzw. bhMSCs verglichen. Im Verlauf der 6-tägigen neurogenen Differenzierung zeigte sich eine deutliche Veränderung der Zellmorphologie. Die meisten differenzierten Zellen erschienen kleiner und bildeten lange, für Nervenzellen typische Zellfortsätze aus, die sich teilweise mehrfach verzweigten. Weiterhin fand sich bei den differenzierten mhMSCs und bhMSCs eine Expressionszunahme bzw. eine de novo Expression der neuronalen Marker NSE und tau auf Gen- bzw. Protein-Ebene. Es konnte jedoch keiner Expressionsänderung von NF-M auf Protein-Ebene und in mehr als der Hälfte der Fälle sogar einer Expressionsabnahme auf RNA-Ebene gefunden werden. Die Differenzierung zeigte keinen reproduzierbaren Effekt auf die Expression des Astrozyten-Markers GFAP. Diese Ergebnisse zeigten sich sowohl bei den mhMSCs als auch bei den bhMSCs und lassen vermuten, dass bhMSCs ein ähnliches Potential besitzen wie mhMSCs und nicht wie ursprünglich vermutet, auf die Differenzierung in Zellen mesenchymalen Ursprungs beschränkt sind. Die Tatsache, dass bereits undifferenzierte hMSCs neurogliale Marker (NF-M, NSE, GFAP) exprimieren konnte in dieser Arbeit für mhMSCs bestätigt und erstmals auch für bhMSC beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es sich bei mhMSCs und bhMSCs um Neuroglia-Vorläuferzellen handelt, die in der Lage sind in neuronale Zellen (Nerven- und Gliazellen) zu differenzieren, und dass die neurogene Differenzierung eher eine quantitative Modulation der Genexpression als ein einfaches An-/Abschalten Neuronen-spezifischer Gene bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zunächst Zellen vom peripheren Nerven isoliert und anschließend charakterisiert. Die aus dem peripheren Nerven herausgewachsenen spindelförmigen bzw. multipolaren Zellen bildeten mit ihren zahlreichen langen Fortsätzen ein regelrechtes Netzwerk und zeigten eine Expression der für Myelinmarker MPZ und PMP 22 sowie des Schwann-Zell-Markers S 100. Abschließend wurden mhMSCs und bhMSCs für 6 Tage in einem Schwann-Zell-Differenzierungsmedium mit Forskolin kultiviert. Die differenzierten spindelförmigen Zellen zeigten eine für Schwann-Zellen typischen fischzugartige Ausrichtung. Es fand sich eine starke Expressionszunahme der von den undifferenzierten Zellen nur schwach exprimierten Myelinmarker MPZ und PMP 22 auf RNA-Ebene sowie eine kräftige Expressionszunahme bzw. de novo Expression des Schwann-Zell-Markers S 100. Diese Ergebnisse zeigen, dass bhMSCs ebenso wie mhMSCS unter geeigneten Bedingungen in der Lage sind, eine für Schwann-Zellen typische Morphologie zu entwickeln und die Expression einzelner Schwann-Zell-Marker zu steigern. In wie weit sie auch funktionell Schwann-Zellen gleichen und damit entscheidend zur peripheren Nervenregeneration beitragen können, bleibt jedoch noch zu klären.