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Die Interaktion von CD4+ T-Zellen mit antigenpräsentierenden dendritischen Zellen (DC) verläuft in statischen und dynamischen Phasen, die jeweils zur Ausbildung einer immunologischen Synapse und T-Zell-Aktivierung führen. Um die Signalgebung in den stabilen wie auch dynamischen Phasen näher zu charakterisieren, wurde der Kalziumeinstrom während der T-Zell-Aktivierung zeitaufgelöst untersucht. Dies wurde in 3D Kollagenmatrices und zusätzlich in 3D Zellclustern durchgeführt, um zu klären, ob sich dynamische produktive Kontakte auch in kollagenfreien, räumlich komplexen Mikromileus ausbilden. Kokulturen aus murinen, naiven CD4+ T-Zellen (DO 11.10) und Ova-Peptid beladenen DC (BALB/c) in 3D Kollagenmatrix sowie die T-Zell/DC Cluster in Flüssigkultur wurden mittels Konfokalmikroskopie gefilmt. Die Zelldynamik wurde digital analysiert. Der Ca2+-Einstrom der T-Zellen wurde mittels zeitaufgelöster Fluo 3-Detektion semiquantitativ analysiert. Sowohl im Kollagengel wie auch in Flüssigkulturen erfolgte wenige Sekunden nach der initialen Kontaktaufnahme über die Vorderfront der T-Zelle ein starker Ca2+-Einstrom in die T-Zelle. Das Signal blieb während der gesamten Interaktion und der Ablöse-Phase, solange der Uropod der T-Zelle mit der DC verbunden war, kontinuierlich erhöht. In den sich spontan bildenden multizellulären Clustern erbrachte die morphodynamische Analyse von Kontakten Ca2+-positiver T-Zellen je 50% dynamische bzw. stabil-statische Kontakte, zu deren Dynamik sowohl die T-Zellen als auch die DC beitrugen. Die Geschwindigkeit der dynamischen Kontakte betrug ca. 4 μm/min (1-6 μm/min) und lag damit ca. 50-90% unterhalb der Geschwindigkeit der freien Migration im Kollagen. Analog zu Interaktionen im 3D Kollagengel wurden für Ca2+-positive T-Zellen produktive serielle und teils simultane Kontakte mit mehreren DC nachgewiesen. Der Nachweis dynamischer produktiver Kontakte in kollagenfreien Zellclustern legt einen promigratorischen Effekt der umgebenden räumlichen Komplexität selbst nahe. Das Spektrum von statischen und dynamischen Interaktionsphasen in Abhängigkeit von der räumlichen Komplexität repräsentiert so eine inhärente Eigenschaft der Zelldynamik von T-Zellen und bildet Teilaspekte des in vivo Verhaltens von T-Zellen in Lymphknoten ab. Zukünftige Studien sind notwendig, um zu klären, wie Interaktionscharakteristika auch zur Differenzierung, Effektorfunktion und/oder Anergie von T-Zellen beitragen.
Die arrhythmogene Kardiomyopathie (ACM) ist eine Herzmuskelerkrankung, die durch den fett- und bindegewebigen Umbau von Herzmuskelgewebe charakterisiert ist. Klinisch treten häufig ventrikuläre Herzrhythmusstörungen auf, teilweise bis hin zum plötzlichen Herztod. ACM ist eine genetisch bedingte Erkrankung, die durch Mutationen in desmosomalen Proteinen, wie Plakophilin-2 (PKP2) und Desmoglein-2 (DSG2), entsteht. Die molekularen Mechanismen sind nur teilweise verstanden und aktuell gibt es keine spezifischen Therapiemöglichkeiten.
Ziel der Arbeit war es, die therapeutische Wirkung eines DSG2-spezifischen Tandem-Peptids (TP) durch desmosomale Stabilisierung an humanen Kardiomyozyten (KM) in einem ACM-Modell zu untersuchen. KM wurden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) einer PKP2-Knockout- (PKP2-KO), DSG2-Knockout- (DSG2-KO) und deren isogener Kontrollzelllinie differenziert. Zunächst wurden verschiedene Methoden der beschleunigten Zellreifung getestet. Dann wurden die PKP2- und DSG2-KO-KM anhand von intrazellulären Kalzium-Messungen und Arrhythmie-Analysen phänotypisch charakterisiert. Letztlich wurde die Wirkung des TPs, das an die DSG2 der geschwächten Zellbindungen von PKP2-KO-KM binden sollte, im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass mit der Matrigel-Mattress-Kultivierung und einer Hormonbehandlung elektrisch stimulierbare hiPS-KM mit reifen Eigenschaften hergestellt werden konnten. Der Phänotyp der mutationstragenden PKP2-KO-KM und DSG2-KO-KM zeichnete sich durch erhöhte diastolische Kalzium-Konzentrationen und erniedrigte Kalzium-Amplituden sowie durch beschleunigte Kalzium-Kinetik im Sinne der Relaxationszeiten aus. Weiterhin war bei den PKP2-KO-KM die Häufigkeit der Arrhythmien erhöht, die unter beta-adrenerger Stimulation nachließen. Insgesamt konnte keine eindeutige Wirkung des TPs im ACM-Modell gezeigt werden. Das TP hatte nur auf die diastolischen Kalzium-Konzentrationen der PKP2-KO-KM einen therapeutischen Einfluss, allerdings auch auf DSG2-KO-KM, weshalb der Hinweis auf eine fehlende DSG2-Spezifität des TPs entstand.
Schlussfolgernd wurde bestätigt, dass sich reife hiPS-KM mit genetischen Veränderungen als Modell zur Untersuchung der Kalziumhomöostase und von Arrhythmien bei der ACM eignen. Sie können grundsätzlich zum Test von therapeutischen Anwendungen genutzt werden. Die Wirksamkeit und Spezifität des getesteten TPs sollte zukünftig weiter überprüft werden.
Parathormon (PTH) aktiviert am PTH-1 Rezeptor (P1R) mindestens zwei Signalwege: Über Guanosintriphosphat-bindende Proteine (Gs) kommt es intrazellulär zu einem Anstieg von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und zu einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). Gq Protein-vermittelt erfolgt eine Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und ein intrazellulärer Anstieg des Inositoltriphosphat (IP3). Der verwandte PTH-2 Rezeptor (P2R) wird einerseits durch seinen vermutlich physiologischen Liganden, das tuberoinfundibuläre Peptid (TIP39), und andererseits durch PTH aktiviert. Im Gegensatz zum P1R zeigt der P2R nur eine Ankopplung an den cAMP Signalweg und keine an den PLC Signalweg. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass intrazelluläre Abschnitte der zweiten und dritten Schleife sowie Bereiche des C-Terminus des P1R für die Aktivierung des PLC Signalweges verantwortlich sind. In der vorliegenden Dissertation erfolgte eine stufenweise Angleichung intrazellulärer Abschnitte des P2R an den P1R. Die generierten Hybridrezeptoren wurden hinsichtlich ihres Signaltransduktionsverhaltens untersucht. Mit der Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositole und des intrazellulären Calciums [Ca]i konnte gezeigt werden, dass trotz einer 95%-igen Übereinstimmung der intrazellulären Aminosäuresequenzen der P2R-Hybridrezeptoren mit denen des P1R, die Ankopplung an den PLC Signalweg nicht übertragen werden kann. Diese Ergebnisse wurden für Stimulationen mit PTH und TIP39 nachgewiesen. Durch Hemmung der Proteinkinasen A und C konnte, wie erwartet, am P1R ein verstärktes IP3 Signal beobachtet werden. Eine Aktivierbarkeit des PLC Signalweges wurde auch hierbei für die Hybridrezeptoren nicht gesehen. Für die Aktivierung des cAMP Signalweges der Hybridrezeptoren konnte beobachtet werden, dass diese sich weitestgehend in Anlehnung zum P2R verhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass für eine effiziente Ankopplung an den cAMP Signalweg alle aus dem P1R in den P2R einfügten Teilabschnitte (zweite, dritte Schleife und C-Terminus) zusammenwirken. Der Hybridrezeptor, an dem alle drei Teilabschnitte ausgetauscht wurden, führte zu einer signifikant besseren Ankopplung an den cAMP Signalweg, als die Einzelmutation des C-Terminus. Die Messung zum cAMP Signalweg wurden mit den Liganden TIP39 und PTH durchgeführt. Für die Aktivierung des Gs Protein-vermittelten cAMP Signalweg am P1R oder P2R sind daher vermutlich Interaktionen verschiedener Rezeptorabschnitte verantwortlich. Insgesamt konnten in dieser Arbeit weitere wichtige Erkenntnisse bezüglich unterschiedlicher Aspekte der Signaltransduktion des P1R und des P2R gewonnen werden.
In dieser Arbeit sollte zunächst die Frage geklärt werden, ob es sich bei SLAC1 um den S-typ Anionenkanal handelt, oder ob SLAC1 nur ein essentieller Bestandteil des Anionenkanals ist. Zur funktionellen Charakterisierung des per se inaktiven SLAC1 Proteins, wurde mit der Suche nach SLAC1-aktivierenden Interaktionspartnern begonnen. Zu diesem Zweck bediente man sich der Methode der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BiFC) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Da bereits die Abhängigkeit der Anionenströme in Schließzellen von De- und Phosphorylierungsereignissen bekannt war, galt Ca2+-abhängigen Kinasen der CPK Familie, ABA-aktivierten Kinasen der SnRK Familie und Phosphatasen des PP2C Typs eine besondere Aufmerksamkeit. Mitglieder dieser Familien wurden bereits mit der Regulation des Stomaschlusses in Verbindung gebracht. Bei diesen Experimenten zeigte sich, dass SnRK2.6 (OST1) und mehrere CPKs deutlich mit SLAC1 physikalisch interagierten. Als Folge dieser Interaktion in Oozyten konnten schließlich nach Koexpression von SLAC1 zusammen mit den interagierenden Kinasen typische S-Typ Anionenströme detektiert werden, wie man sie aus Patch-Clamp Experimenten an isolierten Schließzellprotoplasten kannte. Hierbei bewirkten die Kinasen OST1 und CPK23 die größte Anionenkanalaktivierung. Dieses Ergebnis wird durch die BIFC-Experimente gestützt, da OST1 und CPK23 die stärkste Interaktion zu SLAC1 zeigten. Die elektrophysiologische Charakterisierung der SLAC1-Ströme im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten in Kombination mit in vivo Patch-Clamp Untersuchungen wies SLAC1 eindeutig als den lange gesuchten S-Typ Anionenkanal in Arabidopsis Schließzellen aus. Somit ist die direkte S-Typ Anionenkanalaktivierung durch OST1 auf dem Kalzium- unabhängigen und durch CPKs auf dem Ca2+-abhängigen ABA-Signaltransduktionsweg gelungen. Bei der Spezifizierung der einzelnen Kalzium-Abhängigkeiten dieser Kinasen in Oozyten und in in vitro Kinase Assays konnten weiterhin unterschiedliche Affinitäten der CPKs zu Kalzium festgestellt werden. So vermittelten die schwach Kalzium-abhängigen CPK6 und CPK23 bereits ohne einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentratiom über das Ruheniveau hinaus schon die Anionenkanalaktivierung. Die stark Kalzium-abhängigen CPK3 und CPK21 hingegen, werden erst aktiv wenn die ABA vermittelte Signaltransduktion zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration führt. Da somit die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 ohne dieses Kalziumsignal aktiv sind, benötigen diese einen übergeordneten Regulationsmechanismus. In den BIFC-Experimenten konnte eine deutliche Interaktion der Phosphatasen ABI1 und 2 zu den SLAC1 aktivierenden Kinasen beobachtet werden. Dass diese Interaktion zu einem Ausbleiben der Anionenkanalaktivierung führt, wurde in TEVC-Messungen gezeigt. Mit diesen Erkenntnissen um die ABA-Signaltransduktionskette in Schließzellen konnten in in vitro Kinase Experimenten ihre einzelnen Glieder zusammengesetzt und der ABA-vermittelte Stomaschluss nachvollzogen werden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass, das unter Wasserstress-Bedingungen synthetisierte Phytohormon, ABA von Rezeptoren der RCAR/PYR/PYL-Familie percepiert wird. Anschließend bindet die Phosphatase ABI1 an den ABA-RCAR1 Komplex. In ihrer freien Form inhibiert die Phosphatase ABI1 die Kinasen OST1, CPK3, 6, 21 und CPK23 durch Dephosphorylierung. Nach Bindung von ABI1 an RCAR1 sind diese Kinasen von dem inhibierenden ABI1 entlassen. Die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 stellen ihre Aktivität durch Autophosphorylierung wieder her. Die stark Ca2+-abhängigen Kinasen CPK3 und 21 benötigt hierzu noch einen ABA induzierten Ca2+-Anstieg im Zytoplasma. Diese Kinasen phosphorylieren anschließend SLAC1 am N-Terminus. Diese Phosphorylierung bewirkt die Aktivierung von SLAC1 woraufhin Anionen aus der Schließzelle entlassen werden. Das Fehlen dieser negativen Ladungen führt zur Depolarisation der Membran woraufhin der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK aktiviert und K+ aus der Schließzelle entlässt. Der Verlust an Osmolyten bewirkt einen osmotisch getriebenen Wasserausstrom und das Stoma schließt sich.
The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism.
Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration.
However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force.
In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone.
In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family.
Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization
Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type.
The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Thema "Die Rolle des Signalmoleküls Ca2+ in der Signaltransduktion der SC-1-induzierten Apoptose" anhand von immunhisto-chemischen, proteinbiochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Methoden erarbeitet. Die SC-1-induzierte Apoptose stellt einen neuen intrinsischen, „death domain“-unabhängigen Signalweg in der Vermittlung des programmierten Zelltodes dar, der über die Bindung dieses Antikörpers an CD55SC-1 ausgelöst wird. Dem Signalmolekül Ca2+ galt besonderes Interesse bei der Charakterisierung der durch SC-1 ausgelösten Signaltransduktion. Nach Aktivierung von CD55SC-1 durch SC-1 steigt das intrazelluläre Ca2+ um Faktor 2,7 an, stabilisiert sich danach auf dem 1,5fachen Ausgangsniveau. Dies hat keinerlei Einfluss auf die Ausführung des Apoptoseprogramms, ist aber maßgeblich in das Expressionsverhalten involviert. Der Ca2+ - Einstrom ist somit nicht direkt in die Ausführung der Apoptose beteiligt, durch die Hochregulation der Expression des Apoptoserezeptors verstärkt es jedoch die Wahrscheinlichkeit der Tumorzelle, den programmierten Zelltod zu vollziehen, da durch die verstärkte Expression dieses Apoptose-induzierenden Rezeptors auch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere SC-1-Antikörper binden können. Da die Quervernetzung mehrerer Rezeptoren mittels des SC-1-Antikörpers in der Apoptoseinduktion von Nöten ist, stellt diese durch Ca2+ getriggerte Überexpression von CD55SC-1 einen essentiellen Bestandteil in der Exekution dieses Selbstmordprogrammes dar. Dieses Ergebnis gibt einen interessanten Einblick in den Signalweg der durch SC-1 induzierten Apoptose. Weiterführende Experimente sind notwendig, um genauere Erkenntnisse dieser einzigartigen Form einer gewebespezifischen Apoptose zu erlangen.
Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.
Diethylstilbestrol alters the morphology and calcium levels of growth cones of PC12 cells in vitro
(1993)
Diethylstilbestrol (DES) is a synthetic estrogen with carcinogenic properties. DES is known to alter cytoskeletal components, including the organization of actin stress fibres in C6 rat glioma cells. ln a test of the hypothesis that DES disrupts actin Filaments of growth cones in neuron-like cells, DES-induced changes in filopodial lengths were quantified in rat pheochromocytoma (PC12) cells in vitro. DES significantly altered growth cone morphology, with collapse of growth cone filopodia and neurite retraction invariably occurring at a concentration of 10 MikroM. At 5 MikroM DES, transient reductions in total filopodiallengths occurred. At DES concentrations of 0.1 nM and 1 nM, reductions in total filopodiallengths occurred in a fraction of growth cones. Evidence exists which shows that growth cone activity and morphology are intimately linked to Ieveis of intracellular, free calcium and that DES increases such levels. Measurements of free intracellular calcium levels by fluorescence microscopy, at times concurrent with the DES-induced reduction in total filopodial lengths, showed that calcium levels were indeed significantly increased by 10 MirkoM DES. Labelling of filamentaus actin (f-actin) with FITC-phalloidin showed that the f-actin distribution in growth cones exposed to DES could not be differentiated from the distribution found in spontaneously retracting growth cones. Tagether with evidence which showed that growth cone motility was not affected, the results are taken to indicate that DES, rather than acting directly on the cytoskeleton, exerts its effects indirectly, by a calcium-induced destabilization of actin filaments in the growth cone.
Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology.
Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.