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Liquid chromatography has become the gold standard for modern quality control and purity analytics since its establishment in the 1930s. However, some analytical questions remain very challenging even today. Several molecules and impurities do not possess a suitable chromophore for the application of UV detection or cannot be retained well on regular RP columns. Possible solutions are found in derivatization procedures, but they are time consuming and can be prone to errors. In order to detect non chromophore molecules underivatized, the concept of aerosol based universal detection was established with the introduction of the evaporative light scattering detector (ELSD) in the 1970s and the charged aerosol detector (CAD) followed in 2002. These two challenging fields – polar and non chromophore molecules – are tackled in this thesis.
An overview of applications of the CAD in the literature and a comparison to its aerosol based competitors and MS is presented, emphasizing on its high sensitivity and robustness. Parameters and techniques to overcome the drawbacks of CAD, such as the use of gradient compensation or adjusted evaporation temperatures are discussed. A consideration of aspects and drawbacks of data transformation such as the integrated power function value (PFV) in the GMP environment is performed.
A method for the fatty acid analysis in polysorbate 80 that was developed on HPLC CAD was transferred to UHPLC CAD. Time and eluent savings of over 75% and 40%, respectively, as well as ways to determine the optimal CAD parameters resulted from this investigation. The evaporation temperature was determined as the most crucial setting, which has to be adjusted with care. Optimal signal to noise ratios are found at a compromise between maintaining analyte signal and reducing background noise. The incorporation of semi volatile short chain fatty acids enabled the observation of differences based on volatility of the analyte. E.g. for semi volatiles, an improved linearity by means of adjusting the PFV is achieved at values below 1.0 instead of at elevated PFVs.
Using sugars and sugar related antibiotics, a proof-of-concept was given that artificial neural networks can describe correlations between the structure and physicochemical properties of molecules and their response in CAD. Quantitative structure property relationships obtained by design of experiment approaches were able to predict the response of unseen substances and yielded insights on the response generation of the detector, which heavily relies on the formed surface area of the dried particle. Further work can substantiate upon these findings, eventually building a library of diverse eluent compositions, analytes and settings.
In order to cope with a chromatographically challenging substances, the application of ion pairing reversed phase chromatography coupled to low wavelength UV detection has been shown as a possible approach for the amino acid L asparagine. A method capable of compendial purity analysis in one single HPLC approach, thus making the utilization of the semi quantitative TLC-ninhydrin analysis obsolete, resulted from this. One cyclic dipeptide impurity (diketoasparagine) that was formerly not assessed, could be identified in several batches and added to the monograph of the Ph.Eur.
Studying ibandronate sodium with CAD and ELSD, it was found that randomly occurring spike peaks represent a major flaw of the ELSD when high sample load is present. The research with this non chromophore bisphosphonate drug furthermore shed light on possible drawbacks of mixed mode chromatography methods and ways to overcome these issues. Due to strong adsorption of the analyte onto the column, over ten injections of the highly concentrated test solution were found to be necessary to ensure reproducible peak areas. Preconditioning steps should thus be evaluated for mixed mode approaches during method development and validation.
Last, using a ternary mixed mode stationary phase coupled to CAD, a method for the impurity profiling of pamidronate disodium, also applicable to the assessment of phosphate and phosphite in four other bisphosphonate drugs, has been developed. This represents a major advantage over the Ph.Eur. impurity profiling of pamidronate, which requires two different methods, one of which is only a semi quantitative TLC approach.
Die Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifität und sind somit für die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizitäten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen können u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Veränderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik für eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallensäure-Profiling mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizität in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallensäuren ein diagnostisches Potential für die Bewertung einer Leberschädigung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallensäure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizität leisten können.
Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es ermöglicht, 20 verschiedene endogene Gallensäuren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik ermöglichte eine selektive Bestimmung von primären, konjugierten und sekundären Gallensäuren. Für die Quantifizierung der individuellen Gallensäuren wurden 2 MRM-Übergänge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallensäuren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde für die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingefügt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingefügte Qualitätskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen überwacht.
Es wurde ein Gallensäure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgeführt. Histopathologische
Zusammenfassung
Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von männlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin über 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikuläre Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erhöhten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallensäuren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erhöhte Konzentrationen der primären Gallensäuren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten.
Andere Gallensäure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobiliärer Schädigung beobachtet werden. Nach einer 14-tägigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erhöhten sich die Konzentrationen von 11 Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallensäuren im Plasma behandelter Ratten an.
Zusätzlich zur quantitativen Analyse von Gallensäuren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallensäure-Biosynthese, des Gallensäure-Transports und die Regulation der Gallensäure-Homöostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erhöhte Expression von Genen für Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallensäuren ins Blut hin und korrespondierte mit erhöhten Gallensäure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten.
Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallensäure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu übertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit primären Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgeführt. Dieses etablierte System wird u. a. für Untersuchungen an hepatobiliären Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallensäure-Profiling in den Zellkulturüberständen belegt, dass die primären Hepatozyten konjugierte Gallensäuren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit primären Gallensäuren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallensäuren, weitere konjugierte Gallensäuren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen führte zu Veränderungen in der Gallensäure-Homöostase der Hepatozyten.
In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobiliärer Schädigung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallensäuren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der
Zusammenfassung
pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign für Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Abschätzung der Konzentrationsveränderungen von Gallensäuren im In-vitro-Testsystem durchzuführen. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erhöhten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem möglicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizität zu unterstützen oder sogar zu reduzieren.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallensäure-Profiling in männlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Leberschäden ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterstützen. Damit besitzt das Gallensäure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizität im Rahmen der Evaluierung von präklinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern.