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Institut
- Institut für Klinische Neurobiologie (4) (entfernen)
EU-Projektnummer / Contract (GA) number
- 259867 (1)
In dorsal root ganglia (DRG) neurons TRESK channels constitute a major current component of the standing outward current IK\(_{SO}\). A prominent physiological role of TRESK has been attributed to pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociception. We demonstrate co-expression of TRESK and LPA receptors in DRG neurons. Heterologous expression of TRESK and LPA receptors in Xenopus oocytes revealed augmentation of basal K\(^{+}\) currents upon LPA application. In DRG neurons nociception can result from TRPV\(_{1}\) activation by capsaicin or LPA. Upon co-expression in Xenopus oocytes LPA simultaneously increased both depolarising TRPV\(_{1}\) and hyperpolarising TRESK currents. Patch-clamp recordings in cultured DRG neurons from TRESK[wt] mice displayed increased IK\(_{SO}\) after application of LPA whereas under these conditions IK\(_{SO}\) in neurons from TRESK[ko] mice remained unaltered. Under current-clamp conditions LPA application differentially modulated excitability in these genotypes upon depolarising pulses. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and, in contrast, augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. Hence excitation of sensory neurons is strongly controlled by the activity of TRESK channels, which therefore are good candidates for the treatment of pain disorders.
Most RNAs within polarized cells such as neurons are sorted subcellularly in a coordinated manner. Despite advances in the development of methods for profiling polyadenylated RNAs from small amounts of input RNA, techniques for profiling coding and non-coding RNAs simultaneously are not well established. Here, we optimized a transcriptome profiling method based on double-random priming and applied it to serially diluted total RNA down to 10 pg. Read counts of expressed genes were robustly correlated between replicates, indicating that the method is both reproducible and scalable. Our transcriptome profiling method detected both coding and long non-coding RNAs sized >300 bases. Compared to total RNAseq using a conventional approach our protocol detected 70% more genes due to reduced capture of ribosomal RNAs. We used our method to analyze the RNA composition of compartmentalized motoneurons. The somatodendritic compartment was enriched for transcripts with post-synaptic functions as well as for certain nuclear non-coding RNAs such as 7SK. In axons, transcripts related to translation were enriched including the cytoplasmic non-coding RNA 7SL. Our profiling method can be applied to a wide range of investigations including perturbations of subcellular transcriptomes in neurodegenerative diseases and investigations of microdissected tissue samples such as anatomically defined fiber tracts.
1. Zusammenfassung
Während der Embryogenese und nach Verletzungen von Nerven regulieren neurotrophe Faktoren Signalwege für Apoptose, Differenzierung, Wachstum und Regeneration von Neuronen. In vivo Experimente an neugeborenen Nagern haben gezeigt, dass der Verlust von Motoneuronen nach peripherer Nervenläsion durch die Behandlung mit GDNF, BDNF, und CNTF reduziert werden kann In der pmn-Mausmutante, einem Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose, führt die Gabe von CNTF, nicht aber von GDNF zu einem verzögerten Krankheitsbeginn und einem verlangsamten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Auslöser der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus ist eine Mutation im Tubulin spezifischen Chaperon E (Tbce) Gen, das für eines von fünf Tubulin spezifischen Chaperonen (TBCA-TBCE) kodiert und an der Bildung von -Tubulinheterodimeren beteiligt ist. Diese Arbeit sollte dazu beitragen, die CNTF-induzierten Signalwege zu entschlüsseln, die sich lindernd auf den progredienten Verlauf der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus auswirken.
Primäre pmn mutierte Motoneurone zeigen ein reduziertes Axonwachstum und eine erhöhte Anzahl axonaler Schwellungen mit einer anomalen Häufung von Mitochondrien - ein frühes Erkennungsmerkmal bei ALS-Patienten. Die Applikation von CNTF nicht aber von BDNF oder GDNF, kann in vitro die beobachteten Wachstumsdefekte und das bidirektionale axonale Transportdefizit in pmn mutierten Motoneurone verhindern.
Aus älteren Untersuchungen war bekannt, dass CNTF über den dreiteiligen transmembranen Rezeptorkomplex, bestehend aus CNTFR, LIFR und gp130, Januskinasen aktiviert, die STAT3 an Tyrosin 705 phosphorylieren (pSTAT3Y705). Ich konnte beobachten, dass axonales fluoreszenzmarkiertes pSTAT3Y705 nach CNTF-Gabe nicht retrograd in den Nukleus transportiert wird. Stattdessen führt die CNTF-induzierte Phosphorylierung von STAT3 an Tyrosin 705 zu einer transkriptionsunabhängigen lokalen Reaktion im Axon. Diese pSTAT3Y705 abhängige Reaktion ist notwendig und ausreichend, um das reduzierte Axonwachstum pmn mutierter Motoneurone zu beheben. Wie die Kombination einer CNTF Behandlung mit dem shRNA vermittelten knock-down von Stathmin in pmn mutierten Motoneuronen zeigt, zielt die CNTF-STAT3 Signalkaskade auf die Stabilisierung axonaler Mikrotubuli ab und wirkt sich positiv auf die anterograde und retrograde Mobilität von axonalen Mitochondrien aus.
Interessanter Weise konnte ich außerdem feststellen, dass eine akute Gabe von CNTF das mitochondriale Membranpotential in Axonen primärer pmn mutierter und wildtypischer
Motoneurone erhöht und einen Anstieg von ATP auslöst. Meine Beobachtungen legen nahe, dass CNTF unerwarteter Weise auch eine transiente Phosphorylierung an STAT3 Serin 727 (pSTAT3S727) auslöst, die zur anschließenden Translokation von pSTAT3S727 in Mitochondrien führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass STAT3 mehrere lokale Ziele im Axon besitzt, nämlich axonale Mikrotubuli und Mitochondrien.
Ligand-binding of Cys-loop receptors is determined by N-terminal extracellular loop structures from the plus as well as from the minus side of two adjacent subunits in the pentameric receptor complex. An aromatic residue in loop B of the glycine receptor (GIyR) undergoes direct interaction with the incoming ligand via a cation-π interaction. Recently, we showed that mutated residues in loop B identified from human patients suffering from hyperekplexia disturb ligand-binding. Here, we exchanged the affected human residues by amino acids found in related members of the Cys-loop receptor family to determine the effects of side chain volume for ion channel properties. GIyR variants were characterized in vitro following transfection into cell lines in order to analyze protein expression, trafficking, degradation and ion channel function. GIyR α1 G160 mutations significantly decrease glycine potency arguing for a positional effect on neighboring aromatic residues and consequently glycine-binding within the ligand-binding pocket. Disturbed glycinergic inhibition due to T162 α1 mutations is an additive effect of affected biogenesis and structural changes within the ligand-binding site. Protein trafficking from the ER toward the ER-Golgi intermediate compartment, the secretory Golgi pathways and finally the cell surface is largely diminished, but still sufficient to deliver ion channels that are functional at least at high glycine concentrations. The majority of T162 mutant protein accumulates in the ER and is delivered to ER-associated proteasomal degradation. Hence, G160 is an important determinant during glycine binding. In contrast, 1162 affects primarily receptor biogenesis whereas exchanges in functionality are secondary effects thereof.