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The effect of late parenthood on the offspring´s physical and mental health status has recently become an increasingly important topic of discussion. Studies on neurodevelopmental disorders in children of older parents (Naserbakht et al., 2011) outline the negative consequences of aging fathers as unpredictable compared to the better-understood unfavorable maternal influences (Cedars et al. 2015). This may be due to the fact that lifelong production of male gametes becomes more susceptible to error, not only for somatic mutations. Non-genomic mechanisms such as epigenetic methylation also alter DNA dynamically throughout life (Jones et al., 2015) and influence the aging human sperm DNA (Jenkins et al., 2014). These methylation changes may be transmitted to the next generation via epigenetic inheritance mechanisms (Milekic et al., 2015), which may negatively impact the sensitive epigenetic regulation of cell differentiation in the embryonic period (Curley et al., 2011; Spiers et al., 2015). Accordingly, Nardone et al. (2014) reported several hypomethylated regions in autistic patients, illustrating potential epigenetic influences on the multifactorial pathogenesis of neuropsychiatric disorders. In the present study, the methylation status of five gene regions in the sperm DNA of males of different ages was analyzed by two techniques - pyrosequencing and deep bisulfite sequencing. Two gene regions, FOXK1 and DMPK, showed a highly significant age-related methylation loss and FOXK1 a reduced methylation variation at the level of single alleles. In addition, the examined gene region of FOXK1 showed significant methylation changes in the fetal cord blood DNA of the respective offspring of the sperm donor. This fact suggests a transfer of age-related methylation loss to the next generation. Interestingly, a methylation analysis at the level of single alleles showed that the methylation loss was inherited exclusively by the father. FOXK1 is a transcription factor that plays an important role in the epigenetic regulation of the cell cycle during embryonic neuronal development (Huang et al., 2004; Wijchers et al., 2006). For this reason, the methylation status of FOXK1 in the blood of autistic patients and an age- and sex-matched control group was investigated. While both groups showed age-associated FOXK1 methylation loss, a faster dynamics of methylation change was observed in the autistic group. Although further studies are needed to uncover inheritance mechanisms of epigenetic information, the present results show an evident influence of age-related methylation changes on offspring. When advising future fathers, it is important to consider how the paternal epigenome is altered by aging and can have a negative impact on the developing embryo.
Derzeit gilt das Vulnerabilitäts-Stressmodell im Sinne eines multifaktoriellen Erklärungsmodells als am besten geeignet, um die Ätiopathogenese der Angsterkrankungen abzubilden. Als Brücke zwischen den genetischen Faktoren und den auf ein Individuum einwirkenden Umweltfaktoren werden epigenetische Mechanismen verstanden. Hierzu zählt die Methylierung bestimmter DNA-Bereiche, welche durch die DNA-Methyltransferasen vermittelt wird. Diese Enzyme waren in Verbindung mit Angsterkrankungen bisher kaum im Fokus psychiatrischer Forschung.
Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit ausgewählten Einzelnukleotidpolymorphismen des DNMT3A- und DNMT3B-Gens und untersucht, ob diese SNPs und/oder deren Haplotypen zum einen mit der Panikstörung und zum andern mit dimensionalen psychologischen Charakteristiken, wie angstbezogener Kognition oder Angstsensitivität, assoziiert sind.
Zusammenfassend konnte eine signifikante bzw. nominal signifikante Assoziation der zweier SNPs mit angstbezogenen Charakteristiken wie der angstbezogenen Kognition und der Angstsensitivität gezeigt werden.
Um die gefundenen Assoziationen besser beurteilen zu können, ist in Folgeuntersuchungen eine Replikation in einer weiteren Probandengruppe und in einer angemessen großen Patienten- und Fall-Kontroll-Gruppe mit ausreichender Teststärke erforderlich. Aufgrund der nachgewiesenen Assoziation mit dem PSWQ bietet sich auch die Untersuchung eines anderen Angstphänotypen, der Generalisierten Angststörung, an. Als weiterer Schritt sind Untersuchungen zur Klärung der Funktionalität der signifikant assoziierten SNPs anzustreben. In der Literatur wird zudem eine weitere DNMT, die Dnmt1, mit der Furchtkonditionierung assoziiert und auch die Methylierungsmuster der DNMTs selbst scheinen einen Einfluss auf die Entwicklung von Angststörungen zu haben. Eine Untersuchung des DNMT1-Gens und der Methylierungsmuster der DNMT-Gene sind daher weitere sinnvolle Schritte, um einen möglichen Einfluss von DNMTs auf die Entstehung von Angsterkrankungen und auf angstbezogene psychologische Charakteristiken besser zu verstehen.
Die WHO-Klassifikation der Hirntumoren von 2016 ebnete den Weg für molekulare Marker und Therapie-Angriffspunkte. Der Transkriptionsfaktor ATF5 könnte ein solcher sein. Er unterdrückt die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen und wird in Glioblastomen (GBM) überexprimiert. Daten zur ATF5-Expression in WHO Grad II Gliomen (LGG) und GBM-Rezidiven sind nur spärlich vorhanden. Daher untersuchten wir 79 GBM, 40 LGG und 10 Normalhirnproben auf ihre ATF5-mRNA- und Proteinexpression mit quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Immunhistochemie und verglichen sie mit multiplen, retrospektiv erhobenen klinischen Charakteristika der Patienten. ATF5 war in LGG und GBM verglichen zum Normalhirn sowohl auf mRNA-, als auch Proteinebene überexprimiert. Obwohl die ATF5-mRNA-Expression im GBM eine erhebliche Fluktuationsrate zeigte, gab es keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen GBM-Gruppen unterschiedlicher biologischer Wachstumsmuster. ATF5-mRNA korrelierte mit dem Alter der Patienten und invers mit der Ki67-Färbung. Kaplan Meier- und Cox-Regressionsanalysen zeigten eine signifikante Korrelation der ATF5-mRNA-Expression mit dem Überleben nach 12 Monaten sowie dem progressionsfreien Überleben. Die Methylierung des Promotors der O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist ein etablierter Marker in der Therapie des GBMs. Sie ist mit dem therapeutischen Ansprechen auf Temozolomid und dem Überleben assoziiert. Uns fielen inzidentell Veränderungen der MGMT-Promotormethylierung auf, woraufhin wir den aktuellen Wissensstand mittels einer ausführlichen Literatur-Metaanalyse zusammenfassten. Dabei fanden wir Veränderungen der MGMT-Promotormethylierung bei 115 der 476 Patienten. Wir schlussfolgern, dass die ATF5-mRNA-Expression als prognostischer Faktor für das Überleben der Patienten dienen könnte. Da seine in vitro-Inhibition zu einem selektiven Zelltod von Gliomzellen führte und wir eine Überexpression in glialen Tumoren nachweisen konnten, zeigt ATF5 Potential als ubiquitäres Therapieziel in Gliomen. Zum aktuellen Zeitpunkt ergibt sich keine klare Indikation, den klinischen Standard der MGMT-Teststrategie zu verändern. Trotzdem könnte eine erneute Testung der MGMT-Promotormethylierung für zukünftige Therapieentscheidungen sinnvoll sein und wir regen an, dass dieses Thema in klinischen Studien weiter untersucht wird.
Die Regulation krankheitsrelevanter Gene und deren Proteine über Veränderungen in der DNA-Methylierung stellen einen wichtigen und zugleich noch unzureichend erforschten Bereich bei Erkrankungen mit inflammatorischer Komponente dar. In dieser Arbeit wurde die Methylierung pro- und antiinflammatorischer Gene im hypoxischen Setting hervorgerufen durch Präeklampsie, Angsterkrankung und Inflammation bei Sklerodermie untersucht. Zur Bestimmung der prozentualen Methylierung wurde Pyrosequenzierung durchgeführt. Bei einem Teil der Proben erfolgte zusätzlich die Bestimmung der Genexpression mittels Real Time PCR.
Bei Angsterkrankung zeigte sich eine signifikante Hypermethylierung am Promotor des Treg spezifischen Transkriptionsfaktors FOXP3. Daraus könnte eine beeinträchtigte Funktion der Tregs und somit eine erhöhte Komorbidität resultieren. In der Gruppe der an Sklerodermie erkrankten Personen zeigte sich entgegen den Erwartungen eine signifikant höhere RORC1 und RORC2 Methylierung. Eine Genexpressionsanalyse erbrachte eine signifikant niedrigere Expression von RORC bei Sklerodermie im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Diese überraschenden Ergebnisse könnten der Methodik geschuldet sein. Auf eine Auftrennung der verschiedenen T-Zellen vor Messung der Methylierung wurde verzichtet. Plazentagewebe bei Präeklampsie zeigte eine signifikant geringere Methylierung am FOXP3 Promotor als Plazentagewebe von gesunden Schwangeren.
Die Veränderbarkeit der DNA-Methylierung durch äußere Einflüsse und Medikamente stellt hierbei einen vielversprechenden Ansatzpunkt für zukünftige Therapien dar und sollte in weiteren Studien konkretisiert werden.
The focus of this work was the development and application of highly efficient RNA catalysts for the site-specific modification of RNA with special focus on methylation. In the course of this thesis, the first methyltransferase ribozyme (MTR1), which uses m6G as the methyl group donor was developed and further characterized. The RNA product was identified as the natural modification m1A. X-Ray crystallography was used to solve the 3D structure of the ribozyme, which directly suggested a plausible reaction meachnism. The MTR1 ribozyme was also successfully repurposed for a nucleobase transformation reaction of a purine nucleoside. This resulted in a formyl-imidazole moiety directly on the intact RNA, which was directly used for further bioconjugation reactions. Finally, additional selections and reselections led to the identification of highly active alkyltransferase ribozymes that can be used for the labeling of various RNA targets
Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation.