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PRC1 serves as a microtubule-bundling protein and is a potential therapeutic target for lung cancer
(2023)
Protein regulator of cytokinesis 1 (PRC1) is a microtubule-associated protein with essential roles in mitosis and cytokinesis. Furthermore, the protein is highly expressed in several cancer types which is correlated with aneuploidy and worse patient outcome. In this study it was investigated, whether PRC1 is a potential target for lung cancer as well as its possible nuclear role.
Elevated PRC1 expression was cell cycle-dependent with increasing levels from S-phase to G2/M-phase of the cell cycle. Thereby, PRC1 localized at the nucleus during interphase and at the central spindle and midbody during mitosis and cytokinesis. Genome-wide expression profiling by RNA sequencing of ectopically expressed PRC1 resulted in activation of the p53 pathway. A mutant version of PRC1, that is unable to enter the nucleus, induced the same gene sets as wildtype PRC1, suggesting that PRC1 has no nuclear-specific functions in lung cancer cells. Finally, PRC1 overexpression leads to proliferation defects, multi-nucleation, and enlargement of cells which was directly linked to microtubule-bundling within the cytoplasm.
For analysis of the requirement of PRC1 in lung cancer, different inducible cell lines were generated to deplete the protein by RNA interference (RNAi) in vitro. PRC1 depletion caused proliferation defects and cytokinesis failures with increased numbers of bi- and multi-nucleated cells compared to non-induced lung cancer cells. Importantly, effects in control cells were less severe as in lung cancer cells. Finally, p53 wildtype lung cancer cells became senescent, whereas p53 mutant cells became apoptotic upon PRC1 depletion. PRC1 is also required for tumorigenesis in vivo, which was shown by using a mouse model for non-small cell lung cancer driven by oncogenic K-RAS and loss of p53. Here, lung tumor area, tumor number, and high-grade tumors were significantly reduced in PRC1 depleted conditions by RNAi.
In this study, it is shown that PRC1 serves as a microtubule-bundling protein with essential roles in mitosis and cytokinesis. Expression of the protein needs to be tightly regulated to allow unperturbed proliferation of lung cancer cells. It is suggested that besides phosphorylation of PRC1, the nuclear localization might be a protective mechanism for the cells to prevent perinuclear microtubule-bundling. In conclusion, PRC1 could be a potential target of lung cancer as mono therapy or in combination with a chemotherapeutic agent, like cisplatin, which enhanced the negative effects on proliferation of lung cancer cells in vitro.
Trotz der Fortschritte in der Therapie des Multiplen Myeloms und des stetig wachsenden Arsenals effektiver anti-MM-Medikamente muss ein Teil der Patienten mit bestimmten zytogenetischen Veränderungen der Tumorzellen nach wie vor der Hochrisiko-Gruppe zugeordnet werden und hat eine Lebens-erwartung von nur wenigen Jahren. Einer der ungünstigsten prognostischen Marker ist die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens TP53 durch Mutationen des Gens oder Deletionen des kurzen Arms von Chromosom 17, del(17p). Diese wird häufig mit einer Chemoresistenz der entarteten Plasmazellen in Verbindung gebracht.
In der vorliegenden Arbeit gelang es mittels des CRISPR/Cas9-Systems TP53-Läsionen zu erzeugen und isogene Klone der TP53wt/wt Zelllinie AMO-1 zu generieren. Diese wurden anhand der Sequenzanalysen von beiden TP53-Allelen den Gruppen der biallelisch TP53-inaktivierten, der monoallelisch TP53-inaktivierten und der TP53wt/wt Klone zugeordnet. Das gruppenspezifische Verhalten der Klone aller drei Gruppen hinsichtlich deren Expression von p53, p21 und Mdm2 unterstrich die Validität des etablierten Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung von TP53-Läsionen beim Multiplen Myelom. Neben einer kompletten Ausschaltung durch biallelische TP53-Inaktivierung zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auch eine Haploinsuffizienz des p53-Systems. Diese äußerte sich in einer Abschwächung der Nutlin-3A-abhängigen p53-, p21- und Mdm2-Induktion bereits nach Inaktivierung eines TP53-Allels durch Frameshift-Mutation. Korrelierend zu dem Proteinexpressions¬muster konnte eine zunehmende Resistenzentwicklung der Klone je nach Grad der TP53-Inaktivierung (mono- bzw. biallelisch) gegen Nutlin 3A sowie genotoxische Substanzen nachgewiesen werden, während die Sensibilität der MM-Zellen gegen Proteasominhibitoren unbeeinträchtigt blieb. Einschränkungen hinsichtlich der Übertragbarkeit der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf das Multiple Myelom im Allgemeinen bestehen in dem Umstand, dass die beschriebenen Beobachtungen lediglich an einer einzigen MM-Zelllinie gemacht werden konnten. Dies ist durch die geringe Auswahl an TP53wt/wt MM-Zelllinien, die zudem noch oft eine schlechte Transfektabilität und niedrige Zellteilungsrate nach Einzelzellselektion aufweisen, bedingt.
Die an der Zelllinie AMO-1 gemachten Beobachtungen stehen in Einklang mit der in klinischen Studien festgestellten Verkürzung des progressionsfreien- (PFS) und Gesamt-Überlebens (OS) bei MM-Patienten mit TP53-Alterationen. Die zunehmende Chemoresistenz der malignen Plasmazellen nach mono- bzw. biallelischer TP53-Inaktivierung kann als Grund für die Akkumulation entsprechender Klone im Rezidiv und in fortgeschrittenen Krankheitsstadien des MM angesehen werden. Mittels möglichst umfassender Erfassung des genauen TP53-Läsions-Status in zukünftigen klinischen Studien zu multiplen Zeitpunkten des Krankheitsverlaufs könnte der Einfluss verschiedener, in der Therapie des MM zum Einsatz kommender Substanzen auf die Selektion bzw. die Unterdrückung besonders virulenter Subklone mit TP53-Läsionen untersucht werden.
Inefficient vascularisation of solid tumours leads to the formation of oxygen and nutrient gradients. In order to mimic this specific feature of the tumour microenvironment, a multicellular tumour spheroid (SPH) culture system was used. These experiments were implemented in p53 isogenic colon cancer cell lines (HCT116 p53 +/+ and HCT116 p53-/-) since Tp53 has important regulatory functions in tumour metabolism. First, the characteristics of the cells cultured as monolayers and as spheroids were investigated by using RNA sequencing and metabolomics to compare gene expression and metabolic features of cells grown in different conditions. This analysis showed that certain features of gene expression found in tumours are also present in spheroids but not in monolayer cultures, including reduced proliferation and induction of hypoxia related genes. Moreover, comparison between the different genotypes revealed that the expression of genes involved in cholesterol homeostasis is induced in p53 deficient cells compared to p53 wild type cells and this difference was only detected in spheroids and tumour samples but not in monolayer cultures. In addition, it was established that loss of p53 leads to the induction of enzymes of the mevalonate pathway via activation of the transcription factor SREBP2, resulting in a metabolic rewiring that supports the generation of ubiquinone (coenzyme Q10). An adequate supply of ubiquinone was essential to support mitochondrial electron transport and pyrimidine biosynthesis in p53 deficient cancer cells under conditions of metabolic stress. Moreover, inhibition of the mevalonate pathway using statins selectively induced oxidative stress and apoptosis in p53 deficient colon cancer cells exposed to oxygen and nutrient deprivation. This was caused by ubiquinone being required for electron transfer by dihydroorotate dehydrogenase, an essential enzyme of the pyrimidine nucleotide biosynthesis pathway. Supplementation with exogenous nucleosides relieved the demand for electron transfer and restored viability of p53 deficient cancer cells under metabolic stress. Moreover, the mevalonate pathway was also essential for the synthesis of ubiquinone for nucleotide biosynthesis to support growth of intestinal tumour organoids. Together, these findings highlight the importance of the mevalonate pathway in cancer cells and provide molecular evidence for an enhanced sensitivity towards the inhibition of mitochondrial electron transfer in tumour-like metabolic environments.
Die Therapiemöglichkeiten für Patienten im Melanom Stadium IV sind nach wie vor begrenzt und die Erkrankung nur selten heilbar. Eine mögliche Ziel¬struktur in der Melanom¬therapie der Zukunft könnte das im Melanom häufig genetisch wild¬typisch vorliegende p53 sein.
Für vorliegende Arbeit wurden humane Melanomzelllinien, welche stabil mit einem p53-Reportergenkonstrukt transduziert waren, hinsichtlich ihrer p53-Expression, -Akti-vität und -Akti¬vierbarkeit untersucht. Alle verwendeten Melanom¬zell¬¬¬linien exprimierten p53 un¬ab¬hängig vom p53-Mutations¬status. Drei der sieben untersuchten p53-wild¬typischen Melanomzelllinien zeigten keine oder nur sehr niedrige p53-Reporter¬gen¬aktivität. Die anderen vier p53-wildtypischen Zelllinien dagegen waren durch hohe, mittels p53-Knockdown unterdrückbare Reportergen¬expression gekennzeichnet. Die Proliferation dieser Zellen in Gegenwart von aktivem p53 belegt, dass Melanomzellen eine hohe Toleranz gegenüber diesem Tumor¬suppressor besitzen können. Eine weitere Steige¬rung der p53-Expression und -Aktivität durch die Hemmung von MDM2 (mouse double minute 2) mit der Substanz Nutlin-3a führte in den Zellen mit messbarer p53-Aktivität jedoch zu einem G1-Zell¬zyklusarrest. Dies belegt die prinzipielle Eignung von p53 als mögliche thera¬peutische Zielstruktur. Aufgrund ihrer schlechten Biover¬füg¬barkeit und hohen Toxizität gelten MDM2-Inhibitoren bisher aber als ungeeignet für den klinischen Einsatz.
Die Reduktion hoher therapeutischer Nebenwirkungen könnte durch eine Melanom-spezifische Reaktivierung von p53 gelingen. Eine mögliche negativ-modulierende Wirkung des Mela¬¬nom¬¬markers TRP2 (tyrosinase-related-protein 2) auf p53 wurde im Jahr 2010 von Sendoel et al. nach Unter¬suchungen am Fadenwurm C. elegans vorgeschlagen. TRP2 wird beim metastasierten Melanom in mehr als 80 % der Fälle exprimiert und wäre, handelte es sich beim Melanom um einen weit verbreiteten Regulationsmechanismus, ein interessantes Zielprotein, um die Aktivität von p53 zu steigern. Die dargestellten Ergeb¬nisse zeigen, dass TRP2 zwar in vier von fünf Melanomzelllinien exprimiert wurde, die Unterdrückung der TRP2-Expression jedoch weder spezifischen Einfluss auf die p53-Expression noch auf die p53-Reportergenaktivität zeigte. Auch das veränderte Wachs¬tums¬¬¬verhalten der Zellen nach Unterdrückung von TRP2 mittels drei unterschiedlicher shRNAs konnte im Rescue-Experiment, bei dem TRP nach seinem Knockdown ektop exprimiert wurde, keinem spezifischen Effekt von TRP2 auf die p53-Expression oder p53-Reporteraktivität zugeordnet werden. Auch in der TRP2-negativen Zelllinie führte die ektope TRP2-Expression nicht zu einer verminderten p53-Expression oder -Aktivität. Für das im Gegensatz zu MDM2 deutlich melanomspezifischere TRP2 konnte demensprechend kein sicherer regulatorischer Zusammenhang mit p53 dargestellt werden.
Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche Bedeutung wildtypischem p53 im Melanom zukommt und ob sich weitere mögliche p53-Regulatoren als therapeutische Angriffspunkte eignen.
Precise control of progression through mitosis is essential to maintain genomic stability and to prevent aneuploidy. The DREAM complex is an important regulator of mitotic gene expression. Depletion of Lin9, one core-subunit of DREAM, leads to reduced expression of G2/M genes and impaired proliferation. In conditional mouse knockout cells (MEFs) Lin9 deletion causes defects in mitosis and cytokinesis and cells undergo premature senescence in order to prevent further proliferation. In this work it could be shown that the senescence phenotype in Lin9 knockout MEFs is independently mediated by the two tumor suppressor pathways p53-p21 and p16-pRB. Studies using the conditional Lin9 knockout mouse model demonstrated an important function of Lin9 in the regulation of mitotic gene expression and proliferation in vivo. Deletion of Lin9 caused reduced proliferation in the intestinal crypts resulting in atrophy of the intestinal epithelium and in rapid death of the animals. In the second part of this work, the pathways leading to p53 mediated G1 arrest after failed cytokinesis were analyzed by using a chemical inhibitor of the mitotic kinase Aurora B. In a high throughput siRNA screen the MAP kinase MAP3K4 was identified as an upstream activator of p53. It could be shown that MAP3K4 activates the downstream stress kinase p38b to induce the p53 mediated cell cycle arrest of tetraploid cells. p38b was required for the transcriptional activation of the p53 target gene p21 in response to Aurora B inhibition. In contrast, phosphorylation, stabilization and recruitment of p53 to the p21 promoter occured independently of p38 signaling. Partial inhibition of Aurora B demonstrated that chromosome missegregation also activates the MAP3K4-p38-p53 pathway, suggesting that subtle defects in mitosis are sufficient for inducing this stress signaling pathway. Although p38 was required for the G1 cell cycle arrest after mitotic failures, long-term co-inhibition of p38 and Aurora B resulted in reduced proliferation probably due to increased apoptosis. Presumably, MAP3K4-p38-p53 signaling is a common pathway that is activated after errors in mitosis or cytokinesis to arrest cells in G1 and to prevent chromosomal instability.
Brustkrebs ist gegenwärtig die häufigste bösartige Erkrankung der Frau weltweit und verantwortlich für 15 % der Krebs¬todes-ursachen in der westlichen Welt. Maligne Erkrankungen in metastasierten Stadien gelten generell als unheilbar mit einem medianen Überleben von wenigen Jahren. Das LIM und SH3 Domänen Protein (LASP-1) ist ein spezielles fokales Ad¬hä¬sions-protein, das an den Vorgängen der Zellproliferation und -migration beteiligt ist. Der Knockdown von LASP-1 in metastatischen Brust- und Eier¬stock¬krebs-zelllinien führt zu einer starken Hemmung der Zellmigration und -proliferation. Um¬ge-kehrt kommt es nach Überexpression des Proteins in nicht neoplastischen Zellen zu einer erhöhten Migration. Bei den von uns untersuchten Patientinnen mit Brust- oder Eierstockkrebs korreliert die Überexpression des Proteins mit fortgeschrittener Tumor-größe und Lymphknoten-Metastasierung. Die genetische Analyse von 63 mikrodissektierten histologischen Brust-krebs-Schnittpräparaten mit anschließender qRT PCR auf LASP-1 ergab (mit nur einer positiven Probe; 1,6 %) allerdings keine Amplifikation des Gens. Es scheint, dass die LASP 1 Proteinüberexpression als aktiver Prozess in der Tumorgenese aufgefasst werden kann und in der Mehrheit der Brustkrebsfälle bevorzugt durch trans¬krip-tionelle Regulation als durch Gen¬amplifi¬ka-tion hervorgerufen wird. LASP-1 ist nicht ausschließlich ein zytosolisch lokalisiertes Protein, sondern in malignen Zellen außerdem im Zellkern nachweisbar. In einer Langzeitstudie (Januar 1985 – Dezember 2007) wurde anhand anti-LASP-1 gefärbter histologischer Schnittpräparate die LASP Expression bestimmt und mit dem Patienten-Überleben korreliert. Patientinnen mit nukleärer LASP-1-Lokalisation zeigen, im Vergleich zu nukleär-LASP-1 negativen Schnitten, ein signifikant (p = 0,0250) reduziertes Langzeitüberleben. Mit diesen Ergebnissen lassen sich zukünftig vielleicht prognostische Aussagen über die Auswirkungen der LASP-1-Expression für den einzelnen Patienten treffen.
Trotz radikaler chirurgischer Resektion kommt es bei Patienten mit kolorektalem Karzinom häufig zum Tumorrezidiv. In unserem Patientenkollektiv (n=51) erlitten innerhalb von 3 Jahren 18% der Patienten ein Rezidiv nach kurativer R0-Resektion. Eine mögliche Erklärung dafür wird in einer Suppression der Anti-Tumor-Immunantwort gesehen, die eine vollständige immunologische Tumorzerstörung verhindert. Regulatorische T(Treg)-Lymphozyten spielen hierbei eine wesentliche Rolle. Der Nachweis dieser Zellen und deren gesteigerte IL-10-Produktion könnte eine mögliche Erklärung für die hohe Rezidivrate bei Patienten mit kolorektalem Karzinom bieten. Ziel unserer Untersuchungen war es daher, die tumorspezifische Immunantwort bei Patienten mit kolorektalem Karzinom stadienabhängig (UICC I-IV) zu untersuchen und im Blut und Tumor vorhandene T-Zellen sowohl morphologisch als auch funktionell zu charakterisieren. Als tumorspezifisches Antigen wurde das Tumorsuppressorgen p53 gewählt, da es in bis zu 60% aller kolorektalen Karzinome überexprimiert wird. Präoperativ gewonnene periphere Blutlymphozyten (PBL) dieser Patienten wurden mit überlappenden synthetischen Peptidfragmenten der gesamten Wildtyp-p53-Proteinsequenz stimuliert und anhand der resultierenden Zytokinproduktion (IL-10, IFN-γ) verglichen (ELISPOT, ELISA). Sowohl Cytospinpräparate der PBL als auch Tumorgewebe wurden immunhistologisch in Einzel- und Doppelfärbung charakterisiert. Mittels ELISA wurde das Serum der Patienten auf das Vorhandensein von p53-Antikörpern untersucht. Spezifische p53-Mutationen und die Expression von Treg spezifischen Genen im Tumorgewebe wurden mittels Real-Time-PCR analysiert. Nur bei 35 % der untersuchten Patientensera (n=40) fanden sich p53-spezifische Antikörper, wobei keine Korrelation zum UICC-Stadium bestand. Es zeigte sich, dass sich die p53-Peptide, die eine IFN-γ Produktion hervorrufen, von denen unterscheiden, die eine IL-10 Expression induzieren. Unabhängig von spezifischen p53-Mutationen spielte dabei das UICC-Stadium für die IL-10-Produktion eine besondere Rolle. So produzierten nach Peptid-Stimulation T-Zellen von Patienten im UICC-Stadium II wesentlich mehr IL-10 als T-Zellen von Patienten fortgeschrittener Stadien. Für die IFN-γ-Produktion fand sich keine Korrelation zum UICC-Stadium. Die immunhistologischen Untersuchungen zeigten, dass Patienten höherer Stadien (UICC III/IV) mehr CD4+CD25+-Lymphozyten im Blut und eine stärkere p53-Akkumulation im Tumor aufweisen als Patienten niedrigerer Stadien. Die Expression Treg-spezifischer Gene (CD4, CD25,CTLA-4, Foxp3, GITR, GATA-3) im Tumor korrelierte ebenso mit dem UICC-Stadium und war im UICC-Stadium II gesteigert. p53 induziert sowohl eine IFN-γ als auch eine IL-10 Expression. Das Überwiegen der IL-10-Produktion deutet darauf hin, dass p53-spezifische Treg–Zellen direkt an der Modulation Anti-Tumor-Immunantwort beteiligt sind. Durch Überexpression von p53 induziert der Tumor selbst eine Th2-Immunantwort, die zu vermehrter Toleranz des Tumors durch die Lymphozyten führt. Dies stellt einen neuen möglichen Tumor-Escape-Mechanismus dar. Sowohl die IL-10 Spiegel im Blut als auch die Expression Treg-spezifischer Gene im Tumorgewebe korrelieren mit dem Stadium der Erkrankung. Dies scheint die schlechte Prognose und hohe Rezidivhäufigkeit von Patienten mit bereits weit fortgeschrittenen Karzinomen zu erklären. Die Ergebnisse der Arbeit eröffnen darüber hinaus neue Therapieoptionen: Eine Verschiebung der Anti-Tumor-Immunantwort hin zur vollständigen immunologischen Tumorzerstörung (Th1) wäre in Form einer spezifischen anti-IL-10-Antikörperapplikation oder einer gezielten Depletion der tumorspezifischen Treg–Zellen denkbar.
Ziel dieser Arbeit war es, prognoserelevante Faktoren für das kolorektale Karzinom anhand des eigenen Patientengutes zu untersuchen. Insbesondere sollte die prognostische Relevanz der Tumormarker CEA, CA 19-9 und p53 in Bezug auf tumorbedingtes Überleben und rezidivfreie Zeit analysiert werden, um anhand ihrer Ausprägung die Prognose eines Patienten nach primär chirurgischer Therapie besser definieren zu können. Dementsprechend sollte ein möglichst adäquates therapeutisches Vorgehen gewährleistet sein. Bezüglich des tumorbedingten Überlebens wurde anhand des Kaplan-Meier Verfahrens nachgewiesen, dass sowohl das UICC-Stadium als auch die Darmwandinfiltration (T-Status), Lymphknotenbefall (N-Status) und CEA im Serum als hochsignifikante Parameter dienen, wohingegen eine signifikante Einflussnahme für das Geschlecht, Alter, Tumorlokalisation, Grading, CA 19-9 und p53 (Serummessung) auf das Überleben nicht festgestellt wurde. Bei näherem Betrachten der einzelnen UICC-Stadien in Abhängigkeit von CEA war dieser der aussagekräfitgste prognostische Tumormarker (Serummessung, cut-off point >= 5 ng/ml) für Patienten in höherem UICC-Stadium (UICC III). Bei weiterer Betrachtung der einzelnen Subgruppen des UICC III-Stadiums war CEA insbesondere für Patienten in UICC IIIA am relevantesten. Bezüglich der beiden anderen Tumormarker CA 19-9 und p53 konnte mittels der Serummessungen keine Korrelation mit dem UICC-Stadium bzw. auch keine signifikante Einflussnahme auf das tumorbedingte Überleben festgestellt werden. Für die rezidivfreie Zeit zeigten UICC-Stadium, T-Status, N-Status, CEA (Serummessung) und Tumorlokalisation (Kolon/Rektum) eine signifikante Einflussnahme. Tumoren des Rektums hatten ein höheres Risikoprofil als die des Kolons. Die immunhistologische und molekulargenetische Analyse bezüglich aller drei Tumormarker bestätigte das UICC Stadium III als ein Risikostadium. Dabei lies sich entgegen der Serummessungen auch für CA 19-9 und p53 eine stadienabhängige Risiko-Korrelation darstellen. Des Weiteren korrelierte das Auftreten p53 spezifischer IgG Antikörper stark mit der p53 Proteinexpression im Gewebe, was die Annahme eines Zusammenhangs zwischen intrazellulärer Ansammlung von p53 in Tumorzellen und einer humoralen Antwort auf p53 stützt. Mit Ausnahme von CEA, zeigten CA 19-9 und p53 für sich alleine keine Korrelation zwischen erhöhten Serumwerten und/oder der Expression im Tumor und dem postoperativen Auftreten von Rezidiven. Dahingegen wurde erstmals in dieser Arbeit festgestellt, dass Patienten, die mindestens drei erhöhte Parameter (CEA, CA 19-9 und p53) im Serum und/oder im Tumor (Protein- oder Genexpression) hatten, eine höhere Rezidivrate (Lokal-, Metastasen) während der Tumornachsorge (36±6,6 Monate) zeigten; dies unabhängig von ihrem UICC Stadium (UICC I-III). Speziell diese Risikogruppe könnte von einer adjuvanten Therapie profitieren.
Krebserkrankungen zeichnen sich häufig durch Störungen zellulärer Differenzierungsprozesse aus. So weisen Rhabdomyosarkome, die aus Muskelvorläuferzellen hervorgehen, Differenzierungsdefekte auf, die zur unkontrollierten Proliferation der Tumorzellen führen. Bislang ist ungeklärt, ob die Differenzierungsdefekte auf der verstärkten Expression von Inhibitoren, der defekten Funktion von Aktivatoren oder einer Kombination von beidem beruht. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Unterschied zu normalen Muskelzellen RMS-Zellen verstärkt DeltaNp73, einen Pan-Inhibitor der p53-Tumorsuppressorfamilie, exprimieren. Die experimentelle Überexpression von DeltaNp73 in normalen Myoblasten blockierte die Muskeldifferenzierung und förderte in Kombination mit klassischen RMS-Onkogenen wie IGF2 oder PAX3/FKHR die maligne Transformation. Umgekehrt führte die Hemmung von DeltaNp73 durch RNAi zur Reduktion der Tumorigenität von RMS-Tumorzellen. Da DeltaNp73 als dominant-negativer Inhibitor der p53-Familie wirkt, lies die Hemmung von Differenzierungsprozessen durch DeltaNp73 vermuten, dass die p53-Familienmitglieder (p53, p63, und p73) an der Regulation der Muskeldifferenzierung beteiligt sind. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die drei p53-Familienmitglieder bei der Induktion später Differenzierungsstadien kooperieren, indem sie die Aktivität des Retinoblastoma-Proteins RB regulieren. Die Funktion von RB ist bekanntermassen sowohl für den permanenten Zellzyklusarrest als auch für die Aktivierung Muskel-spezifischer Gene notwendig. Während p53 die Proteinspiegel von RB reguliert, kontrollieren p63 und p73 den Aktivierungsgrad von RB, indem sie dessen Phoshphorylierungszustand über den Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitor p57KIP2 modifizieren. Eine Hemmung dieser Funktionen blockiert das Differenzierungsprogramm und fördert die Tumorentstehung. Die Aktivierung zellulärer Differenzierungsprozesse stellt somit einen entscheidenden Bestandteil der Tumorsuppressoraktivität der p53-Familie dar und liefert eine Erklärung für die Häufigkeit von Mutationen im p53-Signalweg bei Rhabdomyosarkom-Patienten.
Das Ribonukleoprotein, Telomerase wird vor allem für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge benötigt und ist normalerweise nur in Keimbahnzellen, Stammzellen und anderen Zellen mit erhöhter Regenerationsfähigkeit aktiv. Die Aktivierung der Telomerase ist darüber hinaus ein wichtiger Faktor während der Krebsentstehung. Fast das komplette Spektrum humaner Tumore zeichnet sich durch hohe Telomerase-Aktivität aus. Vor allem maligne Tumore besitzen eine sehr aktive Telomerase, unlimitiertes Wachstum und Immortalität ermöglicht. Die Aktivität der Telomerase wird vor allem über die Expression der katalytischen Untereinheit hTERT reguliert, die unter der strikten Kontrolle verschiedener Tumorsuppressorgene liegt. Zu den wichtigsten Regulatoren der hTERT-Expression gehört auch der bekannte Tumorsuppressor p53. Über die Rolle des p53-Familienmitglieds p73 in der Regulation der Telomerase-Aktivität war bisher nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein regulatorischer Einfluss von p73 nachgewiesen werden. Dabei wurden deutliche Unterschiede in der Funktion der N-terminalen Isoformen TAp73 und DeltaNp73 beobachtet. TAp73 erwies sich sowohl nach Überexpression als auch nach Induktion des endogenen TAp73 als ein effizienter Repressor der hTERT-Expression. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hemmung des endogenen TAp73 mittels RNAi die Expression von hTERT in verschiedenen Zelllinen induziert werden. Zusätzlich zu der Funktion als Tumorsuppressor scheint p73 auch in verschiedene Differenzierungsprozesse involviert zu sein. Die Expression von p73 korreliert zwar mit der Hemmung der Telomerase-Aktivität während der myeloischen Differenzierung von HL60-Zellen, hat hier aber keine Bedeutung für die Repression von hTERT. Die N-terminal verkürzte Isoform DeltaNp73 wirkt im Gegensatz zu TAp73 als effizienter Aktivator der hTERT-Expression. DeltaNp73 induziert die hTERT-Expression einerseits über seine dominant-negative Funktion auf die pro-apoptotischen p53-Familienmitglieder und andererseits über die Hemmung repressiver RB-E2F-Komplexe. Im Rahmen dieser Studie erwies sich p73 somit als ein wichtiger Regulator der Telomerase Aktivität, wobei sich eine duale Rolle als negativer (TAp73) und auch als positiver (DeltaNp73) Regulator der Telomerase Aktivität herausstellte.