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Expression immunmodulierende Marker in Zusammenhang mit Immuntherapie bei kindlichen Hirntumoren
(2024)
Atypische teratoide Rhabdoidtumore sind trotz Ausschöpfen der multimodalen Therapieoptionen weiterhin mit einer schlechten Prognose belastet. Gründe hierfür liegen in den oftmals unzureichenden Resektionsmöglichkeiten, dem jungen Erkrankungsalter der PatientInnen und der Resistenz der Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika (Frühwald et al. 2020; Egiz et al. 2022; Richards et al. 2019). Gerade deshalb versucht man durch die aktuelle Forschung zu kindlichen Hirntumoren mit Immuntherapie ein besseres Outcome zu erreichen. Wichtige Grundlagen hierzu sind durch diese Arbeit dargestellt worden. Erstmals wurde gezeigt, dass Tumorzellen der AT/RT sowohl HLA-Klasse I und -Klasse II Antigene präsentieren. Es wurde außerdem die Expression von PD-L1 nachgewiesen. Des Weiteren konnte die Anwesenheit von Immunzellen durch den Nachweis CD 3+ Zellen bewiesen werden. Insgesamt zeigte sich eine große Heterogenität innerhalb des einzelnen und unter den verschiedenen Tumoren. Es zeigte sich eine negative Korrelation zwischen der Expression von MHC I und CD 3+ Zellen, welche insgesamt für einen Tumor Escape Mechanismus sprechen könnte, wie er bereits bei Glioblastomen nachgewiesen wurde (Bagley et al. 2018; Marcu et al. 2021). Es sollte eine Ausweitung der hier begonnen Forschung mit Einbeziehung der personenbezogenen Daten und Vergrößerung der untersuchten Fallzahl erfolgen.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung optimaler DCs für die Generierung von therapeutischen Tumorvakzinen. Neben den essenziellen Eigenschaften der DCs wie der Migrationsfähigkeit, der Hochregulation kostimulatorischer Moleküle sowie der Zytokinausschüttung, ist auch die optimale Aufnahme von Tumor-spezifischen Antigenen und deren Präsentation besonders wichtig, um eine effiziente Immunantwort zur ermöglichen. Wichtigstes Ziel war es über einen optimalen Ausreifungscocktail der DCS eine effektive Antwort der zytotoxischen CD8\(^+\)-Zellen zu erzielen. Dies geschieht im Rahmen der Präsentation von z.B. exogenen Antigenen wie in unserem Falle eines CMV-Proteins über den Weg der sogenannten Kreuzpräsentation.
Hierzu wurde im Rahmen dieser Arbeit der in unserer Klinik etablierte zytokinbasierte Ausreifungscocktail (IL-1β, TNFα) mit einem Ausreifungscocktail, welcher Toll-like-Rezeptor-Agonisten mit PGE\(_2\) kombiniert, verglichen.
Wir konnten erstmals zeigen, dass PGE\(_2\) nicht nur einen Einfluss auf die Ausreifung, Zytokinproduktion und somit Migrationsfähigkeit der DCs hat wie in der Literatur beschrieben, sondern auch auf die Kreuzpräsentationsfähigkeit exogener Antigene.
Das Weglassen von PGE\(_2\) im Cocktail 2 führte zu einer signifikant besseren Kreuzpräsentationsfähigkeit. Somit lässt sich durch unsere Experimente auf eine hemmende Wirkung von PGE\(_2\) auf die T-Zell-Aktivierung über die Kreuzpräsentation schließen.
Als mögliche Schlussfolgerung unserer Experimente sollte bei der Arbeit mit Antigenen, welche über Kreuzpräsentation eine T-Zell-Antwort auslösen (Proteine, Tumorlysat, long-peptides) auf die Zugabe von PGE\(_2\) im Ausreifungscocktail verzichtet werden.
Gegenstand der Arbeit: Es wurde der Einfluss einer Ausreifung dendritischer Zellen mit Poly(I:C), R848 und Prostaglandin E2 (=tlrDCs) zur Verwendung im Rahmen der Tumorvakzine untersucht. Für den Einsatz einer doppelten TLR-Stimulation gibt es zahlreiche zellphysiologische Gründe, wobei PGE2 als Motilitätsförderer eingesetzt wird. Es besitzt negative Teilwirkungen auf die Zytokinsekretion, eine verbesserte Migration stellt aber die wichtigste Stellgröße zur Optimierung der Tumorvakzine dar.
Ergebnisse: Für tlrDCs konnte neben einer hohen Fähigkeit zu Migration und Kostimulation eine überlegene Immunstimulation für naive CTLs und TH1/TC1-Antworten in einem antigenspezifischen Primingmodell nachgewiesen werden. Eine Ausreifungsdauer von 16 h erscheint für die Zytokinsekretion der DCs günstig. Es lässt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit für die Generation von Central-Memory-T-Zellen und das T-Zell-Homing ins ZNS ableiten.
Gehirntumore stellen die zweithäufigste Tumorart im Kindesalter dar. Trotz zahlreicher medizinischer Fortschritte verstirbt auch heute noch ca. 1/3 der Betroffenen und die Überlebenden leiden häufig unter geistigen und körperlichen Langzeitfolgen. Zwei Entitäten, die auch heute noch zu den großen Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie zählen, sind das Glioblastom und das Medulloblastom. Um beide Tumorarten weiter erforschen und neue Therapiekonzepte entwickeln zu können, wurden im Zuge dieser Arbeit zwei orthotope Mausmodelle etabliert: ein syngenes Glioblastom- und ein xenogenes Medulloblastom-Modell:
GL261-FLuc Glioblastom-Modell:
Das Glioblastom ist ein seltener Tumor im Kindesalter. Die extrem schlechte Prognose macht neue Behandlungsstrategien jedoch dringend erforderlich. Immuntherapien könnten hier ein rationaler Ansatz sein. Durch orthotope Inokulation lentiviral transduzierter GL261-FLuc Zellen wurde im Rahmen dieser Arbeit das syngene GL261 Modell etabliert und hinsichtlich seiner biomorphologischen und immunologischen Eigenschaften evaluiert: Ähnlich wie humane Glioblastome zeigen GL261-FLuc Zellen in vivo ein aggressives Wachstum, welches von einer schnellen Proliferation und deutlichen Invasionsneigung geprägt ist. Histologisch bestehen GL261-FLuc Tumore aus astrozytär differenzierten Zellen, die neben typischen Nekrosen auch eine starke, funktionell pathologische Vaskularisierung zeigen. Interessanterweise offenbarte das in vivo BLI nach orthotoper Inokulation eine Phase der „Tumoradaptation“ (Tag 6-14), die immunologischer Natur zu sein scheint. Die Tatsache, dass das Tumorwachstum wie beim Menschen in einer prinzipiell immunkompetenten Umgebung stattfindet und dass GL261-FLuc Zellen eine konstitutionelle und durch IFN γ stimulierbare MHC Klasse I Expression aufweisen, qualifiziert das Modell für immuntherapeutische Untersuchungen. Insgesamt handelt es sich nicht nur um ein gut voraussag- und reproduzierbares Modell, das die immunologischen und bio-morphologischen Kennzeichen des humanen Vorbildes suffizient rekapituliert, sondern es liefert auch dank der Möglichkeit, das Zellwachstum mittels BLI zu verfolgen, interessante Einblicke in das in vivo Verhalten der Zellen.
MB3W1 Medulloblastom-Modell:
Das Medulloblastom ist der häufigste maligne Gehirntumor des Kindesalters und kann, wie neue Genexpressionsstudien zeigen, in verschiedene molekulare Subgruppen unterteilt werden. Für Gruppe 3 Medulloblastome, die mit Abstand die schlechteste klinische Prognose besitzen, gibt es aktuell nur limitierte Daten, unter anderem auch deshalb, weil kaum geeignete Mausmodelle existieren. Der außergewöhnliche Fall eines zweijährigen Jungen, der an einem äußerst aggressiven anaplastischen Medulloblastom verstorben war, führte zur Etablierung des zweiten Hirntumormodells. Mit Zellen dieses Tumors (MB3W1 Zellen), die nach extrakranieller Metastasierung aus malignen Pleuraergüssen isoliert werden konnten, wurde ein orthotopes Xenograftmodell etabliert. Erstaunlicherweise ließen die Zellen sowohl Tumorstammzell- als auch Gruppe 3-Charakteristika erkennen: In vitro wachsen MB3W1 Zellen wie für Stammzellen typisch in Form von Neurosphären und zeigen neben der Fähigkeit zur exponentiellen Langzeitproliferation auch eine hohe ALDH Aktivität. Die Expression typischer Oberflächenmarker wie CD15 und CD133 ist ebenfalls suggestiv für Tumorstammzelleigenschaften. Die hohe Tumorigenität von MB3W1 Zellen in immuninkompetenten Mäusen (bereits 500 Zellen führten zu 100 % Tumorraten) ist neben der Tatsache, dass die induzierten Tumore exakt die histopathologischen Eigenschaften des Primärtumors rekapitulierten und eine multilineäre Differenzierung zeigten, als weiteres Stammzell-kennzeichen zu werten. Ergänzend zum genetischen Profil (MYC Amplifikation, Gruppe 3 spezifisches Genexpressionsmuster, Tetraploidie, 17q Zugewinne), das MB3W1 Zellen klar als Gruppe 3 Medulloblastom identifiziert, spiegeln MB3W1 Zellen auch das aggressive und disseminierende Verhalten, welches Gruppe 3 Tumore auszeichnet, wider. Die Xenotransplantate zeigten nicht nur ein rapides invasives Wachstum in vivo, sondern es konnte interessanterweise auch am Versuchsende regelhaft eine Metastasierung der Zellen in den zerebrospinalen Liquor beobachtet werden. Das im Zuge dieser Arbeit etablierte Xenograftmodell komplementiert die beiden einzigen derzeit veröffentlichten syngenen Gruppe 3 Modelle, da es im Gegensatz zu diesen ohne zusätzliche genetische Manipulation auskommt. Die einzige Modifikation der Zellen (die lentivirale Transduktion mit eGFP und FLuc) diente dem besseren in vivo „Monitoring“, war optional und veränderte auch das biologische Verhalten der Zellen nicht. Insgesamt ist es ein einfaches und gut reproduzierbares Tumormodell, das die gleichzeitige Erforschung von Tumorstammzell- und Gruppe 3-Eigenschaften erlaubt. Vor allem vor dem Hintergrund des außergewöhnlichen klinischen Verlaufs des Primärtumors ist es ein extrem wertvolles Werkzeug, das in Zukunft hoffentlich dazu beitragen wird, neue gezielte Therapiestrategien für die Behandlung solch aggressiver Tumore entwickeln zu können.
Hintergrund: Kraniopharyngeome sind seltene embryonale Fehlbildungstumoren. Bei insgesamt guter Überlebensrate von Patienten nach Erkrankung im Kindes- und Jugendalter werden Prognose und Lebensqualität von Langzeitüberlebenden durch Nebenwirkungen und Spätfolgen wie Hypophyseninsuffizienz und ausgeprägter Adipositas wesentlich geprägt. Zur Prophylaxe bzw. zur Therapie eines Hirnödems, sowie zur Prophylaxe einer drohenden Addisonkrise muss beim Kraniopharyngeom im Kindes- und Jugendalter während und nach der Operation Dexamethason substituiert werden. Langfristige hochdosierte Dexamethasongaben führten bei Patienten mit anderen malignen onkologischen Erkrankungen zu Gewichtszunahme und Cushing-Syndrom. Demnach wurde in der vorliegenden Studie der Einfluss der perioperativen Dexamethasontherapie auf die kurzfristige und langfristige Gewichtsentwicklung bei Kindern und Jugendlichen mit Kraniopharyngeom untersucht. Patienten und Methoden: Die Krankenunterlagen von 81 Kindern und Jugendlichen mit Kraniopharyngeom wurden untersucht. Die Krankenunterlagen von 58 Patienten (27 weiblich - 31 männlich) mit insgesamt 68 operativen Eingriffen konnten hinsichtlich der Daten zum postoperativen Gewichtsverlauf und zur perioperativen Dexamethasontherapie in die retrospektive Untersuchung einbezogen werden. Die mediane Nachbeobachtungsdauer betrug 4,2 Jahre. Größe und Gewicht der Patienten wurde für den Zeitpunkt der Operation, für Kontrollzeitpunkte 3,6, 9 und 12 Monate nach der Operation sowie für die zuletzt stattgefundene Kontrolluntersuchung ermittelt. Um den Grad der Adipositas der einzelnen Patienten zu bestimmen, wurde ihr Body Mass Index (BMI) berechnet. Der BMI wurde anhand der Referenzwerte von Rolland-Cachera als Standardabweichung (SDS) ausgedrückt. Patienten mit BMI- Werten > 3 SD bei der letzten Kontrolluntersuchung wurden als ausgeprägt adipös definiert, solche mit Werten < 2 SD als normalgewichtig, solche mit Werten zwischen 2 SD und 3 SD als mäßig adipös. Zur Beschreibung der Dexamethasontherapie wurden aus den Unterlagen jedes Patienten für jede der neurochirurgischen Operationen die kumulative Gesamtdosis an Dexamethason (mg/m2), Die Dauer der Dexamethasontherapie (Tage) und der Applikationsmodus (intravenös/ oral) ermittelt. Schätzung der Gruppenunterschiede zwischen der Gruppe der ausgeprägt adipösen Patienten und der Gruppe der normalgewichtigen Patienten mittels Mann-Whitney-U-Test. Schätzung der Signifikanz von Korrelationen mittels Spearman-Rank-Correlation-Test. Ergebnisse: 20 Patienten (12w / 8m) entwickelten eine ausgeprägte Adipositas (BMI>3SD). 26 Patienten (10w/ 16m) blieben normalgewichtig (BMI<2SD), 6 Patienten (2w/ 4m) waren bei der letzten Kontrolluntersuchung mäßig adipös (BMI zwischen 2 und 3SD). In Bezug auf das Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Operation und die Dauer der Nachbeobachtung bestanden keine Unterschiede zwischen den Patientengruppen. Zwischen den Patientengruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die kumulative Gesamtdosis an Dexamethason, die Dauer der Dexamethasontherapie und die Applikationsform. Patienten, die langfristig eine ausgeprägte Adipositas entwickelten, hatten bereits zum Zeitpunkt der Diagnose einen höheren BMI (p<0,001). Der höchste Anstieg des BMI innerhalb des ersten postoperativen Jahres lag für alle drei Gruppen von Kraniopharyngeompatienten innerhalb der ersten drei Monate nach der Operation. Schlussfolgerungen: In der Studie konnte gezeigt werden, dass Dosis und Dauer der perioperativen Dexamethasontherapie keinen Einfluss auf die Entwicklung einer langfristigen ausgeprägten Adipositas bei Kindern und Jugendlichen mit Kraniopharyngeom hatten. Patienten, die ein erhöhtes Risiko haben, im langfristigen Verlauf eine ausgeprägte Adipositas zu entwickeln, hatten bereits zum Zeitpunkt der Diagnose einen höheren BMI. Diese Beobachtung stützt die Hypothese, dass pathogene Mechanismen zur Entwicklung einer Adipositas bereits sehr früh den Krankheitsverlauf beeinflussen.