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Characterization of motility and erythrocyte adherence as virulence factors in African trypanosomes
(2018)
Pathogens causing African animal trypanosomiasis (AAT), the major livestock disease in sub-Saharan Africa, belong to the salivarian group of the African trypanosomes, which are transmitted by the bite of the tsetse fly (Glossina spec.). T. vivax, T. congolense and T. brucei brucei are major pathogens of cattle in particular, causing nagana, with dramatic socio-economic consequences for the affected regions. The parasites additionally have a huge reservoir of other livestock and wild animal hosts. T. brucei, the species which also includes the subspecies pathogenic to humans causing sleeping sickness, has been extensively studied as the cultivatable model trypanosome. But less is known about the other salivarian species, which are not routinely held in culture, if at all possible. A hallmark of trypanosomal lifestyle is the protozoan flagellates incessant motility, which enables them to populate an enormous range of habitats in very diverse hosts. We were now able to characterize, for the first time with high spatiotemporal resolution microscopy, the swimming behaviour and mechanism of the most relevant salivarian species isolated directly from blood. We show the influence of viscosity on the motility of bloodstream form (BSF) cells and simulate their movement between erythrocytes, giving a clear picture of how all analyzed species move under varying environmental conditions. We show that although the basic mechanism of flagellar motility applies to all analyzed species, there are clear morphological differences that produce different reactions to the physical environment. We could define specific conditions for highly increased swimming persistence and speed for compared to the behaviour in standard culture. These results have important implications for the parasites survival strategies in the host, e.g. regarding the capacity for antibody clearance. Although we show all species to effectively remove antibodies from the cell surface, T. congolense differed markedly in its motility behaviour, which gives rise to interesting questions about this species behaviour in the bloodstream. Most of the T. congolense parasites (and to a lesser extent T. vivax) adhere to sheep erythrocytes. Further in vitro studies showed that T. congolense and T. vivax adhered to rabbit, goat, pig and cattle erythrocytes- but binding behaviour was absent in murine blood. Notably, both T. brucei and T. evansi lacked adherence to all studied host erythrocytes. Generally, attachment to blood cells caused reduction of swimming velocities. Judging from its cell architecture, as well as the motility studies in higher media viscosity and in micropillar arrays, T. congolense is not adapted to swim at high speeds in the mammalian bloodstream. Low swimming speeds could allow these purely intravascular parasites to remain bound to the host erythrocytes.
Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC.
Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden.
Single-molecule fluorescence microscopy in live \(Trypanosoma\) \(brucei\) and model membranes
(2018)
The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to escape
the host immune response and maintain a persistent infection inside a host. One central
feature of the parasite’s defense mechanism relies on the shielding function of their surface
protein coat. This coat is composed of a dense arrangement of one type of glycosylphosphatidylinositol
(GPI)-anchored variant surface glycoproteins (VSGs) which impair the
identification of epitopes of invariant surface proteins by the immune system. In addition
to the importance of understanding the function of the VSG coat and use it as a potential
target to efficiently fight the parasite, it is also crucial to study its biophysical properties as it is not yet understood sufficiently. This is due to the fact that microscopic investigations
on living trypanosomes are limited to a great extent by the intrinsic motility of the parasite.
In the present study, state-of-the-art single-molecule fluorescence microscopy (SMFM)
is introduced as a tool for biophysical investigations in the field of trypanosome research.
The work encompasses studies of VSG dynamics under the defined conditions of an
artificial supported lipid bilayer (SLB). First, the impact of the lateral protein density on
VSG diffusion was systematically studied in SLBs. Ensemble fluorescence after photobleaching
(FRAP) and complementary single-particle tracking experiments revealed that a
molecular crowding threshold (MCT) exists, above which a density dependent decrease
of the diffusion coefficient is measured. A relative quantification of reconstituted VSGs
illustrated that the VSG coat of living trypanosomes operates very close to its MCT and
is optimized for high density while maintaining fluidity. Second, the impact of VSG
N-glycosylation on VSG diffusion was quantitatively investigated. N-glycosylation was
shown to contribute to preserving protein mobility at high protein concentrations. Third,
a detailed analysis of VSG trajectories revealed that two distinct populations of freely
diffusing VSGs were present in a SLB, which is in agreement with the recent finding, that
VSGs are able to adopt two main structurally distinct conformations. The results from
SLBs were further complemented by single-particle tracking experiments of surface VSGs
on living trypanosomes. A high mobility and free diffusion were measured on the cell
surface, illustrating the overall dynamic nature of the VSG coat. It was concluded that
the VSG coat on living trypanosomes is a protective structure that combines density and
mobility, which is supported by the conformational flexibility of VSGs. These features are
elementary for the persistence of a stable infection in the host.
Different hydrogel embedding methods are presented, that facilitated SMFM in immobilized,
living trypanosomes. The hydrogels were found to be highly cytocompatible for one
hour after cross-linking. They exhibited low autofluorescence properties in the spectral
range of the investigations, making them suitable for super-resolution microscopy (SRM).
Exemplary SRM on living trypanosomes illustrated that the hydrogels efficiently immobilized
the cells on the nanometer lever. Furthermore, the plasma membrane organization was studied in living trypanosomes. A statistical analysis of a tracer molecule inside the
inner leaflet of the plasma membrane revealed that specific membrane domains exist, in
which the tracer appeared accumulated or diluted. It was suggested that this distribution
was caused by the interaction with proteins of the underlying cytoskeleton.
In conclusion, SMFM has been successfully introduced as a tool in the field of trypanosome
research. Measurements in model membranes facilitated systematic studies of VSG dynamics
on the single-molecule level. The implementation of hydrogel immobilization
allowed for the study of static structures and dynamic processes with high spatial and
temporal resolution in living, embedded trypanosomes for the first time.
Neisseria meningitidis is a commensal bacterium which sometimes causes serious disease in humans. Recent studies in numerous human pathogenic bacteria have shown that the stringent response contributes to bacterial virulence. Therefore, this study analyzed the regulation of the stringent response in meningococci and in particular of RelA as well as its contribution to ex vivo fitness in a strain- and condition- dependent manner by using the carriage strain α522 and the hyperinvasive strain MC58 in different in vitro and ex vivo conditions.
Growth experiments revealed that both wild-type strains were almost indistinguishable in their ex vivo phenotypes. However, quantitative real time PCR (qRT-PCR) found differences in the gene expression of relA between both strains. Furthermore, in contrast to the MC58 RelA mutant strain α522 deficient in RelA was unable to survive in human whole blood, although both strains showed the same ex vivo phenotypes in saliva and cerebrospinal fluid. Moreover, strain α522 was depended on a short non-coding AT-rich repeat element (ATRrelA) in the promoter region of relA to survive in human blood. Furthermore, cell culture experiments with human epithelial cells revealed that in both strains the deletion of relA resulted in a significantly decreased invasion rate while not significantly affecting adhesion. In order to better understand the conditional lethality of the relA deletion, computational and experimental analyses were carried out to unravel differences in amino acid biosynthetic pathways between both strains. Whereas strain MC58 is able to synthesize all 20 amino acids, strain α522 has an auxotrophy for cysteine and glutamine. In addition, the in vitro growth experiments found that RelA is required for growth in the absence of external amino acids in both strains. Furthermore, the mutant strain MC58 harboring an ATRrelA in its relA promoter region showed improved growth in minimal medium supplemented with L-cysteine and/or L-glutamine compared to the wild-type strain. Contrary, in strain α522 no differences between the wild-type and the ATRrelA deletion mutant were observed.
Together this indicates that ATRrelA interferes with the complex regulatory interplay between the stringent response pathway and L-cysteine as well as L-glutamine metabolism. It further suggests that meningococcal virulence is linked to relA in a strain- and condition- depended manner. In conclusion, this work highlighted the role of the stringent response and of non-coding regulatory elements for bacterial virulence and indicates that virulence might be related to the way how meningococci accomplish growth within the host environments.
Neisseria meningitidis ist Auslöser invasiver Infektionen, die Sepsis und Meningitis hervorrufen. Bakterielle ADP-Ribosyltransferasen wurden als Toxine zahlreicher Bakterien wie E.coli, V. cholerae und B. pertussis beschrieben, die postranslationale Modifikationen bei eukaryotischen Proteinen mit pathologischer Wirkung für den Menschen hervorrufen. Die ADP-Ribosyltransferase NarE von Neisserien ist auf der Basis von Sequenzhomologien identifiziert worden. Die enzymatische Aktivität des Proteins wurde bereits in Studien gezeigt. Ziel dieser Arbeit war, NarE aus epidemiologischem und populationsbiologischem Blickwinkel zu betrachten.
Insgesamt wurden 576 Meningokokkenisolate (109 Isolate aus der Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie Würzburg und 467 Isolate der Meningococcus Genome Library der Meningitis Research Foundation) auf das Vorhandensein von narE sowie auf Sequenzvariationen untersucht. Das Ergebnis zeigte den Besitz des Gens bei insgesamt 247 Stämmen. Bis auf zwei Punktmutationen waren alle untersuchten narE-Sequenzen identisch. Die narE-positiven Isolate konnten neun klonalen Komplexen zugeordnet werden.
Zusätzlich wurde veranschaulicht, dass das Gen in Komplexen vorkommt, die verwandtschaftlich nicht eng miteinander verbunden sind.
Mittels Western Blot konnte bei allen narE-positiven Meningokokken die Proteinexpression bestätigt werden, wobei ein signifikanter Unterschied zwischen Stämmen des cc32 und cc41/44 festzustellen war. Auf Transkriptionsebene konnte mittels qRT-PCR kein Unterschied zwischen diesen Komplexen ermittelt werden, so dass der Expressionsunterschied auf einem posttranskriptionellen Mechanismus beruhen muss.
Neisseria gonorrhoeae ist ebenfalls im Besitz des Gens wie von Masignani et al. (2003) am Beispiel weniger Isolate beschrieben. In dieser Arbeit konnte für alle 29 getesteten Gonokokken die Insertion von vier Basenpaaren bestätigt werden, die zu einer Verschiebung im Leseraster führt, so dass NarE nicht exprimiert wird. Auch ein Neisseria sicca Stamm beinhaltet und exprimiert das narE-Gen.
Citrobacter freundii sind Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Als opportunistischer Erreger kann C. freundii beispielsweise Harnwegsinfektionen und Neugeborenen-Meningitis verursachen. Die Internalisierung von C. freundii 3009 in das Endosom von Harnblasenepithelzellen (T24) erfolgt in vitro über einen ausschließlich Mikrotubuli-abhängigen Mechanismus. Als genetische Grundlage der Invasionskompetenz von C. freundii 3009 wurde in Vorarbeiten eine im Chromosom lokalisierte Invasionsdeterminante identifiziert, die eine hohe Identität zum Typ 1 Fimbrien Gencluster (fim) von Salmonella enterica serovar Typhimurium aufweist. Diese in Plasmid pTO3 klonierte Invasionsdeterminante vermittelt nicht-invasiven E. coli K12 Stämmen Invasivität. Im Gegensatz dazu sind rekombinante E. coli K12 Klone, die das fim Operon aus S. enterica serovar Typhimurium bzw. E. coli oder andere E. coli Adhäsindeterminanten tragen, nicht invasiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für die Invasionsfähigkeit von C. freundii 3009 essentiellen Gene der klonierten Invasionsdeterminante ermittelt. Dies geschah zum einen durch Subklonierung von Teilen des Plasmids pTO3. In anschließenden Invasionsassays wurden die entsprechenden E. coli K12 Klone hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Invasion untersucht. Die Internalisierung des Wildtyps C. freundii 3009 sowie der invasiven rekombinanten E. coli K12 Stämme konnte nicht nur, wie erwartet, mittels Mannose, sondern auch mittels Chitinhydrolysat [(GlcNAc)n] inhibiert werden. Zum anderen wurden C. freundii Wildtypmutanten konstruiert, in denen der zentrale Teil der Invasionsdeterminante deletiert ist. Diese chromosomalen Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp 3009 eine deutlich reduzierte Invasionsrate in die humane Harnblasenepithelzellinie T24 auf. Für die Komplementante wurde die Wiederherstellung des invasiven Phänotyps demonstriert. Darüber hinaus ist bekannt, dass C. freundii 3009 in humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus dem Gehirn (HBMEC) eindringen und dort replizieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl C. freundii 3009 als auch der, die fimCf Determinante tragende, rekombinante E. coli Stamm HB101pPH1 in der Lage sind, im Tiermodell mit neugeborenen Ratten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Neben der Analyse der Funktion der klonierten C. freundii 3009 fim Determinante in Invasionsassays und mittels Mannose-sensitiver Hefeagglutination, wurden die Genprodukte selbst ebenfalls nachgewiesen. Durch radioaktive Markierung der für die Invasivität essentiellen Proteine nach induzierter Transkription in einem T7 Phagenexpressionssystem konnten die Molekulargewichte von FimCfA, FimCfD, FimCfF und FimCfH ermittelt werden. Diese stimmen mit den von der DNA Sequenz abgeleiteten Molekulargewichten gut überein. Sowohl mit C. freundii 3009 als auch mit entsprechenden rekombinanten E. coli K12 Stämmen gelang es in Westernblots, das Adhäsin FimCfH an der Bakterienoberfläche nachzuweisen. Dies konnte auch für FimCfF in denselben rekombinanten E. coli K12 Stämmen gezeigt werden. Allerdings scheinen die FimCf Proteine nicht zu einem Pilus assembliert zu werden, da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von C. freundii 3009 oder die fimCf Determinante tragenden E. coli K12 Stämmen niemals Fimbrien beobachtet werden konnten. Da auch bestimmte Typ 1 Fimbrien Varianten aus E. coli über das Adhäsin FimEcH die Internalisierung der Bakterien in Blasenepithelzellen zu induzieren vermögen, wurden die fimEc Gencluster aus den beiden human pathogenen E. coli Stämmen 536 (uropathogenes Isolat) und IHE3034 (Neugeborenen-Meningitis Isolat) kloniert. Zudem wurde die Invasionsfähigkeit des E. coli K1 Stamms IHE3034 und der fim negativen Insertionsmutante IHE3034-2 charakterisiert. Typ 1 Fimbrien werden als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli (UPEC) angesehen. Trotzdem konnte eine Reihe von klinischen UPEC Isolaten identifiziert werden, die diesen Adhäsintyp nicht mehr exprimieren. Genetische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass in 11 Isolaten das fimEc Operon vollständig aus dem Chromosom der Bakterien deletiert ist. In den übrigen 6 Isolaten ist noch ein Teil des 3´-Endes des Gens fimECH vorhanden. Außerdem ist in die Deletionsstelle dieser 6 Isolate ein IS1 Element von E. coli inseriert. In den übrigen uropathogenen Isolaten sind auch angrenzende DNA Bereiche von der Deletion betroffen. Abschließend kann festgestellt werden, dass eine fim ähnliche Determinante in C. freundii 3009 als Invasionssystem fungiert. Die Typ 1 Fimbrien der E. coli Stämme 536 und IHE3034 sind zwar notwendig, aber nicht hinreichend für die Invasivität. Obwohl Typ 1 Fimbrien als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli gelten, ist dennoch in einer Reihe von klinischen UPEC Isolaten das fimEc Operon deletiert.
Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen.
Vergleich der Bakterienlast in vivo und Wachstumskinetik in vitro hyperletaler Meningokokkentypen
(2020)
Die invasive Meningokokkenerkrankung stellt weltweit mit einer Letalität von 5-10% trotz antibiotischer Therapie eine Herausforderung dar. Ein spezifisches Virulenzgen, welches die Schwere der Meningokokkenerkrankung bestimmt, konnte bisher nicht definiert werden. Vorangegangene Studien zeigen eine Korrelation der Letalität mit der Bakterienlast, Unterschiede bezüglich der Letalität je nach Serogruppe, eine erhöhte Letalität bei Infektionen mit sogenannten hyperletalen Feintypen (bisher nicht veröffentlichte Daten des NRZMHi) sowie einen Unterschied in der maximal in Flüssigkultur erreichten Konzentration der Bakterien zwischen invasiven Stämmen und Trägerstämmen.
In dieser Arbeit wurden mögliche Gründe für die Hyperletalität bestimmter Meningokokkentypen experimentell untersucht. Insbesondere wird die Frage analysiert, ob die hyperletalen Meningokokkentypen mit einer höheren bakteriellen Last im Blut assoziiert sind und ob sie andere Wachstumscharakteristiken im Vergleich zu ihren Kontrollstämmen in vitro zeigen.
Hierzu erfolgte mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion die Bestimmung der bakteriellen Last in 62 Blutproben von Patienten mit bestätigter invasiver Meningokokkenerkrankung über den Nachweis des ctrA-Gens. Darunter waren elf Proben des hyperletalen Feintyps B:P1.7-2,4:F1-5 und fünf Proben des hyperletalen Feintyps C:P1.5,2:F3-3.
Die Wachstumsversuche wurden mit 30 zufällig gewählten Stämmen der hyperletalen Feintypen B:P1.7-2,4:F1-5, C:P1.5-1,10-8:F3-6 und C:P1.5,2:F3-3 mit ihren jeweiligen nach Alter und Geschlecht abgeglichenen nicht zu der Gruppe der hyperletalen Feintypen gehörenden Kontrollstämmen in dem Medium PPM+ durchgeführt.
Die Wachstumsgeschwindigkeit μ sowie die Kapazität A (maximale Konzentrationszunahme als Logarithmus der gemessenen OD im Verhältnis zur Ausgangsdichte ODT0) wurden durch nicht-lineare Regression anhand der modifizierten Gompertz-Funktion ermittelt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte alle 30 Minuten über 16 Stunden bei 620nm durch das Gerät TECAN Infinite 200 Pro (Tecan Group Ltd., Männedorf / Schweiz). Die Methode wurde anhand einer publizierten Studie zwischen Trägerstämmen und invasiven Stämmen (Schoen et al., 2014) validiert und bestätigte einen marginalen Unterschied in der optischen Dichte (p=0,057, Wilcoxon-Test) zwischen den Gruppen. Es zeigte sich kein Unterschied in der Wachstumsgeschwindigkeit.
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit können drei wesentliche Schlussfolgerungen gezogen werden:
1.) Die Bakterienlast in dieser Stichprobe ist, entgegen der Literatur, nicht abhängig von der Serogruppe und dem Feintyp, jedoch von der Krankheitsmanifestation.
2.) Die Kapazität A ist in der Gruppe der „hyperletalen“ Typen im Vergleich zu den Kontrollstämmen möglicherweise höher.
3.) Größere Stichproben (Nativmaterial, Stämme) sind erforderlich, um die Beobachtungen dieser Studie zu bestätigen.
Die sekretorischen Aspartatproteasen (Saps) des Hefepilzes Candida albicans gelten als wichtiger Virulenzfaktor dieses opportunistischen Krankheitserregers. Die zehn Sap-Isoenzyme werden von einer Genfamilie codiert, deren Vertreter (SAP1-SAP10) in der Vergangenheit bereits intensiv untersucht wurden. SAP-Expressionsanalysen und die Charakterisierung von sap-Deletionmutanten, die in einem auxotrophen Laborstamm hergestellt wurden, führten aber zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen, weshalb die Rolle der einzelnen Proteine bis heute nicht zweifelsfrei aufgeklärt ist. Eine differentielle Expression der SAP-Gene in unterschiedlichen Stadien einer Infektion wurde jedoch in vielen unabhängigen Studien gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Expression der Gene SAP1-SAP6 in einem etablierten in vitro-Modell einer Candida-Vaginitis untersucht, das auf der Infektion von rekonstituiertem humanem Epithel (RHE) basiert. Dazu wurden Reporterstämme verwendet, die bereits früher für Expressionsanalysen in verschiedenen in vivo-Infektionsmodellen in Mäusen eingesetzt worden waren. Dies erlaubte es einerseits unterschiedliche Nachweismethoden zur SAP-Genexpression in einem standardisierten Modell zu vergleichen und andererseits das Expressionsmuster der SAP-Gene in einem in vitro-Infektionsmodell mit den Ergebnissen von in vivo-Infektionsexperimenten zu korrelieren. Es zeigte sich in Übereinstimmung mit Ergebnissen früherer in vivo-Experimente in Mäusen, dass bei der Infektion des vaginalen Gewebes vor allem das SAP5-Gen induziert wurde. Allerdings weicht dieses Ergebnis deutlich von Ergebnissen anderer Studien ab, die mit Hilfe anderer Methoden ein ungleiches Muster der SAP-Expression detektierten. Um die Rolle der Gene SAP1-SAP6 bei der Infektion genauer zu untersuchen, wurden deshalb Mutanten hergestellt, in denen einzelne oder mehrere SAP-Gene mit Hilfe einer neuartigen Mutagenesestrategie erstmals aus dem Genom eines wildtypischen C. albicans-Stammes deletiert wurden. Überraschenderweise konnte sowohl in Einzelmutanten der Gene SAP1-SAP6 als auch in sap1 sap2 sap3- und sap4 sap5 sap6-Triplemutanten keine verminderte Fähigkeit zur Invasion und Schädigung von humanem Gewebe in RHE festgestellt werden. Eine in früheren Arbeiten beschriebene abgeschwächte Virulenz solcher Mutanten konnte auch in einem murinen Modell für eine disseminierende Infektion nicht beobachtet werden. Die Sekretion von Aspartatproteasen ermöglicht es C. albicans Proteine als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden. Unter diesen Bedingungen wird spezifisch die Expression des SAP2-Gens induziert; jedoch ist über die Mechanismen dieser Regulation noch wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Promotor-Deletionsanalysen des SAP2-Gens und des mit diesem co-regulierten Oligopeptidtransportergens OPT1 durchgeführt. Es zeigte sich, dass unterschiedliche Bereiche innerhalb der 3,5 kb großen regulatorischen Region von SAP2 gemeinsam eine Expression dieses Gens unter induzierenden Bedingungen ermöglichen. Für das OPT1-Gen konnte eine regulatorische Region eingegrenzt werden, die für die Expression dieses Gens essentiell ist. In den für die Expression von SAP2 und OPT1 wichtigen Regionen wurden ähnliche Sequenzen gefunden, die als Bindungsstellen für regulatorische Faktoren dienen könnten. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur Regulation und Bedeutung der sekretierten Aspartatproteasen von C. albicans erhalten. Um eine endgültige Bewertung der Rolle dieser Enzyme in der Virulenz des Erregers zu ermöglichen, sind jedoch noch weitere detaillierte Studien unter Verwendung verschiedenster Infektionsmodelle nötig.