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In dieser Arbeit untersuche ich das Verhalten von Arbeiterbienen beim Brutwärmen, die Wärmeübertragung von den Bienen auf die gedeckelte Brut, die thermophysikalischen Eigenschaften des Brutnests und spezielle Aspekte des Brutnestaufbaus, die für dieses Thema relevant sind und bisher nicht untersucht wurden. Meine Arbeit umfasst Verhaltensbeobachtungen und thermografische Messungen an individuellen Bienen, die Simulation des Heizverhaltens von Arbeiterinnen und das Messen der Temperaturänderungen in der Wabe, die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und der Zellwände (Wärmeleitfähigkeit und Durchlässigkeit für Wärmestrahlung), die Auswertung von Brutzelltemperaturen als Ergebnis des Verhaltens von Arbeiterbienen, die Analyse der Anzahl und der räumlichen Verteilung von Brutlücken (Auswertung in 2-D und 3-D bezüglich beider Wabenseiten) und die Entwicklung spezifischer Computersoftware, die zur Erarbeitung dieser Ergebnisse unverzichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung und Beschreibung eines bemerkenswerten, bislang unbekannten Verhaltens der Honigbiene: Die Aufrechterhaltung hoher Thoraxtemperaturen (TTh) bei Langzeitbesuchen in offenen Zellen („Lücken“) die verstreut in der gedeckelten Brutfläche vorkommen. Hier zeige ich, dass die Aufrechterhaltung der hohen TTh nicht auf den Zellinhalt (z. B. offene Brut) bezogen ist - in den meisten Fällen waren die besuchten Zellen ohnehin leer - sondern auf die direkt benachbarte gedeckelte Brut, mit der diese Zellen über gemeinsame Zellwände in Kontakt stehen. Dieses Verhalten liefert eine Erklärung für Langzeitzellbesuche von sehr langer Dauer ohne erkennbare Aktivität, die in früheren Arbeiten beschrieben aber nicht völlig verstanden wurden, und es rehabilitiert die scheinbar „faulen“ Bienen im Zellinnern. Diesem Verhalten kommt eine große Bedeutung für das Brutwärmen zu, da sich der aufgeheizte Thorax tief in der Wabe (fast an der Mittelwand) befindet wo der Wärmeverlust an die Luft minimiert ist und von wo bis zu 6 umliegende Puppenzellen gleichzeitig gewärmt werden können. Im Vergleich zum Brutwärmeverhalten an der Wabenoberfläche (Andrücken des Thorax an die Brutdeckel), wo nur 1 oder Teile von 3 Brutdeckeln mit dem Thorax in Berührung stehen, ist das Wärmen im Zellinnern mit derselben TTh bis zu 2,6-fach effizienter. Die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und die Simulation des Brutwärmeverhaltens unter kontrollierten Bedingungen zeigen, dass sich die Wabe langsam aufwärmt und eher ein lokal begrenztes Wärmen als eine rasche Wärmeausbreitung über eine große Fläche begünstigt. Der Einflussbereich eines einzelnen Zellbesuchers hängt von seiner TTh und der Dauer des Zellbesuchs ab. Anstiege der Bruttemperatur in bis zu 3 Zellen Abstand zum Zellbesucher sind nachweisbar. Das hier beschriebene Brutwärmeverhalten im Innern von Lücken (offenen Zellen) bietet nicht nur neue Einsichten in das Bienenverhalten. Es ermöglicht auch eine Neubewertung der Lücken und ihrer Nützlichkeit für die Bienen. Eine von mir entwickelte Computersoftware („CombUse 2.0“) ermöglicht es, das Vorkommen und die räumliche Verteilung von Lücken mit hoher Genauigkeit auf der Ebene einzelner Zellen zu erfassen und auszuwerten. Die räumliche Verteilung der Lücken in der gedeckelten Brutfläche zeigt, dass schon bei geringen Lückenhäufigkeiten von ca. 4 bis 10 %, die in gesunden Kolonien normal sind, eine überraschend große Zahl gedeckelter Brutzellen (88 % bis 99 %, wenn die dreidimensionale Verteilung berücksichtigt wird) im Einflussbereich von Brut wärmenden Zellbesuchern sind. Obwohl das Brutwärmeverhalten im Zellinnern schwer zu entdecken und zu beobachten ist, führen die in dieser Arbeit präsentierten Daten zu dem Schluss, dass es sich dabei um einen wichtigen Bestandteil der Nestklimatisierung bei Honigbienen handelt.
„Die berufspolitische Situation für die Humangenetischen Institute hat sich an den Universitäten in den letzten zwei Jahren leider nicht verbessert. Vielen Instituten wurde der Zugang zur Erbringung von Kassenleistungen deutlich erschwert bzw. gänzlich entzogen.“ (Grimm, T.; Zerres, K., 2005, S. 41). Eine Analyse der Rechtsform und Aufbauorganisation sowie der Leistungen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg kann als Grundlage dienen, um die Auswirkungen einer entzogenen Kassenzulassung besser verstehen zu können. Zudem ermöglicht eine solche Betrachtung die Ableitung von Erfordernissen, die eine optimale Rechtsform und Aufbauorganisation des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg erfüllen sollte. Zusammenfassend können dann die aktuellen und zukünftigen Rahmenbedingungen für die humangenetische Leistungserbringung bei bestehender Rechtsform und Aufbauorganisation beschrieben werden. Es wird deutlich, dass aufgrund eines drohenden Entzuges der Kassenzulassung eine Gefährdung der Erbringung humangenetischer Leistungen an der Universität Würzburg besteht. Die Finanzierung der erbrachten Leistungen in der Patientenversorgung wird zu ca. 75% von den gesetzlichen Krankenkassen getragen. Ein Wegbrechen eines solchen Leistungsumfanges hätte kaum kompensierbare Auswirkungen auf Forschung, Lehre, Weiterbildung und die Patientenversorgung an sich. Durch die Reformen des SGB aus dem Jahre 2004 sind verschiedene Alternativen zur bestehenden Rechtsform und Aufbauorganisation möglich geworden. Hierbei handelt es sich um Hochschulambulanzen (gem. §117 SGB V), Integrierte Versorgung (gem. §140 SGB V) und Medizinische Versorgungszentren (gem. §95 SGB V). Zudem gibt es die Möglichkeit einer „Praxis im Institut“-Kooperation. Diese Alternativen werden in der hier vorliegenden Arbeit kurz einzeln charakterisiert, um dann eine Bewertung der möglichen Rechtsformen und Aufbauorganisationen gemäß am Institut bestehender Erfordernisse zu ermöglichen. Die vergleichende Betrachtung wird zeigen, dass ein Medizinisches Versorgungszentrum (MVZ) eine gute Möglichkeit darstellt, die beschriebene Problematik zu lösen und die Erfordernisse des Instituts zu erfüllen. Im Anschluss werden die rechtlichen und organisatorischen Ausgestaltungsmöglichkeiten eines MVZs zur Erbringung humangenetischer Leistungen beleuchtet. Hierbei wird im Besonderen auf die gesetzlichen Gründungsvoraussetzungen eingegangen. Die Anforderungen an Gründer, Rechtsform, Leistungserbringer und ärztliche Leitung werden detailliert beschrieben, und die jeweiligen Gestaltungsmöglichkeiten im Hinblick auf die am Institut bestehenden Erfordernisse gewertet. Im Anschluss kann der Zulassungsprozess des MVZs an sich betrachtet werden.
Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eindämmung der Malaria
(2008)
In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eindämmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gefährlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ansätze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bezüglich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegenüber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente natürliche und künstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung natürlicher Resistenzallele in natürlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erwägungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (Löwe, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology“ eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen können, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche für die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zusätzlich zur deutschen wurde für eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz ermöglichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in natürlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschränkt sich nicht auf das primäre Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie.
Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF5A) ist evolutionär hoch konserviert und besitzt als einzig bislang bekanntes Protein die Aminosäuremodifikation Hypusin. Obwohl eIF5A ubiquitär exprimiert wird, sind die zellulären Funktionen von eIF5A noch weitgehend unklar. Hypusininhibitoren konnten die Oberflächenexpression von CD83 die CD83 mRNA im Zellkern dendritischer Zellen anreichern und folglich die Oberflächenexpression von CD83 verhindern konnten, wurde eine Beteiligung von eIF5A beim nukleozytoplasmatischen Export der CD83 mRNA vermutet. Weiterhin ist bekannt, dass HuR, ein Protein der ELAV-Familie, an ein cis-aktives RNA-Element mit einer ausgeprägten Sekundärstruktur innerhalb der kodierenden Sequenz der CD83 mRNA bindet. Während die Bindung von HuR an AU-reiche Elemente in der 3UTR bestimmter Transkripte zu deren Stabilisierung führt, wird die Stabilität von CD83-Transkripten durch die Interaktion mit HuR jedoch nicht beeinflusst. In dieser Arbeit wurden Mikroinjektionsstudien in Xenopus laevis-Oozyten zum nukleozytoplasmatischen Export von CD83 mRNA durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die charakteristische Sekundärstruktur des HuR-Response-Elements essentiell für den Kernexport von CD83-Transkripten ist. HuR wurde zudem als Bindungspartner von eIF5a identifiziert. Inhibitorische Antikörper sowohl gegen HuR als auch eIF5A waren in der Lage, den Export von CD83-Transkripten zu inhibieren. Während die meisten mRNAs durch den TAP/NXT1-vermittelten Exportweg in das Zytoplasma transportiert werden, transloziert CD83 mRNA CRM1-vermittelt, da der Export durch den CRM1-Inhibitor Leptomycin B gehemmt werden konnte. Oozytentypischer TFIIIA, ebenfalls ein Interaktionspartner von eIF5A, ist in jungen Xenopus-Oozyten sowohl bei der RNA-Polymerase III-abhängigen Transkription von 5S rRNA als auch am nukleozytoplasmatischem Export und der Lagerung von 5S rRNA im Zytoplasma beteiligt. Aufgrund der Parallele zwischen dem HIV-1-Rev vermittelten HIV-1-mRNA-Export und dem TFIIIA-vermittelten 5S rRNA-Export, wurde der Export von TFIIIA im Hinblick auf eine Beteiligung von eIF5A als Kofaktor analysiert. In Xenopus-Oozyten wurde TFIIIA an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe detektiert. Weiterhin konnte durch den Einsatz des spezifischen CRM1-Inhibitors Leptomycin B bestätigt werden, dass TFIIIA, welches ein leucinreiches Kernexportsignal enthält, mittels CRM1 exportiert wird. Im Overlay-Blot-Assay konnte gezeigt werden, dass eIF5A mit TFIIIA interagiert. Außerdem deuten Mikroinjektionsexperimente darauf hin, dass eIF5A, wie beim HIV-1-Rev-vermittelten Export, auch beim TFIIIA-Export als essentieller Kofaktor involviert ist. Ein weiterer bekannter Bindungspartner von eIF5A ist Aktin, das im Zellkern an verschiedenen Exportprozessen sowie der RNA-Polymerase I-, II- und III-abhängigen Transkription beteiligt ist. Im Gegensatz zu Aktin wurde die Existenz des Aktinpartners Myosin im Zellkern erst vor kurzem realisiert. In dieser Arbeit konnten durch bioinformatische Analysen gezeigt werden, dass Kernmyosin IC bei Vertebraten weit verbreitet ist. Es wurde auch bei Xenopus laevis identifiziert. Im Vergleich zu Myosin IC fand sich ein zusätzlicher Aminoterminus aus 16 Aminosäuren, welcher als Kernlokalisationssignal fungiert. In Oozyten von Xenopus laevis konnte Kernmyosin IC, ähnlich wie RNA-Polymerase II, an den lateralen Schleifen der Lampenbürstenchromosomen dargestellt werden. Inhibierende Kernmyosinantikörper führten nach Mikroinjektion in den Zellkern von Xenopus-Oozyten zu einer kompletten Retraktion der meisten lateralen transkriptionsaktiven Schleifen sowie zu einer Verkürzung der Chromosomenachsen. konnte Kernmyosin IC vor allem im Nukleoluskern detektiert werden, wo es partiell mit RNA-Polymerase I und Fibrillarin kolokalisierte. In amplifizierten Nukleolen führte eine Transkriptionsinhibition mit Aktinomycin D zu einer Umverteilung des Kernmyosin IC zusammen mit der RNA-Polymerase I und der rDNA. Nach Injektion inhibierender Kernmyosinantikörper kam es zu einem massiven architektonischen Umbau der Nukleolen. Im Gegensatz zu den Nukleolen von somatischen Xenopus-Zellen war ein BrUTP-Einbau in amplifizierte Nukleolen jedoch noch möglich. Wie für Kernaktin bereits beschrieben, konnte auch Kernmyosin IC an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe von Xenopus laevis-Ooyzten dargestellt werden. Da Aktin als essentieller Kofaktor an Exportprozessen beteiligt ist, sollte in Mikroinjektionsexperimenten auch eine Beteiligung von Kernmyosin IC beim Kernexport überprüft werden. Antikörper gegen ein Epitop in der Myosinkopfdomäne des Kernmyosin IC (XNMIC #42) waren im Gegensatz zu Antikörpern, die den charakteristischen Aminoterminus aus 16 Aminosäuren erkennen (XNMIC #54), in der Lage, einen CRM1-vermittelten Proteinexport zu inhibieren.
Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln.
Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen Überprüfung zu unterziehen, wurde ein neues Affinitätsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen stöchiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller Übereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche“ RNAs verhindert. Folglich genügen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, während die übrigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen könnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindrückliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann.
Während der Spermatogenese finden erstaunliche Differenzierungsprozessen statt. Reguliert wird die Spermatogenese sowohl hormonell als auch durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und der extrazellulärer Matrix. Unterteilt wird die Spermatogenese in drei funktionelle Einheiten. Die Proliferationsphase, die Meiose und die Spermiogenese. Im Laufe der Proliferationsphase gehen aus den Spermatogonien, Spermatocyten hervor, die die Meiose durchlaufen. Während der Prophase I der Meiose kommt es zur Reduktion und Rekombination des genetischen Materials, was mit charakteristischen und höchst dynamischen Bewegungsvorgängen der Telomere einhergeht. Auf die Meiose folgt die Spermiogenese, in der das genetische Material in seine „Transportform“ überführt wird und aus einer stationären, zellverbundenen Einheit ein mobiles autark funktionierendes Vehikel des genetischen Materials wird; das Spermium. Um das Verständnis dieser Vorgänge zu erweitern wurden in dieser Arbeit die Verteilungsmuster einiger Proteine in der Kernhülle von Zellen der Spermatogenese, in Hinblick auf ihre dynamische Umverteilung untersucht. Bei diesen Proteinen handelte es sich um die SUN-Domänen Proteine und das meiosespezifische Lamin C2. Die SUN-Domänen Proteine sind Teil des membrandurchspannenden LINC-Komplexes, der Komponenten des Nukleoplasma mit denen des Cytoplasma verbindet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun2 während der Meiose exprimiert werden, und an den Anheftungsplatten meiotischer Chromosomen lokalisieren und deren dynamisches Verteilungsmuster dem Verteilungsmuster der Telomere während der Prophase I der Meiose entsprechen. Dies deutet darauf hin, dass Sun1 und Sun2 eine tragende Rolle, während der koordinierten Bewegungsprozessen der Prophase I der Meiose spielen. In der Spermiogenese sind die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun3 vertreten. Dabei weist deren unterschiedliche Lokalisation an entgegengesetzten Zellpolen darauf hin, dass Sun1 und Sun3 möglicherweise unterschiedliche Funktionen bei der Umgestaltung des Spermienkopfes während der Spermiogenese erfüllen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung einer Mauslinie um die Rolle von Lamin C2 in der Meiose untersuchen zu können. Hierzu wurde eine Lamin C2 Knock-out Studie begonnen. In ersten Untersuchungen der knock-out Tiere konnte eine Größenreduktion der Hoden beobachtet werden. Ebenso konnte ein Abbruch der Meiose vermerkt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass sowohl die SUN-Domänen Proteine, als auch Lamin C2, wichtige Rollen in dem komplexen Arrangement der Spermatogenese übernehmen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der molekularen Grundlagen der Proepikardentwicklung im Huhn. Das Proepikard (PE) stellt die Vorläuferpopulation des Koronargefäßsystems dar. Es wurden zwei Schwerpunkte bearbeitet, zum einen die Rolle von einem Mitglied der TGFß-Superfamilie (BMP, bone morphogenetic protein) während der Induktionsphase des PE und zweitens die molekularen Mechanismen, welche der links/rechts Asymmetrie der PE Entwicklung zugrunde liegen. Die Expressionsmuster von TBX18, WT1, CFC weisen diese als proepikardiale Marker aus. BMP4 wird ebenfalls im PE exprimiert, wenngleich wesentlich schwächer als BMP2 im benachbarten Sinusmyokard. Durch in vitro Experimente mit proepikardialen Primärkulturen wurde festgestellt, dass die Zugabe von rekombinatem BMP2 einen Teil der Zellen zu Kardiomyozyten differenzieren lässt. Daher wird angenommen, dass ein Teil der proepikardialen Zellen konzentrationsabhängig auf Wachstumsfaktoren reagieren und in der Lage sind, die epikardiale Linie zu verlassen und ein myokardiales Schicksal anzunehmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle des NODAL-PITX2-Signalweges in Bezug auf die Unilateralität des Proepikards im Hühnchen analysiert. Dazu wurden Manipulationen des Hensenschen Knotens im HH Stadium 4 durchgeführt, mit dem Ziel linksseitige Markergene auf der rechten Seite ektopisch zu induzieren. Keine dieser Manipulationen, als auch eine virale Überexpression von PITX2 in sinuatrialen Progenitoren in vivo, liess eine Veränderung der TBX18-Lateralität erkennen, obwohl die PITX2-Expression randomisiert war. Dagegen führte die Inhibition des asymmetrischen Ionenfluxes sowie der Apoptose im Primitivstreifen zu einer völligen Randomisierung der TBX18-Expression, sowie unter anderem der Entwicklung bilateraler Proepikardien. Die Induktion bilateraler TBX18-Expressionsdomänen war ebenfalls durch ektopisches FGF8 auf der linken Seite des Knotens zu beobachten. Der Verlust der rechtsseitigen FGF Signalgebung im Knoten resultierte in einem Verlust der rechtsseitigen TBX18-Expression im Sinus. Daraus kann geschlossen werden, dass proepikardiale Progenitoren nicht nur durch den asymmetrischen Ionenflux sowie Apoptose im Primitivstreifen in ihrer Lateralität festgelegt werden, sondern auch von rechtsseitigen FGF-Signalen im Knoten und unabhängig vom linkseitigen NODAL-PITX2-Signalweg lateralisiert werden.
Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab.
Mechanismen der Elektropermeabilisierung und Elektrofusion eukaryotischer Zellen und Protoplasten
(2008)
In dieser Arbeit konnten grundlegende Erkenntnisse über die Wirkung elektrischer Felder auf Membranen von eukaryotischen Zellen gewonnen werden. Dieses Wissen ermöglichte eine detaillierte Aufklärung der Mechanismen der Elektropermealisierung und der Elektrofusion. Maßgeblich hierfür war die dielektrische Analyse von Pflanzen- bzw. Hefeprotoplasten durch umfassende Messungen auf Basis der Elektrorotationsmethode. Mithilfe dieser Methode wurden die elektrischen Eigenschaften wie die flächenspezifische Membrankapazität und die innere Leitfähigkeit von Pichia pastoris Protoplasten ermittelt. Die Kenntnis dieser Zelleigenschaften verhalf dazu, einerseits das Sammelfeld im Hinblick auf seine Feldstärke und Frequenz einzustellen. Damit wurde ein optimaler Kontakt der Zellmembranen während der Fusion ermöglicht und störende Einflüsse, wie beispielsweise die Multizellrotation, minimiert. Anderseits wurde der Durchbruchpuls bezüglich der Pulslänge und der Feldstärke den Anforderungen für die Elektrofusion der relativ kleinen Protoplasten angepasst. In Folge dessen war es möglich, ein Protokoll zur Herstellung von Riesenzellen aus Pichia pastoris Protoplasten zu erstellen. Diese Erkenntnisse sind besonders interessant, da der Einsatz von Riesenzellen die Erforschung der aktiven elektrischen Eigenschaften von Zellmembranen durch kombinierte Anwendung intrazellulärer Mikroelektroden mit etablierten elektrophysiologischen Techniken ermöglicht. Als Beispiele seien hier „current-„ und „voltage-clamp“, „patch clamp“ sowie die Ladungspulsmethode genannt. Die erhebliche Vergrößerung der Membranoberfläche bei Riesenzellen führt zu einer Erhöhung der Gesamtzahl von Membranproteinen wie beispielsweise Transmembrankanäle. Daher kann erwartet werden, dass kanalvermittelte Signale deutlich stärker ausfallen und ihre Untersuchungen erleichtert werden. Die komplexen Ergebnisse der Elektrorotation von vakuolisierten BY-2 Protoplasten konnten sehr genau mit Hilfe des Dreischalenmodells erklärt werden, welches die Struktur der pflanzlichen Zellen, insbesondere die zwei seriell geschalteten Kapazitäten des Plasmalemmas und des Tonoplasten, berücksichtigt. Die Anwendung dieses Modells erlaubte eine getrennte Berechnung der Potentialprofile über das Plasmalemma (Up) und den Tonoplasten (Ut), welche durch einen kurzen Gleichstrompuls induziert wurden. Anhand dieser Potentialprofile war es möglich, die Abhängigkeit des Ca2+-Einstromes in das Cytoplasma aus der Vakuole oder dem extrazellulären Raum vom applizierten elektrischen Feld und der externen Leitfähigkeit zu erklären. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Aufladung des Plasmalemmas und des Tonoplasten und daraus folgend der elektrischen Membrandurchbruch der jeweiligen Membran stark von der externen Leitfähigkeit abhängen. Die Tatsache, dass elektrische Pulssequenzen von niedriger Intensität einen erhebliche Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bewirken können und sich durch Modulation ihrer Amplitude reizspezifische Ca2+-Signaturen simulieren lassen, eröffnet eine schonende Möglichkeit zur Untersuchung von Veränderungen des cytosolischen Ca2+-Spiegels unabhängig von persistierenden exogenen Stimuli. Da Ca2+ in Pflanzen ein wichtiger „second messenger“ ist, bieten sich elektrische Felder als neues wirksames Werkzeug zur Kontrolle zellinterne Signalwege für die Grundlagenforschung sowie für Anwendungen in der Biotechnologie, wie beispielsweise Elektrotransfektion und -fusion, an. Als wichtige Konsequenz kann aus den hier gewonnen Erkenntnissen gezogen werden, dass Behandlungen pflanzlicher Zellen mit elektrischen Feldern in niedrig leitende Medien durchgeführt werden, um eine minimale Freisetzung von Ca2+ und anderen Inhaltstoffen aus der Vakuole zu gewährleisten.