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- Division of Medical Technology and Science, Department of Medical Physics and Engineering, Course of Health Science, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita Japan (2)
- Institut for Molecular Biology and CMBI, Department of Genomics, Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Leopold-Franzens-University Innsbruck, Innsbruck, Austria (2)
- Johns Hopkins School of Medicine, The Russell H Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Baltimore, MD, USA (2)
- Naturalis Biodiversity Centre (2)
- Johns Hopkins School of Medicine (1)
- Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD, U.S. (1)
Auf der Suche nach Bindeproteinen des renalen HCO3-/Cl- Anionenaustauschers 1 (renAE1) wurde 1998 von Chen et al. in der Maus das Protein Kanadaptin entdeckt. Immunzytochemisch ließ sich Kanadaptin in der Niere des Kaninchens nur im Zytoplasma des Sammelrohrepithels nachgewiesen. In renAE1-exprimierenden, säuresezernierenden Schaltzellen (A-Schaltzellen) beobachtete man eine zusätzlich vesikuläre Immunfluoreszenz. Eine Immunfluoreszenz der basolateralen Membran, wie sie für renAE1 typisch ist, wurde nicht entdeckt. Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei den granulären Strukturen um renAE1-positive Vesikel handelte, wurde von Chen et al. postuliert, dass Kanadaptin am Transport von renAE1 zur basolateralen Plasmamembran säuresezernierender Schaltzellen beteiligt ist. Kanadaptin wurde wenige Jahre später in nicht renAE1-exprimierenden, kultivierten Zellen auch im Zellkern detektiert. Die nukleäre Translokation erfolgte abhängig von Importin a/b und von einer aminoterminalen Kernlokalisationssequenz (NLS). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Kanadaptin detailiert untersucht. In allen uns zur Verfügung stehenden humanen Zelllinien (z. B. U-373, SW-480 und Hep-G2, A-431, MCF-7, PC-3) wurde Kanadaptin sowohl auf Protein- als auch auf Transkriptionsebene (RT-PCR) nachgewiesen. In Mäuseembryonen wurde Kanadaptin im Western-Blot erstmals am 9. Embryonaltag detektiert. An gefriergetrockneten Epon-Semidünnschnitten der Rattenniere wurde bei immunzytochemischen Untersuchungen überraschenderweise eine besonders starke Immunreaktivität in epithelialen Zellen des proximalen Tubulus gefunden, nicht aber im Sammelrohrepithel, einschließlich der renAE1-exprimierenden A-Schaltzellen. In allen Kanadaptin-positiven Zellen war die Immunfluoreszenz von granulärer Struktur. Eine nukleäre Immunreaktion, wie sie für kultivierte Zellen beschrieben wurde, ließ sich nicht beobachten. Mit Hilfe eines gegen die Cytochromoxidase Untereinheit I gerichteten Antikörpers konnten die granulären Strukturen als Mitochondrien identifiziert werden. Durch Änderung der Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen konnte in kultivierten Zellen neben der nukleären Lokalisation Kanadaptin immunzytochemisch auch in Mitochondrien nachgewiesen werden. Immunelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten schließlich, dass Kanadaptin in Mitochondrien lokalisiert. Auch in Mitochondrien kultivierter Zellen und im Darmepithel der Ratte wurde Kanadaptin biochemisch nachgewiesen. Neben dem in verschiedenen Geweben/Zellen der Ratte und des Menschen detektierten Kanadaptin mit einem Molekulargewicht von 57 kD wurde aus retinsäure-behandelten menschlichen teratokarzinomen Hodenzellen (NT2/D1 Zellen) eine neue 89 kD-Isoform von Kanadaptin isoliert. Beide Kanadaptin-Isoformen sind stark homolog zueinander und besitzen eine fast identische Domänenstruktur. Gegenüber dem Kanadaptin der Maus enthält die menschliche Isoform jedoch eine aminoterminale Extension von 264 Aminosäuren sowie eine 25 Aminosäuren umfassende karboxyterminale Insertion. Innerhalb der aminoterminalen Extension konnte eine Gabelkopfdomäne (FHA-Domäne) identifiziert werden. FHA-Domänen sind phosphorylierungsabhängige Protein-Protein-Bindedomänen und finden sich hauptsächlich in nukleären Proteinen. Basierend auf diesen Erkenntnissen, lag der Fokus im zweiten Teil der Arbeit auf Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von humanem Kanadaptin, mit besonderer Berücksichtigung des FHA-Domänen-enthaltenen Aminoterminus. Hierzu wurde die humane Kanadaptin-cDNA aus retinsäurebehandelten NT2/D1-Zellen mit Hilfe der RT-PCR kloniert und in eukaryontische Expressionsvektoren inseriert. Subzelluläre Lokalisations-untersuchungen an transient transfektierten Zellen ergaben, dass die menschliche Isoform im Zellkern lokalisiert. Weitere Lokalisationsstudien zeigten, dass die nukleäre Akkumulation der Kanadaptin-Isoformen durch unterschiedliche NLSs reguliert wird. So zeigten frühere Untersuchungen, dass die Translokation vom Kanadaptin der Maus fast vollständig von der aminoterminalen NLS1 abhängig ist (Hübner et al., 2002). Im Gegensatz dazu war die nukleäre Lokalisation der humanen Kanadaptin-Isoform NLS1 unabhängig. Den größten Einfluß zeigte die karboxyterminale NLS2. Ein Grund dafür ist möglicherweise eine zusätzliche karboxyterminale Insertion, die die humane Kanadaptinisoform gegenüber dem Kanadaptin der Maus besitzt. Diese könnte dazu führen, dass die karboxyterminale NLS2 für die Kerntranslokationsmaschinerie besser zugänglich ist. Die Untersuchungen zeigten darüber hinaus, dass der FHA-Domäne enthaltene Aminoterminus möglicherweise an nukleäre Strukturen bindet.
Prolongierte Ischämieperioden des Herzens führen zu struktureller Schädigung der Kardiomyozyten, d.h. einer Desorganisation und Zerstörung des kontraktilen und plasmalemmalen Zytoskeletts, welche sich final durch Verlust an Kontraktilität und Ruptur der Plasmamembran manifestieren. Stressproteine können an die Komponenten des Zytoskelettes binden und durch Konformationsschutz der ischämischen Schädigung entgegenwirken. In vorangegangenen Untersuchungen wurde gezeigt, dass es unter Ischämie zu einer Translokation des konstitutiv in hoher Konzentration vorkommenden kardialen Stressproteins aB-Crystallin vom Zytosol an die Myofibrillen kommt. Dabei führen bereits kurzdauernde Ischämieperioden zu einer kompletten Umverteilung von aB-Crystallin in die Z/I-Region des Sarkomers. Es war das Ziel dieser Arbeit, diese Bindung von aB-Crystallin an Strukturproteine im Z/I-Banden Bereich näher zu charakterisieren und aB-Crystallin ultrastrukturell zu lokalisieren. Durch Immunogoldmarkierung konnte aB-Crystallin ultrastrukturell im Herzen unter globaler Ischämie in einer Linie parallel zur Z-Scheibe etwa in der Mitte der halben I-Bande lokalisiert werden. Diese Zone entspricht dem Bereich, der als N-Linie bezeichnet wird. In der Frage der in vivo-Bindungspartner von aB-Crystallin waren daher in erster Linie Komponenten der I-Bande, d.h. Aktin und Titin in Betracht zu ziehen. Z-Scheiben Proteine wie a-Actinin treten dagegen in den Hintergrund. Um Anhaltspunkte über die Bindungsstärke des Stressproteins aB-Crystallin an kardiale Myofibrillen unter Ischämie zu erhalten, wurden ischämische Myofibrillen aus dem Rattenherz mit hochmolaren Salzlösungen und chaotropen Substanzen behandelt. Dabei konnte eine sehr hohe Bindungsaffinität von aB-Crystallin an die Myofibrillen festgestellt werden. Die myofibrilläre Bindung zeigte sich resistent gegenüber 1M KCl, 1M NaSCN und 2M Harnstoff, erst 2M NaSCN und 4M Harnstoff, die eine Zerstörung der myofibrillären Integrität bewirken, vermögen die aB-Crystallin-Bindung zu lösen. Aktin dagegen ließ sich bereits durch 0,5M NaSCN-Lösung von den Myofibrillen extrahieren, Bedingungen, unter denen aB-Crystallin noch fest an die Myofibrillen gebunden blieb. Aktin scheidet somit als in vivo-Bindungspartner von aB-Crystallin aus. Dieses Ergebnis immunhistochemischer Untersuchungen konnte auch mit biochemischer Methodik (Immunreplikanalyse) verifiziert werden. Titin zeigte sich wie aB-Crystallin resistent gegenüber den meisten der oben aufgeführten Salzlösungen. Eine deutliche Extraktion von Titin aus den Myofibrillen konnte erst durch Behandlung mit 2M NaSCN sowie 4M Harnstofflösung beobachtet werden, das Extraktionsverhalten entsprach somit dem von aB-Crystallin. Einen Hinweis auf eine Assoziation von aB-Crystallin mit Titin lieferte der Nachweis von aB-Crystallin in isolierten Titinfraktionen aus ischämischen Herzen. Der direkte Beweis für eine aB-Crystallin-Titin-Interaktion konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht erbracht werden. Bindungsstudien, die zwischen ausgewählten nativen, in vitro translatierten Titindomänen und aus der Linse isoliertem aB-Crystallin durchgeführt wurden, waren negativ. Dies ist möglicherweise dadurch bedingt, dass aB-Crystallin erst unter Ischämie mit Titin interagiert und in vitro Kofaktoren benötigt werden. Durch eine Bindung an I-Banden Abschnitte des Titinmoleküls könnte aB-Crystallin eine kardioprotektive Funktion erfüllen, indem es unter Ischämie stabilisierend auf das Filamentsystem einwirkt.
Die hochaffine Glutamataufnahme in Neurone und Gliazellen des ZNS, die von unterschiedlichen Transportern vermittelt wird, spielt eine wichtige Rolle für die Entfernung des Neurotransmitters Glutamat aus dem Extrazellularraum. Die Glutamataufnahme ist notwendig, um das Transmittersignal zu beenden und eine rezeptorvermittelte Übererregung von Neuronen zu verhindern (siehe Kanai et al., 1993). In den vergangenen Jahren wurden die cDNAs von fünf unterschiedlichen Subtypen von Glutamattransportern kloniert: GLT1 oder EAAT2 (Pines et al., 1992), GLAST oder EAAT1 (Storck et al., 1992), EAAC1 oder EAAT3 (Kanai & Hedinger, 1992), EAAT4 (Fairman et al., 1995) und EAAT5 (Arriza et al., 1997). GLT1, GLAST und EAAC1 werden im gesamten ZNS exprimiert (Kanai & Hedinger, 1992; Pines et al., 1992; Storck et al., 1992; Rothstein et al., 1994; Torp et al., 1994, 1997; Chaudry et al., 1995; Lehre et al., 1995; Schmitt et al., 1996, 1997; Velaz-Faircloth et al., 1996; Berger & Hediger, 1998). EAAT4 bzw. EAAT5 scheinen jedoch vorwiegend auf das Kleinhirn (Fairman et al., 1995; Furuta et al., 1997; Dehnes et al., 1998) bzw. die Retina (Arriza et al., 1997) beschränkt zu sein. In vivo antisense Methoden zeigten, dass vor allem die Glutamattransporter GLT1 (Glutamattransporter 1) und GLAST (Glutamat/Aspartat-Transporter) für die Niedrighaltung der extrazellulären Glutamat-Konzentrationenen zuständig sind (Rothstein et al., 1996). Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch Untersuchungen an Mäusen, bei denen GLT1 gentechnisch ausgeschaltet wurde. Diese Tiere weisen erhöhte Glutamatkonzentrationen im Gehirn, tödliche Krampfanfälle und neuronale Degeneration im Hippocampus (CA1) auf (Tanaka et al., 1997). Untersuchungen über die zelluläre Expression von GLT1 und GLAST bei adulten Tieren zeigten, dass beide Transporter fast ausschließlich in Astrozyten und Bergmanngliazellen lokalisiert sind (GLT1: Danbolt et al., 1992; Levy et al., 1993; Rothstein et al., 1994; Lehre et al., 1995; Schmitt et al., 1996; Milton et al., 1997; GLAST: Lehre et al., 1995; Chaudry et al., 1995; Schmitt et al., 1997). Studien über die regionale Verteilung von GLT1 und GLAST im ZNS der Ratte ergaben, dass beide Transporter stark im Hippocampus exprimiert werden. Die Transporterproteine sind hier vor allem in Astrozyten von Stratum lacunosum-moleculare des Ammonshorns (CA) und Stratum moleculare des Gyrus dentatus lokalisiert (Schmitt et al., 1996, 1997). In diesen Schichten endet der glutamaterge Tractus perforans (Ottersen & Storm-Mathisen, 1989) (Abb. 1). Dieser entspringt im entorhinalen Cortex und gelangt von dort zum ipsilateralen Hippocampus (bis zu 95% der Fasern) (Raisman et al., 1965; Nafstad, 1967; Hjorth-Simonsen & Jeune, 1972; Scheff, 1989). In den äußeren zwei Dritteln des Stratum moleculare des Gyrus dentatus werden 85-90% aller Synapsen von den Fasern des Tractus perforans gebildet (Scheff, 1989). Aus diesem Grund kann diese Region als überwiegend glutamaterges Terminationsfeld angesehen werden.
Glutamat spielt in der Entwicklung des ZNS eine besondere Rolle (z.B. Steuerung der Migration von Proneuronen, Einfluß auf die Ausbildung von Synapsen und Differenzierung von Pyramidenzelldendriten und Proliferation glialer Vorläuferzellen). Durch Regulation der extrazellulären Glutamatkonzentration kommt den Glutamattransportern dabei eine besondere Bedeutung zu. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, die postnatale zelluläre und regionale Expression der Glutamattransporter GLT1 und GLAST im Hippocampus der Ratte zu untersuchen, um Rückschlüsse auf ihre Funktion während der postnatalen Ontogenese (Postnataltag 1-60, P1-60) zu ziehen. Dazu wurde nichtradioaktive In-situ-Hybridisierung (ISH) mit Digoxigenin-markierten cRNA-Sonden eingesetzt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass beide Transporter vor allem in Gliazellen (besonders Astroblasten/Astrozyten) nachweisbar sind und dass die Expression von GLT1 und GLAST während der Ontogenese der Ratte im Hippocampus unterschiedlich erfolgt. Aus unseren Ergebnissen kann geschlossen werden, dass GLAST und GLT1 eine unterschiedliche Bedeutung während der Ausbildung der hippocampalen Verbindungen haben dürften. Der trisynaptische hippocampale Verbindungsweg entwickelt sich hauptsächlich in der ersten postnatalen Woche. Während dieser Zeit verlagert sich die exzitatorische Funktion in Hippocampusneuronen von GABA auf Glutamat. Diese Transmitterumstellung korreliert zeitlich mit der deutlichen Zunahme der GLT1-Expression im Hippocampus, was auf eine entscheidende Rolle von GLT1 bei der Bildung hippocampaler Verbindungen durch Regulation der extrazellulären Glutamatkonzentration hinweist. Demgegenüber ist kein offensichtlicher Zusammenhang zwischen GLAST-Expression und Transmitterumstellung zu erkennen. Wie in adulten Stadien kommt dem Transporter unter physiologischen Bedingungen auch in der Ontogenese wohl vor allem eine Reservefunktion zu.
Die Barriereeigenschaften des Gefäßendothels werden durch Verschluß- und Adhärenskontakte vermittelt. Das Ca2+-abhängige Zelladhäsionsmolekül VE-Cadherin vermittelt in Adhärenskontakten die Adhäsion benachbarter Endothelzellen. Es wurde vermutet, daß die extrazelluläre Ca2+-Konzentration und das intrazelluläre Aktinfilamentsystem die Adhäsionseigenschaften von VE-Cadherin verändern können. Daher wurden diese Einflußfaktoren mit Hilfe der Laserpinzetten-Technik untersucht. Hierzu wurden Latex-Mikroperlen mit rekombinanten VE-Cadherin-Fc-Molekülen beschichtet, die damit an VE-Cadherin-Moleküle von Endothelzellen binden und Zell-Zell-Kontakte simulieren konnten. Es zeigte sich, daß die ausschließlich durch VE-Cadherin vermittelte Interaktion zwischen Mikroperlen und Endothelzellen direkt von der extrazellulären Ca2+-Konzentration abhängig war und sich durch eine s-förmige Titrationskurve beschreiben ließ: Die Bindungshäufigkeit der Mikroperlen war bei Ca2+-Konzentrationen nahe 0,0 mM gering (26-27 %), nahm ab 0,8 mM stark zu (38 %) und erreichte bei 1,8 mM ein Maximum (65 %). Halbmaximale Bindung (KD) wurde bei 1,1 mM Ca2+ erreicht. Die Bindung war hochkooperativ (Hill Koeffizient nH = 4,6). Um die Eigenschaften des Aktinfilamentsystems zu verändern, wurden die Zellen mit Cytochalasin B, Cytochalasin D und dem Ca2+-Ionophor A 23187 inkubiert. Dabei nahm die Bindungshäufigkeit der Mikroperlen deutlich gegenüber Kontrollbedingungen ab. Es wurde gefolgert, daß ein intaktes Aktinfilamentsystem unmittelbar die Interaktion zwischen VE-Cadherin-Molekülen stärkte. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern damit neue Erkenntnisse über die Eigenschaften von VE-Cadherin: Die Adhäsion dieses Moleküls wird im physiologischen Ca2+-Bereich reguliert und ist direkt von einem intakten Aktinfilamentsystem abhängig. Es ist vorstellbar, daß die durch VE-Cadherin vermittelten Barriereeigenschaften des Endothels in vivo durch ähnliche Mechanismen reguliert werden. Ein Abfall der Ca2+-Konzentration im Interzellularspalt unter den für die Adhäsion kritischen Wert von 1,1 mM könnte durch Agonist-vermittelte Öffnung von Ca2+-Kanälen erfolgen. Eingeströmtes Ca2+ könnte seinerseits über Aktivierung von Gelsolin zur Fragmentation von Aktinfilamenten führen und so die Adhäsion weiter schwächen.
Der plasmamembran assoziierte Transportregulator RS1 bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern
(2001)
Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembran-transportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLC-PK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus nicht gestört. Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain (UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin mehr feststellbar. Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten. Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des SGLT1 beteiligt ist.
Die den Zellstoffwechsel und das Zytoskelett betreffenden Adaptationsvorgänge in Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung sind von besonderem klinischen Interesse, da Gefäßwandschäden eine entscheidende pathogenetische Relevanz bei der Entstehung vaskulärer Erkrankungen wie z.B. der Arteriosklerose zukommt. Der intrazelluläre Signalweg, über den die Zelle einen rheologischen Reiz in eine entsprechende Zellantwort umsetzt, ist bisher weitgehend ungeklärt geblieben, wobei eine Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration als Signalgeber diskutiert wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen Messplatz zu etablieren, der es gestattet, Veränderungen in der zytosolischen Calciumkonzentration in kultivierten Endothelzellen nach Applikation von Ca2+-erhöhenden Agonisten, Calciumionophoren sowie während rheologischer Beanspruchung in Echtzeit zu dokumentieren. Die Eignung des verwendeten rheologischen Systems für Scherstressexperimente konnte durch die Beobachtung der für Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung typischen zytoskelettalen Umbauvorgänge im Sinne einer Neuordnung der Aktinfilamente mit der Ausbildung von Stressfasern gezeigt werden. Erstmalig konnte dabei auch die Reaktion mikrovaskulärer Endothelzellen der MyEnd-Zelllinie der Maus auf Scherstressbeanspruchung gesehen werden. Bei diesen Zellen konnte eine Vermehrung des F-Aktin-Gehaltes beobachtet werden, im Gegensatz zu kultivierten Endothelzellen des Truncus pulmonalis des Hausschweins blieb aber eine signifikante Bildung von Stressfasern aus. Diese unterschiedliche Verhalten ist wahrscheinlich der andersartigen Zellmorphologie der MyEnd-Zellen zuzuschreiben. Es konnte in zwei verschiedenen Endothelzellsystemen gezeigt werden, daß Gefäßendothelzellen den Kontakt mit verschiedenen endogenen Stimuli bzw. Calciumionophoren mit einer zytosolischen Calciumerhöhung unterschiedlichen Ausmaßes beantworten. Bei einsetzendem oder sich verstärkenden Flüssigkeitsscherstress konnte von uns hingegen keine Calciumantwort beobachtet werden. An der Induktion zytoskelettaler Umbauvorgänge scheint Calcium als Botenstoff in den hier untersuchten Zellsystemen also nicht primär beteiligt zu sein
Das Endothel verfügt im wesentlichen über drei dynamische Funktionseinheiten zur Migration und Zellkontaktbildung: Ein intrazelluläres Gerüst, bestehend einerseits aus den sogenannten Stressfasern, welche die Zelle durchziehen und vornehmlich an Zell-Zell-Kontakten und Zell-Matrix-Kontakten anhaften und so der Zelle Stabilität geben, und andererseits aus kontraktilen Aktin-Myosinbündeln, welche die Zelle befähigen, sich fortzubewegen oder ihre Form zu ändern, beispielsweise Ausläufer zu bilden. Zell-Zell-Kontakte, die es den Zellen ermöglichen, fest aneinander zu haften und sich so einerseits gegenseitig zu stützen und andererseits eine regulierbare Barriere zwischen intravasalem Raum und Interstitium zu bilden. Zell-Matrix-Kontakte, welche die Zelle fest mit dem Untergrund verankern und ein Unterspülen der Zelle verhindern. Besonders während der Migration der Endothelzelle unterliegen diese Systeme ständigem Auf- und Abbau. Diese Funktionseinheiten werden durch Rho-Proteine reguliert. Man unterscheidet drei wichtige Vertreter dieser Gruppe: Rac, CDC42 und RhoA. Es wurde die Prenylierung von Proteinen und damit auch die Prenylierung von Rho-Proteinen durch den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Lovastatin unterdrückt. In einer zweiten Versuchsserie wurden alle Rho-Proteine unselektiv durch Toxin-B, einem Toxin aus Clostridium difficile, und anschließend selektiv RhoA durch C3-Toxin aus Clostridium botulinum inaktiviert. Es wurden die Effekte auf Primärkulturen von Endothelzellen aus dem Truncus pulmonalis des Schweins, besonders im Hinblick auf Migration, Stressfasersystem, Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte, mit Hilfe immuncytochemischer Methoden beobachtet. Es konnte gezeigt werden, daß die Rho-Proteine wesentlich für die Bildung von Zellausläufern, wie zum Beispiel Lamellopodien, und die Migration in Endothelzellen sind. Zudem konnte belegt werden, daß Aufbau und Aufrechterhaltung des Aktinfilamentsystems und des kontraktilen Apparates der Endothelzellen im wesentlichen über das geranylierte RhoA reguliert werden. Die Effekte der unselektiven Rho-Protein-Hemmung unterschieden sich hier kaum von denen der selektiven RhoA-Hemmung. Auch die Unterdrückung der Geranyl-Prenylierung zeigte vergleichbare Ergebnisse. Die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Kontakte ist allerdings RhoA-unabhängig, da es trotz selektiver RhoA-Hemmung durch C3-Toxin nicht zur Auflösung der Zell-Zell-Kontakte kam. Diese werden vielmehr über Rac und/oder CDC42 gesteuert, denn erst durch die Blockierung aller Rho-Proteine durch Toxin-B kam es zur Lückenbildung zwischen den Zellen. Auch hier spielt die Geranylierung der Rho-Proteine eine wichtige Rolle, da die Geranylierungshemmung ähnliche Effekte wie die Hemmung durch Toxin-B zeigte. Die Ausbildung und Aufrechterhaltung der Fokalkontakte erfolgt im wesentlichen auch über die geranylierten Rho-Proteine, wobei RhoA hier die entscheidende Rolle zuzukommen scheint. Somit konnte in dieser Arbeit die entscheidende Rolle der Rho-Proteine und im speziellen die des RhoA-Proteins bei der Regulation wesentlicher Funktionseinheiten der Endothelzelle aufgezeigt werden.
Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden.